Przecięcie rdzenia kręgowego u kijanek Xenopus laevis

Przecięcie rdzenia kręgowego kijanki Xenopus laevis jest odpowiednią metodą do badania uszkodzenia rdzenia kręgowego i regeneracji poprzez wykonanie poprzecznego cięcia, które całkowicie przecina rdzeń kręgowy na poziomie klatki piersiowej.

Protokół ten pozwala na badanie regeneracji rdzenia kręgowego u żab. Zdobyta wiedza może dostarczyć nowych informacji, które pozwolą zrozumieć, w jaki sposób ludzie reagują na uraz rdzenia kręgowego. Główną zaletą tego protokołu jest łatwość wykonania urazu, a także to, że w porównaniu z paradygmatem amputacji ogona, technika ta lepiej naśladuje to, co dzieje się u ludzi.

Technika ta pozwala rzucić wyzwanie procesowi regeneracyjnemu, aby lepiej zrozumieć udział różnych genów, białek, cząsteczek i szlaków sygnałowych, identyfikując w ten sposób nowe cele terapeutyczne, Znalezienie odpowiedniego miejsca do powstania urazu, a także jego przedłużenia, jest trudne. Możliwość zobaczenia tych kroków ma kluczowe znaczenie dla uproszczenia i powtarzalności tej procedury. Trzy do czterech tygodni po zapłodnieniu umieść kijanki na szalce Petriego i sprawdź morfologię i wygląd kończyn przednich i tylnych.

Zwróć uwagę na następujące cechy anatomiczne zwierząt w stadium 50: kończyny przednie, które dopiero się pojawiają i są kuliste, oraz kończyny tylne, które wystają i są kuliste. Przed zabiegiem znieczulij kijanki, umieszczając je w 0,02% mesylanu trikainy w 0,1-krotnym roztworze Bartha i sprawdź, czy zwierzęta nie reagują, odwracając je do góry nogami. Aby wykonać operację przecięcia rdzenia kręgowego, użyj łyżki stołowej i kleszczy, aby umieścić znieczuloną kijankę w stadium 50 grzbietową do góry na mokrym kawałku gazy w górnej połowie szklanej szalki Petriego.

Następnie za pomocą nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji należy wykonać nacięcie skóry i mięśni grzbietowych na poziomie środkowej części klatki piersiowej. W przypadku zwierząt pozorowanych należy upewnić się, że rozmiar nacięcia wynosi tylko 0,2 milimetra i nie uszkadza rdzenia kręgowego. U zwierząt, u których dokonano transektu, wykonaj drugie nacięcie o długości 0,2 milimetra, aby w pełni przeciąć rdzeń kręgowy.

Po operacji przenieś kijanki do zbiornika zawierającego 500 mililitrów 0,1-krotnego roztworu Bartha z jednorazową penicyliną i streptomycyną o gęstości od 10 do 12 kijanek na zbiornik. Utrzymuj transektowane i kontroluj kijanki pozorne w oddzielnych zbiornikach. Utrzymuj kijanki z napowietrzeniem w temperaturze od 20 do 21 stopni Celsjusza.

Zmieniaj roztwór Bartha z antybiotykami co drugi dzień aż do końca eksperymentu. Zacznij karmić kijanki dzień po operacji i wyeliminuj martwe zwierzęta. Do testu pływania należy zaopatrzyć się w pudełko z oświetleniem LED od wewnątrz, pokryte przezroczystym arkuszem polistyrenu przepuszczającym światło, a następnie zainstalować kamerę nad skrzynką LED.

Następnie umieść szalkę Petriego o średnicy 15 centymetrów na pudełku wypełnionym 100 mililitrami 0,1-krotnego roztworu Bartha. Jednego dnia po przecięciu umieść kijankę na szalce Petriego i pozostaw ją na pięciominutowy okres adaptacji. Po adaptacji rozpocznij nagrywanie wideo zachowania podczas swobodnego pływania za pomocą oprogramowania referencyjnego przez pięć minut.

Po zakończeniu filmu przenieś kijankę z powrotem do zbiornika. Ten reprezentatywny wykres punktowy pokazuje odzyskiwanie funkcji motorycznych w czasie. Pięć dni po przecięciu kijanki przepłynęły średnio 0,7 metra w ciągu pięciu minut, wykazując zmniejszoną zdolność pływania.

Pojemność ta rosła wraz z upływem dni, wykazując średnio 2,1 metra w ciągu pięciu minut po 10 dniach i 3,1 metra w ciągu pięciu minut po 15 dniach od przecięcia. Całkowite odzyskanie zdolności pływackich zaobserwowano po 20 dniach od przecięcia, ze średnią 5,7 metra w ciągu pięciu minut. Średnia pływania może się różnić w zależności od każdej partii zwierząt.

W związku z tym grupa eksperymentalna powinna być zawsze porównywana z odpowiednimi kontrolami i nie uzyskanymi wcześniej danymi. Po operacji zwierzęta mogą być wykorzystywane do analiz globalnych, w tym transkryptomiki, proteomiki i metabolomiki, a także do badań przesiewowych w poszukiwaniu związków, które hamują lub promują regenerację rdzenia kręgowego, w celu opracowania nowych podejść terapeutycznych.