Name: Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę fermentacji kontrolowanej światłem niebieskim w celu zwiększenia produkcji chemikaliów i białek mikrobiologicznych. Protokół ten umożliwia precyzyjną regulację metabolizmu drożdży Saccharomyces cerevisiae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych Nagroda Numer DE-SC0019363, Nagroda NSF CAREER CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts, oraz Camille Dreyfus Teacher-Scholar Award.

<ol><li>Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+and+shine+of+yeast+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">The rise and shine of yeast optogenetics.</a> Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).</li>
<li>Pouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+for+bioproduction%3A+Dynamic+control+strategies+and+scale-up+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments.</a> Bioengineering. 7 (4), 151(2020).</li>
<li>Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. R., Mahadevan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+metabolism+through+dynamic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering metabolism through dynamic control.</a> Current Opinion in Biotechnology. 34, 142-152 (2015).</li>
<li>Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+future+modalities+of+dynamic+control+in+metabolic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+rapid+optogenetic+circuits+for+dynamic+control+in+yeast+metabolic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).</li>
<li>Lalwani, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+the+lac+operon+for+bacterial+chemical+and+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production.</a> Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+regulation+of+engineered+cellular+metabolism+for+microbial+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production.</a> Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).</li>
<li>Baumschlager, A., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biological+approaches+for+optogenetics+and+tools+for+transcriptional+light-control+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria.</a> Advanced Biology. 5 (5), 2000256(2021).</li>
<li>Dvorak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbation+of+substrate+toxicity+by+IPTG+in+Escherichia+coli+BL21%28DE3%29+carrying+a+synthetic+metabolic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway.</a> Microbial Cell Factories. 14, 201(2015).</li>
<li>Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+in+metabolic+engineering%3A+Theories%2C+tools%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications.</a> Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).</li>
<li>Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Chemical+and+Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">Dynamic control of metabolism.</a> Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 12, 519-560 (2021).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+amplification+circuits+for+light-induced+metabolic+control%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).</li>
<li>Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neurospora+crassa+Inducible+Q+System+Enables+Simultaneous+Optogenetic+Amplification+and+Inversion+in+Saccharomyces+cerevisiae+for+Bidirectional+Control+of+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).</li>
<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Marx, H., Mecklenbräuker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+gene+copy+number+amplification+in+Pichia+pastoris+by+vector+integration+into+the+ribosomal+DNA+locus%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus.</a> FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).</li>
<li>Nordén, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+dosage+greatly+enhances+recombinant+expression+of+aquaporins+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris.</a> BMC Biotechnology. 11, 47(2011).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+control+of+metabolic+flux+through+assembly+of+synthetic+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles.</a> Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).</li>
<li>Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li>
<li>Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microbes+to+synthesize+plant+isoprenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids.</a> Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).</li>
<li>Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+tac+promoter+and+lacI%28q%29+for+the+controlled+expression+of+Zymomonas+mobilis+fermentative+genes+in+Escherichia+coli+and+Zymomonas+mobilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis.</a> Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).</li>
<li>Steen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae+for+the+production+of+n-butanol%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol.</a> Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).</li>
<li>Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+central+carbon+metabolism+for+improved+pathway+yields+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).</li>
<li>Jayaraman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-mediated+transcriptional+activation+and+repression+of+gene+expression+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria.</a> Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994(2016).</li>
<li>Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RGB+color+vision+into+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineering RGB color vision into Escherichia coli.</a> Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-powered+Escherichia+coli+cell+division+for+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).</li>
<li>Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-inducible+flux+control+of+triosephosphate+isomerase+on+glycolysis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).</li>
<li>Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+synechocystis+PCC6803+UirS-UirR+as+a+UV-violet%2Fgreen+photoreversible+transcriptional+regulatory+tool+in+E.+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).</li>
<li>Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichromatic+control+of+gene+expression+in+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multichromatic control of gene expression in escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).</li>
<li>Stewart, C. J., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+an+automated+illuminating%2C+culturing%2C+and+sampling+system+for+microbial+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894(2017).</li>
<li>Grødem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+calibration+of+optoPlate+LEDs+to+reduce+light+dose+variation+in+optogenetic+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments.</a> BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).</li>
<li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li>
<li>Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+characterisation+and+manipulation+of+biological+systems+with+Chi.Bio%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio.</a> PLoS Biology. 18 (7), (2020).</li>
<li>Carrasco-López, C., García-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+and+biosensors+set+the+stage+for+metabolic+cybergenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).</li>
<li>Melendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%3A+Quantitative+Biosciences+From+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).</li>
<li>Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+Bacillus+subtilis+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Xia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+modification+of+pseudomonas+aeruginosa+enables+controllable+twitching+motility+and+host+infection%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).</li>
<li>Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+manipulation+enables+prevention+of+biofilm+formation+of+engineered+pseudomonas+aeruginosa+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).</li>
</ol>

Autorzy złożyli wnioski patentowe na obwody i metody optogenetyczne opisane w niniejszym artykule.

Kontrola dynamiczna jest od dawna stosowana w celu poprawy wydajności inżynierii metabolicznej i produkcji białek rekombinowanych4. Zmiany w ekspresji enzymatycznej są najczęściej realizowane za pomocą induktorów chemicznych, takich jak IPTG21, galaktoza22 i tetracyklina23, ale są również pośredniczone przy użyciu warunków procesu, takich jak temperatura i pH. Optogenetyczna kontrola ekspresji genów eliminuje potrzebę zmian pa...

Optogenetyka, polegająca na kontrolowaniu procesów biologicznych za pomocą białek reagujących na światło, oferuje nową strategię dynamicznego sterowania fermentacjami mikrobowymi w celu produkcji substancji chemicznych i białek1,2. Obciążenie wynikające z zastosowania zmodyfikowanych szlaków metabolicznych oraz toksyczność niektórych produktów pośrednich i końcowych często upośledzają wzrost komórek3. Takie stresy mogą prowadzić do słabej akumulacji biomasy i zmniejszonej wydajności3. Wyzwanie to można rozwiązać poprzez czasowy podział fermentacji na fazę wzrostu i fazę produkcji, które odpowiednio poświęcają zasoby metaboliczne na akumulację biomasy lub syntezę produktu4. Niedawno wykazaliśmy, że przejście z fazy wzrostu do fazy produkcji w tej dwufazowej fermentacji może być indukowane zmianami warunków oświetlenia5,6,7. Wysoka regulowalność, odwracalność i ortogonalność bodźców świetlnych8 oferują unikalne zalety w fermentacjach sterowanych światłem, których trudno lub nie da się odtworzyć przy użyciu induktorów chemicznych stosowanych w dynamicznym sterowaniu konwencjonalnymi fermentacjami dwufazowymi4,9,10,11.
Białko EL222 reagujące na światło niebieskie, pochodzące z Erythrobacter litoralis, zostało wykorzystane do opracowania kilku obwodów optogenetycznych dla inżynierii metabolicznej w Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 zawiera domenę sensora światło-tlen-napięcie (LOV), która pod wpływem aktywacji światłem niebieskim (465 nm) ulega zmianie konformacyjnej, co umożliwia wiązanie się białka z jego kognatywną sekwencją DNA (C120)13. Połączenie EL222 z wirusową domeną aktywacyjną VP16 (VP16-EL222) pozwala na uzyskanie czynnika transkrypcyjnego reagującego na światło niebieskie, który może odwracalnie aktywować ekspresję genów w S. cerevisiae7 i innych organizmach14 z syntetycznego promotora PC120. Opracowano i wykorzystano kilka obwodów opartych na EL222 do produkcji substancji chemicznych w S. cerevisiae, takich jak podstawowy system OptoEXP aktywowany światłem7, w którym geny zainteresowania są bezpośrednio eksprimowane z PC120 (Ryc. 1A). Jednakże obawy dotyczące penetracji światła przy wysokich gęstościach komórek, typowych dla fazy produkcji w fermentacjach, skłoniły nas do opracowania odwróconych obwodów indukowanych w ciemności, takich jak obwody OptoINVRT i OptoQ-INVRT (Ryc. 1B)5,7,13. Systemy te wykorzystują regulony galaktozy (GAL) lub kwasu chinowego (Q) odpowiednio z S. cerevisiae i N. crassa, kontrolując ich odpowiadające represory (GAL80 i QS) za pomocą VP16-EL222, aby represować ekspresję genów w świetle i silnie indukować ją w ciemności. Połączenie obwodów OptoEXP i OptoINVRT pozwala na dwukierunkową kontrolę ekspresji genów, umożliwiając prowadzenie fermentacji dwufazowych, w których faza wzrostu jest indukowana światłem niebieskim, a faza produkcji ciemnością (Ryc. 2A)5,7.
Wykorzystanie światła zamiast ciemności do indukcji ekspresji genów podczas fazy produkcji znacznie poszerzyłoby możliwości kontroli optogenetycznej, ale wymagałoby również pokonania ograniczeń w przenikaniu światła przy wysokich gęstościach komórek, typowych dla tej fazy fermentacji. W tym celu opracowaliśmy obwody, znane jako OptoAMP i OptoQ-AMP, które wzmacniają odpowiedź transkrypcyjną na stymulację światłem niebieskim. Obwody te wykorzystują mutanty typu dzikiego lub nadwrażliwe VP16-EL222 do kontrolowania produkcji aktywatorów transkrypcyjnych Gal4p lub QF2 odpowiednio regulonów GAL lub Q, co pozwala na uzyskanie zwiększonej wrażliwości i silniejszej ekspresji genów pod wpływem światła12,13 (Rysunek 1C). Obwody OptoAMP mogą zapewnić pełną i jednorodną indukcję światłem w bioreaktorach o pojemności 5 L przy wartościach gęstości optycznej (mierzonej przy 600 nm; OD600) wynoszących co najmniej 40, przy oświetleniu wynoszącym zaledwie ~0,35% (dawka światła 5% na tylko ~7% całkowitej powierzchni). Wykazuje to wyższy stopień wrażliwości w porównaniu do OptoEXP, który wymaga oświetlenia bliskiego 100%12. Zdolność do skutecznej indukcji ekspresji genów za pomocą światła przy wysokich gęstościach komórek otwiera nowe możliwości dynamicznego sterowania fermentacją. Obejmuje to prowadzenie fermentacji w więcej niż dwóch fazach czasowych, na przykład w fermentacjach trójfazowych, w których fazy wzrostu, indukcji i produkcji są ustanawiane według unikalnych harmonogramów oświetlenia w celu optymalizacji produkcji chemicznej (Rysunek 2B)12.
<img alt="Schemat ekspresji genów; System indukowany światłem; Ścieżki białek GFP i Gal; proces eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Obwody optogenetyczne do dynamicznej kontroli S. cerevisiae. Obwody OptoEXP, OptoINVRT i OptoAMP opierają się na światłoczułym systemie VP16-EL222. (A) W obwodzie OptoEXP ekspozycja na światło niebieskie powoduje zmianę konformacyjną i dimeryzację VP16-EL222, co odsłania domenę wiążącą DNA i umożliwia transkrypcję z PC120. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Zhao i wsp.7. (B) Obwody OptoINVRT wykorzystują regulony GAL (pokazane) lub Q do indukcji ekspresji w ciemności. W obwodach opartych na GAL, VP16-EL222 i GAL4 są wyrażane konstytutywnie, podczas gdy PC120 steruje ekspresją represora GAL80 (w obwodach opartych na Q, GAL4 i GAL80 zastąpiono odpowiednio QF2 i QS, a zamiast promotora GAL użyto syntetycznego promotora zawierającego sekwencję QUAS). W świetle białko Gal80p zapobiega aktywacji genu zainteresowania z PGAL1. W ciemności GAL80 nie jest wyrażany i ulega szybkiej degradacji dzięki połączeniu go z konstytutywną domeną degronu (mała brązowa domena), co umożliwia aktywację PGAL1 przez Gal4p. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Zhao i wsp.5. (C) Obwody OptoAMP również wykorzystują VP16-EL222 do kontroli regulonów GAL (pokazanych) lub Q. W tych obwodach represor GAL80 (lub QS) jest wyrażany konstytutywnie i połączony z fotoczułym degronem (mała niebieska domena), co zapewnia silną represję w ciemności. PC120 i nadwrażliwy mutant VP16-EL222 kontrolują ekspresję GAL4 (lub QF2) za pomocą światła, co silnie aktywuje PGAL1 (lub promotor zawierający QUAS) w świetle. Obwody pochodne od GAL mogą wykorzystywać zmodyfikowane formy PGAL1, takie jak PGAL1-M lub PGAL1-S, które wykazują zwiększoną aktywność, a także promotory typu dzikiego kontrolowane przez regulon GAL (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Zhao i wsp.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wzrost bakterii i produkcja GFP w czasie; OD600 w funkcji czasu; dwufazowe wykresy krzywych; badania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2: Fermentacje dwu- i trójfazowe w czasie. (A) Fermentacje dwufazowe prowadzone w układach odwróconych składają się z fazy wzrostu napędzanej światłem oraz ciemnej fazy produkcji. W fazie wzrostu następuje akumulacja biomasy, podczas gdy szlak produkcji pozostaje stłumiony. Po osiągnięciu pożądanej wartości OD600, komórki są przenoszone do ciemności w celu adaptacji metabolicznej przed resuspensją w świeżej pożywce na potrzeby fazy produkcji. (B) W procesie trójfazowym fazy wzrostu, inkubacji i produkcji są zdefiniowane przez unikalne harmonogramy oświetlenia, które mogą składać się z ciemnego okresu wzrostu, pulsacyjnej inkubacji oraz w pełni oświetlonej fazy produkcji. Rysunek stworzony za pomocą Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Obwody optogenetyczne opracowano również w celu dynamicznej kontroli produkcji związków chemicznych i białek w E. coli. Obwody OptoLAC kontrolują bakteryjny represor LacI za pomocą światłoczułego obwodu pDawn, który opiera się na dwuskładnikowym systemie YF1/FixJ6 (Rysunek 3). Podobnie jak w przypadku OptoINVRT5, obwody OptoLAC są zaprojektowane tak, aby represować ekspresję genów w świetle i indukować ją w ciemności. Poziomy ekspresji uzyskiwane za pomocą obwodów OptoLAC mogą być porównywalne lub wyższe niż te osiągane przy standardowej indukcji izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG), co pozwala zachować siłę indukcji chemicznej przy jednoczesnym zapewnieniu lepszej regulacji i odwracalności6. W związku z tym obwody OptoLAC umożliwiają skuteczną kontrolę optogenetyczną w inżynierii metabolicznej E. coli.
<img alt="Aktywność netto kinazy względem fosfatazy; schemat regulacji ekspresji genów; wysoka/niska ekspresja w ciemności/świetle." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obwody OptoLAC do dynamicznej kontroli E. coli. Obwody OptoLAC adaptują system pDawn oraz operon lac, aby uzyskać aktywację w ciemności i represję w świetle. W ciemności YF1 fosforyluje FixJ, który następnie aktywuje promotor PFixK2 do ekspresji represora cI. Represor cI zapobiega ekspresji represora lacI z promotora PR, co umożliwia transkrypcję genu zainteresowania z promotora zawierającego lacO. I odwrotnie, niebieskie światło zmniejsza aktywność netto kinazy YF1, odwracając fosforylację FixJ i tym samym ekspresję cI, co znosi represję ekspresji lacI i zapobiega ekspresji z promotora zawierającego lacO. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Lalwani i wsp.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Opisujemy tutaj podstawowe protokoły sterowanych światłem fermentacji S. cerevisiae oraz E. coli w celu produkcji związków chemicznych lub białek. W przypadku drożdży i bakterii skupiamy się najpierw na fermentacjach z fazą wzrostu sterowaną światłem oraz fazą produkcji indukowaną ciemnością, możliwą dzięki obwodom OptoINVRT i OptoLAC. Następnie opisujemy protokół trójfazowej (wzrost, indukcja, produkcja) fermentacji sterowanej światłem, możliwej dzięki obwodom OptoAMP. Ponadto opisujemy sposób skalowania optogenetycznie sterowanych fermentacji z mikropłytek do bioreaktorów w skali laboratoryjnej. Za pomocą tego protokołu dążymy do zapewnienia kompletnego i łatwego do powtórzenia przewodnika po przeprowadzaniu sterowanych światłem fermentacji w celu produkcji związków chemicznych lub białek.

<table><tbody><tr><td>Kontrolowana światłem produkcja chemiczna przy użyciu S. cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well culture plate</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>Agar w proszku</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>303991049</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Reynolds</td><td>B004NG90YO</td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer z &mu; Kuweta</td><td>Eppendorf</td><td>6135000923</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski panel LED</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td></td></tr><tr><td>EZ-L439 OptoINVRT7 Plazmid</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie</td><td>dotyczy Patrz Referencja 1</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>501879892 (G8270-5KG)</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>Probówki</td> <td>do mikrowirówekUSA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Yamato Scientific America</td><td>SOU-300</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Celltreat</td><td>229656</td><td></td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0560L</td><td></td></tr><tr><td>Miernik kwantowy</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>Replika urządzenia do galwanizacji</td><td>Thomas Scientific</td><td>F37848-0000</td><td></td></tr><tr><td>Repliki podkładek galwanicznych</td><td>Sunrise Science Products</td><td>3005-012</td><td></td></tr><tr><td>SC-His w proszku</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1303-030</td><td></td></tr><tr><td>SC Kompletny proszek</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1459-100</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna folia uszczelniająca</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-SEAL-PLT</td><td></td></tr><tr><td>Płytki agarowe YPD</td><td>VWR</td><td>100217-054</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td>Kontrolowana światłem produkcja białka przy użyciu E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6X SDS Sample Buffer</td><td>Cepham Life Sciences</td><td>10502</td><td></td></tr><tr><td>12% żele białkowe z akryloamidu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0341BOX</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka hodowlana</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Reynolds</td><td>B004NG90YO</td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer z &mu; kuweta</td><td>Eppendorf</td><td>6135000923</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski panel LED</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20279</td><td></td></tr><tr><td>Komórka do elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz do elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion (Miller)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BP97235</tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thomas Scientific</td><td>SX0425-1</td><td></td></tr><tr><td>Plazmidy OptoLAC</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Patrz odniesienie 2</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Yamato Scientific America</td><td>SOU-300</td><td></td></tr> szalka <tr><td>Petriego</td><td>Celltreat</td><td>229656</td><td></td></tr><tr><td>Miernik kwantowy</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Fermentacja trójfazowa przy użyciu S. cerevisiae</td>Te same materiały, <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>co protokół "Produkcja chemiczna kontrolowana światłem przy użyciu S. cerevisiae" oraz następujące:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-L580 OptoAMP4 Plazmid</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Patrz odniesienie 10</td></tr><tr><td>Produkcja chemiczna w bioreaktorze sterowanym światłem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Reynolds</td><td>B004NG90YO</td><td></td></tr><tr><td>Bioreaktor przeciwpieniący</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8311</td><td></td></tr><tr><td>ze stacją kontrolną</td><td>Eppendorf</td><td>B120110001</td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer z &mu; kuweta</td><td>Eppendorf</td><td>6135000923</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>VWR Scientific</td><td>89501-620 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski panel LED</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td></td></tr><tr><td>rurka BPT</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-15</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>501879892 (G8270-5KG)</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>M9 Sole minimalne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1374401</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór NH4OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0503-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Yamato Scientific America</td><td>SOU-300</td><td></td></tr><tr><td>Miernik kwantowy</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>SC Kompletny proszek</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1459-100</td><td></td></tr></tbody></table>

fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Fabryki komórek mikrobiologicznych oferują zrównoważoną alternatywę dla produkcji chemikaliów i rekombinowanych białek z odnawialnych surowców. Jednak przeciążenie mikroorganizmu modyfikacjami genetycznymi może zmniejszyć sprawność i produktywność gospodarza. Problem ten można przezwyciężyć za pomocą kontroli dynamicznej: indukowalnej ekspresji enzymów i szlaków, zwykle przy użyciu dodatków chemicznych lub odżywczych, w celu zrównoważenia wzrostu i produkcji komórek. Optogenetyka oferuje nieinwazyjną, wysoce przestrajalną i odwracalną metodę dynamicznej regulacji ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy, jak skonfigurować kontrolowane światłem fermentacje zmodyfikowanych Escherichia coli i Saccharomyces cerevisiae do produkcji chemikaliów lub rekombinowanych białek. Omawiamy, jak stosować światło w wybranych momentach i dawkach, aby rozdzielić wzrost i produkcję drobnoustrojów w celu poprawy kontroli fermentacji i wydajności, a także kluczowe kwestie związane z optymalizacją w celu uzyskania najlepszych wyników. Dodatkowo opisujemy, jak zaimplementować sterowanie oświetleniem w eksperymentach bioreaktorów na skalę laboratoryjną. Protokoły te ułatwiają przyjęcie kontroli optogenetycznej w zmodyfikowanych mikroorganizmach w celu poprawy wydajności fermentacji.

Optogenetyczna regulacja metabolizmu drobnoustrojów została z sukcesem wdrożona w celu produkcji wielu produktów, w tym biopaliw, chemikaliów masowych, białek i produktów naturalnych5,6,7,12,13. Większość tych procesów jest zaprojektowana tak, aby wzrost komórek zachodził w świetle (kiedy niska gęstość komórek stwarza minimalne problemy z penetracją światła), ...

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Optogenetyka została wykorzystana do uzyskania wyższych mian kilku substancji chemicznych i białek w porównaniu z typowymi induktorami. Korzystając z tego protokołu, inni mogą usprawnić swoje własne procesy dzięki sterowaniu opartemu na świetle. Kontrola optogenetyczna jest nieinwazyjna, wysoce dostrajalna i odwracalna.Cechy te pozwalają na usprawnioną optymalizację procesów mikrobiologicznych, a nawet otwierają unikalne możliwości, takie jak fermentacja trójfazowa i kontrola wielobarwna. W przypadku każdej nowej substancji chemicznej optymalne warunki oświetleniowe będą się różnić. Jeśli więc przy użyciu parametrów zawartych w tym protokole zaobserwuje się niską produkcję, należy przetestować różne warunki oświetleniowe.Zacznij od uzyskania szczepu Saccharomyces cerevisiae z oksytrofią HIS3, markerem niezbędnym dla plazmidów OptoVRT. Jeśli chcesz kontrolować gen natywny dla Saccharomyces cerevisiae, upewnij się, że endogenna kopia genu została usunięta przed kontynuowaniem. Aby rozpocząć budowę odkształcenia, należy zlinearyzować plazmid zawierający obwód OptoINVRT7, taki jak EZL439.W przypadku stosowania EZL439, który zawiera składniki do tłumienia promotora PIGA w świetle i aktywacji go w ciemności, linearyzuj w miejscu ograniczenia Pme1. Stosując standardowe metody transformacji octanu litu, zintegruj plazmid ze szczepem auksotroficznym HIS3. Po przemianie odwirować komórki w stężeniu 150 G przez jedną minutę.Delikatnie ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach świeżej pożywki SC-HIS. Umieść całą objętość komórek na płytce agarowej SC-HIS i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni, aż pojawią się kolonie. Przygotuj kompetentne komórki przy użyciu standardowych protokołów transformacji octanu litu.Przekształć komórki z plazmidem zawierającym geny, które chcesz optogenetycznie kontrolować za promotorami PIGA1M lub PIGA1S. Po przetworzeniu odwirować kulturę w temperaturze 150 G przez jedną minutę i delikatnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach świeżej pożywki SC. Płytkę z całą objętością komórki na płytce agarowej z dekstrozą peptonową i dekstrozą z ekstraktem drożdżowym, w przypadku integracji z miejscami Delta, lub na płytce wypadającej SC, jeśli przekształca się w plazmid zawierający marker selekcyjny.Inkubuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 16 godzin w ciągłym niebieskim świetle, aby utrzymać optogenetycznie kontrolowany gen w stanie stłumionym. Użyj dowolnego źródła światła o długości fali 465 nanometrów i umieść panel LED około 40 centymetrów nad płytą tak, aby natężenie światła wynosiło około 80 do 110 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę. Zmierz intensywność za pomocą miernika kwantowego.W przypadku integracji z miejscami Delta, powtórz płytkę na płytkach dekstrozy peptonu z ekstraktem drożdżowym zawierających zakres stężeń zeocyny od 400 mikrogramów na mililitr do 1 200 mikrogramów na mililitr, aby wybrać różne liczby kopii integracji. Inkubuj repliki płytek w temperaturze 30 stopni Celsjusza w stałym lub pulsacyjnym niebieskim świetle przez dwa do trzech dni, aż pojawią się kolonie. Aby przeprowadzić wstępne badanie przesiewowe, wybierz osiem kolonii z każdej płytki i użyj ich do zaszczepienia jednego mililitra pożywki SC-HIS uzupełnionej 2% glukozą w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki.Hoduj komórki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 200 obrotów na minutę przy stałym oświetleniu niebieskim światłem. Następnego dnia rozcieńczyć każdą kulturę w świeżej pożywce SC-HIS z 2% glukozą, aby uzyskać wartości gęstości optycznej w zakresie od 0,01 do 0,3 przy 600 nanometrach i hodować kultury w stanie wstrząsania 200 obrotów na minutę w stałym lub pulsacyjnym świetle w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż gęstość optyczna osiągnie od dwóch do dziewięciu. Następnie owiń płytki folią aluminiową, wyłącz panel świetlny i inkubuj płytki w ciemności przez cztery godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza z prędkością 200 obrotów na minutę.Odwirować kultury na 24-dołkowej płytce w temperaturze 234 G przez pięć minut i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżej, syntetycznej, kompletnej pożywki z 2% glukozą. Uszczelnij płytki, aby zapobiec parowaniu pożądanego produktu, za pomocą sterylnej taśmy uszczelniającej do mikropłytek. Fermentuj zamknięte talerze w ciemności przez 48 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 200 obrotów na minutę.Aby zebrać fermentacje, odwiruj płytki przez pięć minut przy 234 G i przenieś 800 mikrolitrów supernatantu do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki. W zależności od interesującej substancji chemicznej należy przeprowadzić analizę przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej, chromatografii gazowej ze spektrometrią mas lub innej metody analitycznej przy użyciu techniki przygotowania próbki najlepiej dopasowanej do zastosowanego instrumentu. Wybierz osiem kolonii z każdej płytki i użyj ich do zaszczepienia jednego mililitra pożywki SC-HIS z 2% glukozą w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki.Hoduj komórki przez noc w ciemności w temperaturze 30 stopni Celsjusza z 200 obrotami na minutę, potrząsając. Następnego ranka rozcieńczyć każdą kulturę w świeżym pożywce SC-HIS o gęstości optycznej 2% glukozy do 0,1. Zawiń płytki w folię aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło i hoduj kulturę w ciemności w temperaturze 30 stopni Celsjusza z 200 obrotami na minutę, potrząsając, aż osiągną gęstość optyczną trzech.Następnie inkubuj płytki w pulsacyjnym świetle przez 12 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem 200 obrotów na minutę. Odwirować kultury w stężeniu 234 G przez pięć minut i ponownie zawiesić w świeżej pożywce SC-HIS z 2% glukozą. Uszczelnij płytki, aby zapobiec parowaniu pożądanego produktu, za pomocą sterylnej taśmy uszczelniającej do mikropłytek.Fermentuj zamknięte talerze w świetle przez 48 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 200 obrotów na minutę. Po przeprowadzeniu fermentacji optogenetycznej badano produkcję chemiczną w zakresie gęstości komórek w momencie indukcji za pomocą dwóch obwodów. Układ OptoINVRT7 wykazał wysokie miana kwasu mlekowego i izobutanolu przy optymalnej gęstości komórek o wartości indukcji 7,0 i 8,75 w porównaniu z obwodami OptoINVRT1 i 2.Fermentacje z wykorzystaniem obwodów OptoAMP badano w trzech fazach zdefiniowanych przez różne lekkie cykle pracy. Produkcję kwasu mlekowego można zoptymalizować za pomocą pulsacyjnej fazy wzrostu oraz w pełni oświetlonych faz indukcji i produkcji. Produkcja izobutanolu została zoptymalizowana przy użyciu pulsacyjnej fazy wzrostu, w pełni oświetlonej fazy indukcji i pulsacyjnej fazy produkcji.Natomiast biosyntezę naringeniny najlepiej zoptymalizowano przy użyciu pulsacyjnego wzrostu, w pełni oświetlonej fazy indukcji i ciemnej fazy. System OptoLAC został wykorzystany w E. Coli do wytworzenia czynnika transkrypcyjnego FDER przy mianach porównywalnych lub wyższych niż te osiągane za pomocą indukcji chemicznej za pomocą IPDG. Do produkcji mewalonianu zastosowano obwody OptoLAC, a produkcja przewyższa miana uzyskane za pomocą indukcji IPDG.Produkcja mewalonianu na poziomie bioreaktora wykazuje skalowalność i możliwość dostrajania regulacji optogenetycznej w produkcji chemicznej i białkowej u bakterii powyżej poziomu mikropłytek. Ważne jest, aby upewnić się, że natężenie światła mieści się w odpowiednim zakresie dla oświetlonych stopni i że unika się zanieczyszczenia światłem w przypadku stopni wymagających ciemności. Technika ta utorowała drogę do osiągnięcia rekordowych mian izobutanolu w drożdżach, ustabilizowania populacji konsorcjów za pomocą światła, a nawet kontrolowania strumienia metabolicznego za pomocą syntetycznych organelli sterowanych światłem.

light-controlled-fermentations-for-microbial-chemical-protein

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Hemmerich, J. i in. Protokół optymalizacji heterologicznego wytwarzania białek z wykorzystaniem zautomatyzowanej technologii mikrobioreaktorów. J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje użycie zautomatyzowanego mikrobioreaktora do monitorowania wzrostu bakterii i wydzielania białek fluorescencyjnej w odpowiedzi na różne formuły mediów. Genetycznie zmodyfikowana bakteria ekspresyjna wydzielniowa fluorescencja jest hodowana pod antybiotykowym selekcją i zaszczepiana w dołkach o zróżnicowanych...

Monitorowanie wzrostu bakterii w różnych formułach ośrodka za pomocą zautomatyzowanego mikrobioreaktora

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Ten manuskrypt opisuje ogólne podejście do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do uprawy mikrobiologicznej. Jest to możliwe dzięki iteracyjnemu procesowi pracy, łączącemu eksperymentalny projekt oparty na Krigingu i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, która jest wspierana przez robotykę laboratoryjną w celu zwiększenia niezawodności i szybkości przygotowywania pożywek do pracy z cieczami.

Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Ponieważ organizmy beztlenowe nie są w stanie rosnąć po ekspozycji na tlen, niezbędne jest stosowanie technik hodowli beztlenowej. W tym miejscu demonstrujemy prostą i skuteczną metodę uprawy mieszanej kultury pochodzącej z biogazowni, od przygotowania pożywki do ilościowego oznaczania gazu i lotnych kwasów tłuszczowych.

Pożywka Preparat do hodowli mikroorganizmów w warunkach ściśle beztlenowych/beztlenowych

Ten protokół wykorzystuje bioluminescencyjny reporter, który umożliwia pomiary aktywności transkrypcyjnej u Saccharomyces eubayanus w celu monitorowania przejścia z glukozy do maltozy, umożliwiając analizę adaptacji metabolicznych w czasie rzeczywistym i wspierając optymalizację szczepu do fermentacji przemysłowej w różnych warunkach.

In vivo (in vivo) Monitorowanie aktywności transkrypcyjnej podczas przemiany metabolicznej za pomocą bioluminescencyjnego reportera w drożdżach

Protokół ten wykorzystuje otręby pszenne w obrotowym systemie fermentacji w stanie stałym w celu zwiększenia produkcji enzymów. Podłoże, uzupełnione o induktory, takie jak chityna, wspomaga wzrost grzybów w kontrolowanych warunkach. Wyniki pokazują, że wydajność enzymów jest 4-6 razy wyższa w porównaniu z fermentacją zanurzeniową, co pokazuje zdolność adaptacyjną i skuteczność metody w różnych zastosowaniach biotechnologicznych.

Projektowanie systemów fermentacji w stanie stałym do wytwarzania hydrolitycznych enzymów zewnątrzkomórkowych polimerów przez grzyby strzępkowe

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Niniejsza metoda opisuje kombinatoryczną syntezę bibliotek biodegradowalnych filmów i nanocząsteczek polianhydrydowych oraz wysokoprzepustową detekcję uwalniania białek z tych bibliotek.

Kombinatoryczna synteza oraz wysokoprzepustowe uwalnianie białek z bibliotek błon polimerowych i nanocząstek

Prezentujemy syntezę hydrożelu białkowego, w którym pośredniczy rozszczepiona inteina. Budulcem tego hydrożelu są dwa kopolimery białkowe, z których każdy zawiera podjednostkę białka trimerycznego, która służy jako środek sieciujący i połowę rozszczepionej inteiny. Zmieszanie dwóch kopolimerów białkowych wyzwala reakcję splicingu trans-inteinowego, w wyniku której powstaje jednostka polipeptydowa, która samoorganizuje się w hydrożel. Ten hydrożel jest wysoce stabilny pod względem pH i...

Synteza sztucznego hydrożelu białkowego za pośrednictwem inteiny

Poznaj metodę fermentacji kontrolowanej światłem niebieskim w celu zwiększenia produkcji chemikaliów i białek mikrobiologicznych. Protokół ten umożliwia precyzyjną regulację metabolizmu drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Przeglądaj więcej filmów