Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Optogenetyka została wykorzystana do uzyskania wyższych mian kilku substancji chemicznych i białek w porównaniu z typowymi induktorami. Korzystając z tego protokołu, inni mogą usprawnić swoje własne procesy dzięki sterowaniu opartemu na świetle. Kontrola optogenetyczna jest nieinwazyjna, wysoce dostrajalna i odwracalna.

Cechy te pozwalają na usprawnioną optymalizację procesów mikrobiologicznych, a nawet otwierają unikalne możliwości, takie jak fermentacja trójfazowa i kontrola wielobarwna. W przypadku każdej nowej substancji chemicznej optymalne warunki oświetleniowe będą się różnić. Jeśli więc przy użyciu parametrów zawartych w tym protokole zaobserwuje się niską produkcję, należy przetestować różne warunki oświetleniowe.

Zacznij od uzyskania szczepu Saccharomyces cerevisiae z oksytrofią HIS3, markerem niezbędnym dla plazmidów OptoVRT. Jeśli chcesz kontrolować gen natywny dla Saccharomyces cerevisiae, upewnij się, że endogenna kopia genu została usunięta przed kontynuowaniem. Aby rozpocząć budowę odkształcenia, należy zlinearyzować plazmid zawierający obwód OptoINVRT7, taki jak EZL439.

W przypadku stosowania EZL439, który zawiera składniki do tłumienia promotora PIGA w świetle i aktywacji go w ciemności, linearyzuj w miejscu ograniczenia Pme1. Stosując standardowe metody transformacji octanu litu, zintegruj plazmid ze szczepem auksotroficznym HIS3. Po przemianie odwirować komórki w stężeniu 150 G przez jedną minutę.

Delikatnie ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach świeżej pożywki SC-HIS. Umieść całą objętość komórek na płytce agarowej SC-HIS i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni, aż pojawią się kolonie. Przygotuj kompetentne komórki przy użyciu standardowych protokołów transformacji octanu litu.

Przekształć komórki z plazmidem zawierającym geny, które chcesz optogenetycznie kontrolować za promotorami PIGA1M lub PIGA1S. Po przetworzeniu odwirować kulturę w temperaturze 150 G przez jedną minutę i delikatnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach świeżej pożywki SC. Płytkę z całą objętością komórki na płytce agarowej z dekstrozą peptonową i dekstrozą z ekstraktem drożdżowym, w przypadku integracji z miejscami Delta, lub na płytce wypadającej SC, jeśli przekształca się w plazmid zawierający marker selekcyjny.

Inkubuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 16 godzin w ciągłym niebieskim świetle, aby utrzymać optogenetycznie kontrolowany gen w stanie stłumionym. Użyj dowolnego źródła światła o długości fali 465 nanometrów i umieść panel LED około 40 centymetrów nad płytą tak, aby natężenie światła wynosiło około 80 do 110 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę. Zmierz intensywność za pomocą miernika kwantowego.

W przypadku integracji z miejscami Delta, powtórz płytkę na płytkach dekstrozy peptonu z ekstraktem drożdżowym zawierających zakres stężeń zeocyny od 400 mikrogramów na mililitr do 1 200 mikrogramów na mililitr, aby wybrać różne liczby kopii integracji. Inkubuj repliki płytek w temperaturze 30 stopni Celsjusza w stałym lub pulsacyjnym niebieskim świetle przez dwa do trzech dni, aż pojawią się kolonie. Aby przeprowadzić wstępne badanie przesiewowe, wybierz osiem kolonii z każdej płytki i użyj ich do zaszczepienia jednego mililitra pożywki SC-HIS uzupełnionej 2% glukozą w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki.

Hoduj komórki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 200 obrotów na minutę przy stałym oświetleniu niebieskim światłem. Następnego dnia rozcieńczyć każdą kulturę w świeżej pożywce SC-HIS z 2% glukozą, aby uzyskać wartości gęstości optycznej w zakresie od 0,01 do 0,3 przy 600 nanometrach i hodować kultury w stanie wstrząsania 200 obrotów na minutę w stałym lub pulsacyjnym świetle w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż gęstość optyczna osiągnie od dwóch do dziewięciu. Następnie owiń płytki folią aluminiową, wyłącz panel świetlny i inkubuj płytki w ciemności przez cztery godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza z prędkością 200 obrotów na minutę.

Odwirować kultury na 24-dołkowej płytce w temperaturze 234 G przez pięć minut i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżej, syntetycznej, kompletnej pożywki z 2% glukozą. Uszczelnij płytki, aby zapobiec parowaniu pożądanego produktu, za pomocą sterylnej taśmy uszczelniającej do mikropłytek. Fermentuj zamknięte talerze w ciemności przez 48 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 200 obrotów na minutę.

Aby zebrać fermentacje, odwiruj płytki przez pięć minut przy 234 G i przenieś 800 mikrolitrów supernatantu do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki. W zależności od interesującej substancji chemicznej należy przeprowadzić analizę przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej, chromatografii gazowej ze spektrometrią mas lub innej metody analitycznej przy użyciu techniki przygotowania próbki najlepiej dopasowanej do zastosowanego instrumentu. Wybierz osiem kolonii z każdej płytki i użyj ich do zaszczepienia jednego mililitra pożywki SC-HIS z 2% glukozą w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki.

Hoduj komórki przez noc w ciemności w temperaturze 30 stopni Celsjusza z 200 obrotami na minutę, potrząsając. Następnego ranka rozcieńczyć każdą kulturę w świeżym pożywce SC-HIS o gęstości optycznej 2% glukozy do 0,1. Zawiń płytki w folię aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło i hoduj kulturę w ciemności w temperaturze 30 stopni Celsjusza z 200 obrotami na minutę, potrząsając, aż osiągną gęstość optyczną trzech.

Następnie inkubuj płytki w pulsacyjnym świetle przez 12 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem 200 obrotów na minutę. Odwirować kultury w stężeniu 234 G przez pięć minut i ponownie zawiesić w świeżej pożywce SC-HIS z 2% glukozą. Uszczelnij płytki, aby zapobiec parowaniu pożądanego produktu, za pomocą sterylnej taśmy uszczelniającej do mikropłytek.

Fermentuj zamknięte talerze w świetle przez 48 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 200 obrotów na minutę. Po przeprowadzeniu fermentacji optogenetycznej badano produkcję chemiczną w zakresie gęstości komórek w momencie indukcji za pomocą dwóch obwodów. Układ OptoINVRT7 wykazał wysokie miana kwasu mlekowego i izobutanolu przy optymalnej gęstości komórek o wartości indukcji 7,0 i 8,75 w porównaniu z obwodami OptoINVRT1 i 2.

Fermentacje z wykorzystaniem obwodów OptoAMP badano w trzech fazach zdefiniowanych przez różne lekkie cykle pracy. Produkcję kwasu mlekowego można zoptymalizować za pomocą pulsacyjnej fazy wzrostu oraz w pełni oświetlonych faz indukcji i produkcji. Produkcja izobutanolu została zoptymalizowana przy użyciu pulsacyjnej fazy wzrostu, w pełni oświetlonej fazy indukcji i pulsacyjnej fazy produkcji.

Natomiast biosyntezę naringeniny najlepiej zoptymalizowano przy użyciu pulsacyjnego wzrostu, w pełni oświetlonej fazy indukcji i ciemnej fazy. System OptoLAC został wykorzystany w E. Coli do wytworzenia czynnika transkrypcyjnego FDER przy mianach porównywalnych lub wyższych niż te osiągane za pomocą indukcji chemicznej za pomocą IPDG. Do produkcji mewalonianu zastosowano obwody OptoLAC, a produkcja przewyższa miana uzyskane za pomocą indukcji IPDG.

Produkcja mewalonianu na poziomie bioreaktora wykazuje skalowalność i możliwość dostrajania regulacji optogenetycznej w produkcji chemicznej i białkowej u bakterii powyżej poziomu mikropłytek. Ważne jest, aby upewnić się, że natężenie światła mieści się w odpowiednim zakresie dla oświetlonych stopni i że unika się zanieczyszczenia światłem w przypadku stopni wymagających ciemności. Technika ta utorowała drogę do osiągnięcia rekordowych mian izobutanolu w drożdżach, ustabilizowania populacji konsorcjów za pomocą światła, a nawet kontrolowania strumienia metabolicznego za pomocą syntetycznych organelli sterowanych światłem.