Name: Przecięcie rdzenia kręgowego u kijanek Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Poznaj metodę przecięcia rdzenia kręgowego u kijanek Xenopus laevis, która naśladuje urazy u ludzi. Technika ta pozwala badać mechanizmy regeneracji i identyfikować nowe cele terapeutyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów badawczych od: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).

Ten protokół dostarcza wystarczająco dużo informacji, aby pomyślnie przeprowadzić przecięcie rdzenia kręgowego. Warto zauważyć, że istnieją doskonałe szczegółowe protokoły tych technik opublikowane gdzie indziej14, które mogą uzupełniać ten przedstawiony tutaj. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Bioetyki i Bezpieczeństwa Biologicznego z Wydziału Nauk Biologicznych Pontificia Universidad Católica de Chile.
1. Naturalne krycie żab
<ol>
	<li>Trzy do pięciu dni przed kryciem należy wstrzyknąć podskórnie samcom i samicom żab 50 jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG). Użyj techniki "żelaznego pazura" do powstrzymywania żab; Ponieważ żaby są śliskie, w razie potrzeby użyj siatki, aby otoczyć żabę. Włóż końcówkę igły 26 G x 1/2" z tyłu do linii bocznej, popychając ją grzbietowo na głębokość 1 cm, między skórą a mięśniem.</li>
	<li>Przed kryciem wstrzyknąć samcowi 300 jednostek, a samicy 700 jednostek hCG.</li>
	<li>Aby doszło do krycia, umieścić samca i samicę w 2 litrach 0,1 x roztworu Bartha natychmiast po schłodzeniu roztworu w temperaturze 4 °C przez 15 minut, aby przypominały warunki wiosenne i pozostawić na noc w temperaturze 18 °C.</li>
	<li>Szesnaście godzin później ostrożnie zbierz zarodki za pomocą plastikowej pipety Pasteura, z odciętą końcówką, i umieść je na szalkach Petriego o średnicy 10 cm. Usunąć embrionalną galaretowatą otoczkę, inkubując zarodki z 25 ml 2% cysteiny w wodzie destylowanej (pH 7,8; upewnić się, że roztwór pokrywa zarodki) przez 5 minut z lekkim mieszaniem. Przemyć 3 razy wodą destylowaną i 3 razy 0,1x roztworem Bartha (8,9 mM NaCl; 102 μM KCl; 238,1 μM NaHCO3; 1 mM 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-kwas etanosulfonowy (HEPES); 81,14 μM MgSO4; 33,88 μM Ca(NO3)2; 40,81 μM CaCl2, pH 7,6).</li>
	<li>Wybierz zdrowe zarodki, które mają brązowawy kolor i symetrycznie dzielące się blastomery. Umieścić zarodki na szalkach Petriego o średnicy 10 cm z 50 ml 0,1 x roztworu Bartha o gęstości nie większej niż 100 zarodków na szalkę.</li>
</ol>
2. Hodowla
<ol>
	<li>Przez pierwszy tydzień należy utrzymywać zarodki w temperaturze 18 °C, aż do momentu, gdy usuną się z worka witelinowego. W tym czasie codziennie zmieniaj roztwór Bartha i usuwaj białawe martwe zarodki i kijanki wykazujące widoczne zmiany anatomiczne lub kijanki bez ruchu pływackiego.</li>
	<li>Po pierwszym tygodniu przenieś kijanki do wody bez chloru w plastikowych zbiornikach o gęstości 10 zwierząt na litr. Uprawiaj kijanki w temperaturze 20-21 °C w 12-godzinnym cyklu światła/12-godzinnym ciemnym cyklu, z kamieniami tlenowymi dostępnymi w każdym zbiorniku do napowietrzania wody i karmionymi raz dziennie w ilości 0,5 mg na zwierzę. Wymieniaj wodę raz w tygodniu i codziennie sprawdzaj, czy nie ma nagromadzonych odpadów i martwych zwierząt24.</li>
</ol>
3. Inscenizacja
<ol>
	<li>Trzy do czterech tygodni po zapłodnieniu umieść zwierzęta na szalce Petriego, a następnie, jedno po drugim, sprawdź morfologię i wygląd kończyn przednich i tylnych. Jeśli to konieczne, znieczulij zwierzęta, umieszczając je na szalce Petriego z 50 ml 0,02% mesylanu tricainy w 0,1 x roztworze Bartha dla lepszej manipulacji. Po nie więcej niż 2 minutach umieść zwierzęta w 0,1x roztworze Bartha, aby dojść do siebie po znieczuleniu.</li>
	<li>Zwróć uwagę na następujące cechy anatomiczne zwierząt w stadium 5025: kończyny przednie, które dopiero się pojawiają i są kuliste (<silna klasa="xfig">Rysunek 1); kończyny tylne, które wystają i są kuliste (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Do tej procedury można wykorzystać zwierzęta od etapów od 49 do 51 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1); Aby uzyskać więcej informacji na temat etapów, zapoznaj się z tabelą normalnych Nieuwkoopa i Fabera Xenopus laevis25.</li>
</ol>
4. Chirurgia: przecięcie rdzenia kręgowego i pozorowane operowanie zwierząt
<ol>
	<li>Znieczulij kijanki etapu 50, umieszczając je na szalce Petriego z 50 ml 0,02% mezylanu tricainy w 0,1 x roztworze Bartha na 2 minuty.</li>
	<li>Za pomocą łyżki stołowej i kleszczy umieść kijankę, grzbietową stroną do góry, na mokrym kawałku gazy w górnej połowie szklanej szalki Petriego.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie skóry i mięśni grzbietowych na środkowym poziomie klatki piersiowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, B) za pomocą nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji.
	<ol>
		<li>W przypadku kontrolnych zwierząt pozorowanych upewnij się, że rozmiar nacięcia wynosi tylko ~0,2 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C); nie uszkadzaj rdzenia kręgowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D,D').</li>
		<li>W przypadku zwierząt z transektem należy wykonać drugie nacięcie o średnicy ~0,2 mm (<klasa silna="xfig">Rycina 2C), aby w pełni przeciąć rdzeń kręgowy (<klasa silna="xfig">Rycina 2E,E').</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Po zabiegu przenieś kijanki do zbiornika zawierającego 0,5 l 0,1x roztworu Bartha z 1x penicyliną-streptomycyną, w gęstości 10-12 zwierząt na zbiornik. Utrzymuj transektowane i kontroluj zwierzęta pozorowane w oddzielnych zbiornikach. 
	UWAGA: Kijanki wyzdrowieją po znieczuleniu w ciągu kilku minut.</li>
	<li>Utrzymuj kijanki z napowietrzaniem w temperaturze 20-21 °C.</li>
	<li>Zmieniaj roztwór Bartha z antybiotykami co drugi dzień aż do końca eksperymentu.</li>
	<li>Zacznij karmić zwierzęta dzień po operacji, raz dziennie.</li>
	<li>Wyeliminuj martwe zwierzęta.</li>
</ol>
6. Test pływacki
<ol>
	<li>Zaopatrz się w skrzynkę z oświetleniem LED od wewnątrz, pokrytą przezroczystą blachą styropianową, która przepuszcza światło.</li>
	<li>Zainstaluj kamerę nad skrzynką LED.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego o średnicy 15 cm na wierzchu pudełka, wypełnioną 100 ml 0,1 x roztworu Bartha.</li>
	<li>Jednego dnia po przecięciu umieść kijankę na szalce Petriego i pozostaw na 5-minutowy okres adaptacji.</li>
	<li>Po adaptacji rozpocznij filmowanie zachowania podczas swobodnego pływania za pomocą wspomnianego oprogramowania (patrz tabela materiałów) przez 5 minut.</li>
	<li>Po zakończeniu filmu przenieś kijankę z powrotem do zbiornika.</li>
	<li>Powtórz śledzenie wideo 5, 10, 15 i 20 dni po przecięciu (Rysunek 3).</li>
</ol>
7. Rozważania bioetyczne
UWAGA: Śmiertelność zwierząt po pozorowanej operacji i przecięciu wynosi odpowiednio 13% i 30%. Dodatkowo do analizy statystycznej niezbędne jest minimum 15-20 zwierząt w grupie. Dlatego zacznij od 23 zwierząt pozorowanych i 26 zwierząt transektowanych.
<ol>
	<li>Znieczulij zwierzęta 0,02% mesylanem trikainy przez 2 minuty, aby zapewnić zmniejszenie aktywności neuronalnej i motorycznej oraz bólu przed operacją.</li>
	<li>Po operacji sprawdź, czy zwierzęta nie dochodzą do siebie po znieczuleniu. Dodatkowo codziennie karm i sprawdzaj zwierzęta.</li>
	<li>Po zakończeniu testu pływania należy uśmiercić zwierzęta, przedawkowując mezylan trikainy (1% mezylan tricainy przygotowany w 30 mM roztworze wodorowęglanu sodu).</li>
</ol>

<ol><li>International perspectives on spinal cord injury. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury">https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury</a> (2013).</li>
<li>Quiroz, J. F. D., Echeverri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration%3A+Where+fish%2C+frogs+and+salamanders+lead+the+way%2C+can+we+follow%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration: Where fish, frogs and salamanders lead the way, can we follow.</a> Biochemical Journal. 451 (3), 353-364 (2013).</li>
<li>Lee-Liu, D., Méndez-Olivos, E. E., Muñoz, R., Larraín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+clawed+frog+Xenopus+laevis%3A+A+model+organism+to+study+regeneration+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">The African clawed frog Xenopus laevis: A model organism to study regeneration of the central nervous system.</a> Neuroscience Letters. 652, 82-93 (2017).</li>
<li>Phipps, L. S., Marshall, L., Dorey, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+regeneration%3A+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Model systems for regeneration: Xenopus.</a> Development. 147 (6), (2020).</li>
<li>Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration%3A+Lessons+for+mammals+from+non-mammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates.</a> Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).</li>
<li>Beck, C. W., Christen, B., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways+needed+for+regeneration+of+spinal+cord+and+muscle+in+a+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways needed for regeneration of spinal cord and muscle in a vertebrate.</a> Developmental Cell. 5 (3), 429-439 (2003).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+gene+expression+during+Xenopus+tropicalis+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of gene expression during Xenopus tropicalis tadpole tail regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 11, 70(2011).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li>
<li>Gargiolo, C., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+tracing+during+Xenopus+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell lineage tracing during Xenopus tail regeneration.</a> Development. 131 (11), 2669-2679 (2004).</li>
<li>Lin, G., Chen, Y., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+neural+crest+derivatives+in+the+Xenopus+tadpole+tail%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of neural crest derivatives in the Xenopus tadpole tail.</a> BMC Developmental Biology. 7, 56(2007).</li>
<li>Filoni, S., Bosco, L., Cioni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+spinal+cord+after+ablation+in+larval+Xenopus+laevistle%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Embryologiae+et+Morphologiae+Experimentalis%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the spinal cord after ablation in larval Xenopus laevistle.</a> Acta Embryologiae et Morphologiae Experimentalis. 5 (2), 109-129 (1984).</li>
<li>Gaete, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration+in+Xenopus+tadpoles+proceeds+through+activation+of+Sox2-positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration in Xenopus tadpoles proceeds through activation of Sox2-positive cells.</a> Neural Development. 7, 13(2012).</li>
<li>Muñoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2%2F3+expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Developmental Biology. 408 (2), 229-243 (2015).</li>
<li>Edwards-Faret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration in Xenopus laevis.</a> Nature Protocols. 12 (2), 372-389 (2017).</li>
<li>Méndez-Olivos, E. E., Larraín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+as+a+method+to+investigate+spinal+cord+regeneration+in+regenerative+and+nonregenerative+xenopus+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation as a method to investigate spinal cord regeneration in regenerative and nonregenerative xenopus stages.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (12), 943-947 (2018).</li>
<li>Méndez-Olivos, E. E., Muñoz, R., Larraín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+cells+from+pre-metamorphic+stages+differentiate+into+neurons+and+promote+axon+growth+and+regeneration+after+transplantation+into+the+injured+spinal+cord+of+non-regenerative+Xenopus+laevis+froglets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spinal cord cells from pre-metamorphic stages differentiate into neurons and promote axon growth and regeneration after transplantation into the injured spinal cord of non-regenerative Xenopus laevis froglets.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 398(2017).</li>
<li>de Vidts, S., Méndez-Olivos, E., Palacios, M., Larraın, J., Mery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spinal+cord+damage+based+on+automatic+video+analysis+of+froglet+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Characterization of spinal cord damage based on automatic video analysis of froglet swimming.</a> Biology Open. 8 (12), 2-11 (2019).</li>
<li>Slater, P. G., Palacios, M., Larraín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus%2C+a+model+to+study+wound+healing+and+regeneration%3A+Experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Xenopus, a model to study wound healing and regeneration: Experimental approaches.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (8), 100966(2021).</li>
<li>Lee-Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profile+of+the+response+to+spinal+cord+injury+in+Xenopus+laevis+reveals+extensive+differences+between+regenerative+and+non-regenerative+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages.</a> Neural Development. 9, 12(2014).</li>
<li>Lee-Liu, D., Sun, L., Dovichi, N. J., Larraín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+after+spinal+cord+injury+%28SCI%29+in+a+regenerative+and+a+nonregenerative+stage+in+the+frog+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics after spinal cord injury (SCI) in a regenerative and a nonregenerative stage in the frog Xenopus laevis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (4), 592-606 (2018).</li>
<li>Peñailillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+early+response+to+spinal+cord+injury+identi+fi+ed+a+key+role+for+mTORC1+signaling+in+the+activation+of+neural+stem+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Analysis of the early response to spinal cord injury identi fi ed a key role for mTORC1 signaling in the activation of neural stem progenitor cells.</a> NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 68(2021).</li>
<li>Edwards-Faret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+spinal+cord+injury+in+regenerative+and+non-regenerative+stages+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Cellular response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages in Xenopus laevis.</a> Neural Development. 16 (1), 2(2021).</li>
<li>Tapia, V. S., Herrera-Rojas, M., Larrain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK-STAT+pathway+activation+in+response+to+spinal+cord+injury+in+regenerative+and+non-regenerative+stages+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">JAK-STAT pathway activation in response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages of Xenopus laevis.</a> Regeneration. 4 (1), 21-35 (2017).</li>
<li>Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+Xenopus+laevis+tadpole+stages+to+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">How to grow Xenopus laevis tadpole stages to adult.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (3), (2021).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.%3A+A+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin).: A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. (1994).</li>
<li>Williams, M. C., Patel, J. H., Kakebeen, A. D., Wills, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+availability+contributes+to+a+graded+refractory+period+for+regeneration+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nutrient availability contributes to a graded refractory period for regeneration in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 473, 59-70 (2021).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Xenopus%3A+Methods+and+protocols%22">Xenopus: Methods and protocols</a>. Vleminckx, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+A+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbory Laboratory Press. New York. (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół jest doskonałą metodą przeprowadzania SCI i oceny funkcjonalnego powrotu do zdrowia. Aby zapewnić powtarzalność, ważne jest, aby hodować zdrowe kijanki i wybierać zwierzęta o podobnej wielkości. Brak odpowiedniego żywienia generuje stres związany ze składnikami odżywczymi, co skutkuje słabymi zdolnościami regeneracyjnymi26; Dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na karmienie kijanek. Ponieważ kijanki osiągają stadium 50 po 3-4 tygodniach, można je hodować w wyższych temperaturach, aby przyspieszyć proces wzrostu, przy czym optymalna jest 18-25 °C27. Jakość wody jest ważna, ponieważ zwierzęta są wrażliwe na warunki wodne i produkty chemiczne. Optymalne warunki wodne obejmują stosowanie wody filtrowanej węglem, bezchlorowej o następujących parametrach: pH (6,5-7,5), chlorek (<0,02 mg/L), przewodność wody (1,0 mS/cm ± 0,1 jednostki), miedź (<0,3 mg/L); twardość węglanowa (KH: 5-10 dKH); twardość ogólna (GH: 6-16 dGH); azotan (NR3: <20 mg/L); i azotyny (NO2: <0,1 mg/L)14,27,28. Dodatkowo, aby uniknąć zanieczyszczenia, plastikowe zbiorniki powinny być czyszczone raz w tygodniu w przypadku hodowli zwierząt lub co drugi dzień po operacji, dokładnie myjąc je wodą bez chlorków i gąbką; Należy unikać detergentów.
Aby uzyskać lepszą przeżywalność po operacji, kijanki nie mogą być poddawane znieczuleniu przez długi czas (nie dłużej niż 2 minuty). Ponadto zaleca się znieczulanie jednej kijanki na raz. Ponieważ zwierzęta muszą być nawodnione, utrzymuj je zanurzone w roztworze przez cały czas przed i po operacji, a przed rozpoczęciem operacji wylej roztwór łyżką na kijankę. Upewnij się, że uszkodzenie jest wystarczająco rozległe, aby objąć cały rdzeń kręgowy, ale nie za rozległe, ponieważ może to spowodować słabą regenerację funkcjonalną lub śmierć. Jeśli struna grzbietowa zostanie uszkodzona, zwierzę zostanie zgięte, co wpłynie na powrót do sprawności. Jeśli uszkodzenie wykracza poza strunę grzbietową, prawdopodobieństwo śmierci wzrasta14. Podczas testu pływania zapis uważa się za prawidłowy, jeśli oprogramowanie identyfikuje każde zwierzę za pomocą niebieskiego cienia; W przeciwnym razie nagranie należy powtórzyć. Ważne jest, aby unikać ruchu i zmian powietrza lub światła podczas procesu nagrywania, aby zapobiec błędom podczas nagrywania.
Wciąż istnieje wiele otwartych pytań dotyczących komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw uszkodzenia i regeneracji rdzenia kręgowego. Protokół opisany w tej pracy może być wykorzystany do badania wpływu różnych zdarzeń komórkowych, ekspresji genów i leczenia na regenerację funkcjonalną, określoną przez pomiar zdolności pływackich. Dodatkowo w przypadku operowanych zwierząt można zastosować wiele innych technik. Rdzeń kręgowy można wyizolować w celu przeprowadzenia ekstrakcji białka i/lub mRNA14 w celu zbadania profili ekspresji białek i genów po uszkodzeniu i leczeniu19,20. Operacja ta była również podstawą do zbadania odpowiedzi komórkowej rdzenia kręgowego22 i zachowania nerwowych komórek progenitorowych 12,13,22 po urazie rdzenia kręgowego. Kaskady sygnalizacyjne zaangażowane w regenerację rdzenia kręgowego były również badane przy użyciu paradygmatu uszkodzenia rdzenia kręgowego opisanego w niniejszymdokumencie 23. Podsumowując, opisany tutaj protokół jest doskonałym modelem do badania urazów i regeneracji rdzenia kręgowego i został wykorzystany w wielu badaniach, które przyczyniły się do istniejącej wiedzy na ten temat.

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) to przypadłość, która dotyka około 250 000-500 000 osób na całym świecie każdego roku1. Oprócz tej wysokiej częstości występowania, SCI wpływa na nerwy czuciowe i ruchowe, powodując paraliż poniżej miejsca urazu i odłączenie niektórych narządów wewnętrznych od kontroli OUN. Rdzeń kręgowy, będący częścią OUN, nie może się zregenerować, a ze względu na złożoność dolegliwości i brak pełnego zrozumienia wszystkich zaangażowanych procesów, nadal nie ma skutecznych terapii pozwalających na powrót do sprawności.
Organizmy niessaków, takie jak ryby teleoste, urodele i stadia larwalne bezogonowych, które mogą zregenerować rdzeń kręgowy po ciężkim SCI2,3,4, są doskonałymi organizmami modelowymi do badania procesów rządzących udanym zdarzeniem regeneracyjnym i zrozumienia niepowodzenia regeneracji ssaków. Wiedza ta jest bardzo interesująca, ponieważ może dostarczyć oryginalnych spostrzeżeń w celu opracowania nowych celów terapeutycznych i możliwych terapii SCI.
Żaba anurowa, Xenopus laevis, jest doskonałym organizmem modelowym do badania SCI. Ma doskonałe zdolności regeneracyjne w stadiach kijanki, które są stopniowo tracone podczas metamorfozy, co pozwala na eksperymentowanie w fazach regeneracyjnych i nieregeneracyjnych3,5. Ustaloną metodą badania SCI u kijanek Xenopus laevis jest amputacja ogona, w której usuwa się cały ogon, w tym tkanki takie jak mięśnie, struna grzbietowa i rdzeń kręgowy6. Podejście to odegrało zasadniczą rolę w zrozumieniu ogólnych mechanizmów procesów regeneracyjnych4,7,8,9,10.
Ponieważ amputacja ogona obejmuje wiele tkanek oprócz rdzenia kręgowego, co różni się od tego, co dzieje się po ludzkim SCI, potrzebny jest bardziej odpowiedni paradygmat urazów do badania SCI. Opieraliśmy się na badaniach używanych w przeszłości11 do generowania wyczerpujących opisów paradygmatów urazów5,12,13,14 oraz różnych metod badania SCI12,13,14,15,16,17,18. Po przecięciu rdzenia kręgowego część ogonową rdzenia kręgowego można wyizolować w celu ekspresji RNA i białka oraz analiz wysokoprzepustowych14,19,20,21. Dodatkowo, docelomiczne iniekcje leków i małych cząsteczek, a także elektroporacja cDNA, RNA lub morpholinos, przed lub po przecięciu rdzenia kręgowego, pozwalają na badanie wpływu tych cząsteczek na zapobieganie lub leczenie SCI lub określonych zdarzeń występujących po SCI i regeneracji rdzenia kręgowego13,14. Co więcej, ewolucję urazu i procesy regeneracyjne można badać w różnym czasie po urazie przy użyciu podejść biochemicznych, molekularnych, histologicznych i funkcjonalnych12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Wreszcie, wszystkie wyżej wymienione techniki mogą być używane w etapach nieregeneracyjnych, podkreślając jedną z najważniejszych zalet wykorzystania Xenopus laevis jako organizmu modelowego do badania SCI, badań porównawczych mechanizmów regeneracyjnych i nieregeneracyjnych u tego samego gatunku13,19,20,21,22. W pracy przedstawiono protokół przecięcia kijanki kręgowej Xenopus laevis, rozpoczynając od oceny stopnia zaawansowania i selekcji regeneracyjnych kijanek Nieuwkoopa i Fabera (NF) w stadium 50. Po tym następuje opis procedur chirurgii rdzenia kręgowego w celu wytworzenia zwierząt pozorowanych i transektowanych, opieka pooperacyjna, a na końcu analiza powrotu do zdrowia funkcjonalnego poprzez pomiar wolnej odległości pływania kijanki.

<table><tbody><tr><td>Pompa powietrza</td><td>Regent CALM</td><td>RC-006</td><td>Do funkcji kamieni dyfuzora tlenu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ANY-labirynt</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Test zachowania podczas pływania</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2&middot; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Stoelting</td><td>60528</td><td>Test zachowania podczas pływania</td></tr><tr><td>Komputerowy</td><td></td><td></td><td>test zachowania podczas pływania (minimalne zalecane specyfikacje: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, dysk 10 GB, 1 dostępny port USB, monitor 1,366 i 768)</td></tr><tr><td>Cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Preparacyjny mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td>Chirurgia / inscenizacja</td></tr><tr><td>Szklane szalki</td><td></td><td></td> Petriego <td>100 x 20 mm</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka gonadotropina</td><td></td><td></td> kosmówkowa <td>Można go znaleźć w różnych formatach w aptece</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck Millipore</td><td>104936</td><td></td></tr><tr>LED<td>Light Box</td><td>na zamówienie wykonana</td><td></td><td>drewniana skrzynka: długość 55 cm, szerokość 34 cm, wysokość 9 cm, oświetlenie LED, przezroczysta płyta polistyrenu)</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td> Nożyczki do mikrodysekcji <td>Merck Millipore</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>do cięcia</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>Nożyczki sprężynowe do chirurgii</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Znieczulenie; mezylan trikainy</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Nasco Frog Brittle dla kijanki Xenopus</td><td>Nasco</td><td>SB09480(LM)MX</td><td>Pokarm dla kijanek Xenopus etap&nbsp; 44 do 60</td></tr><tr><td>Kamienie dyfuzora tlenu</td><td>Pentair</td><td>AA1</td><td>Hodowla zwierząt</td></tr><tr><td>Para kleszczy</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont n&deg; 5 kleszczy SF</td><td>do operacji</td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7794</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta Pasteura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td>Do pobierania zarodków po kryciu</td></tr><tr><td>Plastikowe szalki Petriego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5981</td><td>150 x 15 mm</td></tr><tr><td>Plastikowy zbiornik/pudełko z pokrywką</td><td></td><td></td><td>o pojemności 4,5 litra; 20 cm i razy; 17 cm i razy; 15 cm lub podobne</td></tr><tr><td>Gaza</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sterylizowanaStreptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1277</td><td></td></tr><tr><td>Łyżka</td><td></td><td></td><td></td> stołowa</tr><tr><td>Xenopus laevis wyspecjalizowane szczepy i linie</td><td>Krajowy zasób Xenopus Europejskie Centrum Zasobów Xenopus Centrum</td><td></td> <td>Zasobów Badawczych Xenopus laevishttp://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ </td></tr><tr><td>https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspxXenopus laevis dziki typ</td><td>Xenopus 1 Xenopus Express</td><td></td><td>https://xenopus1.com http://www.xenopus.com</td></tr></tbody></table>

przecięcie rdzenia kręgowego u kijanek xenopus laevis

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) to trwała przypadłość, która wpływa na nerwy ruchowe i czuciowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN), powodując paraliż poniżej miejsca urazu. Do tej pory nie ma funkcjonalnej terapii regeneracyjnej dla SCI i brakuje jasności co do wielu kompleksów i dynamicznych zdarzeń występujących po SCI. Wiele organizmów innych niż ssaki może się zregenerować po ciężkim SCI, takich jak ryby teleostowe, urodele i stadia larwalne bezogonowych, w tym kijanek Xenopus laevis. Są to prawdziwe organizmy modelowe do badania i zrozumienia reakcji na SCI oraz mechanizmów leżących u podstaw udanych procesów regeneracyjnych. Tego typu badania mogą prowadzić do identyfikacji potencjalnych celów interwencji terapeutycznej w przypadku SCI. W tym artykule opisano, jak wykonać przekrój kijanki kręgowej Xenopus laevis, w tym hodowlę, operację, opiekę pooperacyjną i ocenę testów funkcjonalnych. Ta metoda uszkodzenia może być zastosowana do wyjaśnienia różnych etapów regeneracji rdzenia kręgowego poprzez badanie mechanizmów komórkowych, molekularnych i genetycznych, a także ewolucji histologicznej i funkcjonalnej po SCI i podczas regeneracji rdzenia kręgowego.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół umożliwia badanie regeneracji rdzenia kręgowego u Xenopus laevis. Wpływ specyficznych zabiegów farmakologicznych oraz udział konkretnej ekspresji genów w regeneracji rdzenia kręgowego można ocenić, mierząc ich oddziaływanie na powrót zdolności do pływania. Całkowity dystans pływania jest zestawiony w stosunku do liczby dni po urazie, aby porównać zwierzęta kontrolne i leczone w określonym punkcie czasowym lub w wyznaczonym okresie. Przykład regeneracji funkcji motorycznych w czasie przedstawiono na Rysunku 3, który ukazuje dystans pływania w 5, 10, 15 i 20 dniach po przecięciu rdzenia. W 5. dniu po przecięciu zwierzęta przepłynęły średnio 0,7 m w 5 min, co wskazuje na obniżoną zdolność pływania. Zdolność ta wzrastała wraz z upływem dni – średnio 2,1 i 3,1 m/5 min zaobserwowano odpowiednio po 10 i 15 dniach od przecięcia – a całkowity powrót zdolności pływania odnotowano w 20. dniu po przecięciu, przy średnim wyniku 5,7 m/5 min.
<img alt="Etapy rozwoju kończyn przednich i tylnych 49-51, analiza wzrostu kończyn na obrazach mikroskopowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Okresy rozwojowe kijanki Xenopus. Reprezentatywne obrazy etapów 49-51, przedstawiające kończyny przednie i tylne jako punkt odniesienia do określania stadium rozwoju zwierzęcia. Paski skali = 2 mm. Powiększenia obszarów zaznaczonych ramkami znajdują się w prawym dolnym rogu każdego obrazu. Paski skali = 1 mm. W etapie 49 kończyn przednich nie obserwuje się, natomiast kończyny tylne dopiero się pojawiają, wykazując kształt sferyczny. Etap 50 przedstawia pojawiające się kończyny przednie o kształcie sferycznym oraz wysuwające się kończyny tylne o kształcie sferycznym. W etapie 51 kończyny przednie mają wysuwający się kształt sferyczny, a kończyny tylne wysuwający się kształt wydłużony. Przerywane linie obrysowują kończyny przednie i tylne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat wzorca komórek neuronalnych; obraz mikroskopowy analizy tkanek pozorowanych w stosunku do przeciętych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przecięcie rdzenia kręgowego. (A) Reprezentatywny obraz pokazujący prawidłowe ułożenie zwierzęcia, stroną grzbietową do góry, do przeprowadzenia operacji. Pasek skali = 2 mm. (B) Powiększenie obrazu A pokazuje lokalizację i zakres urazu. Czerwony krzyżyk wskazuje dokładne miejsce urazu na poziomie piersiowym rdzenia kręgowego, a przerywana linia pokazuje zakres urazu. Pasek skali = 1 mm. (C) Reprezentatywny obraz pokazujący widok boczny poziomu piersiowego rdzenia kręgowego. Przedstawiono zasięg nacięcia pozorowanego oraz przecięcia. Linie przerywane wyznaczają granice rdzenia kręgowego. Pasek skali = 1 mm. (D) Reprezentatywny obraz pokazujący zwierzę w grupie pozorowanej z nienaruszonym rdzeniem kręgowym. Paski skali = 1 mm. (E) Reprezentatywny obraz pokazujący zwierzę po przecięciu z przerwanym rdzeniem kręgowym. Paski skali = 1 mm. Powiększenia obszaru w ramce znajdują się w prawym dolnym rogu każdego obrazu (D´ i E´). Paski skali = 1 mm. Skróty: S = nacięcie pozorowane; T = przecięcie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza ruchu; wykres odległości w czasie; pokazuje wzrost ruchu wraz z upływem czasu; wykres i schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Powrót funkcji pływania w czasie. Reprezentatywny wykres punktowy odległości przepłyniętej przez zwierzęta po przekroju w ciągu 5 min w 5, 10, 15 i 20 dni po przekroju. Przykładowe trajektorie pływania przedstawiono u góry. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM dla 10 kijanków. Skróty: dpT = dni po przekroju; SEM = standardowy błąd średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Przecięcie rdzenia kręgowego kijanki Xenopus laevis jest odpowiednią metodą do badania uszkodzenia rdzenia kręgowego i regeneracji poprzez wykonanie poprzecznego cięcia, które całkowicie przecina rdzeń kręgowy na poziomie klatki piersiowej.

Przecięcie rdzenia kręgowego u kijanek Xenopus laevis

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...

Protokół ten pozwala na badanie regeneracji rdzenia kręgowego u żab. Zdobyta wiedza może dostarczyć nowych informacji, które pozwolą zrozumieć, w jaki sposób ludzie reagują na uraz rdzenia kręgowego. Główną zaletą tego protokołu jest łatwość wykonania urazu, a także to, że w porównaniu z paradygmatem amputacji ogona, technika ta lepiej naśladuje to, co dzieje się u ludzi.Technika ta pozwala rzucić wyzwanie procesowi regeneracyjnemu, aby lepiej zrozumieć udział różnych genów, białek, cząsteczek i szlaków sygnałowych, identyfikując w ten sposób nowe cele terapeutyczne, Znalezienie odpowiedniego miejsca do powstania urazu, a także jego przedłużenia, jest trudne. Możliwość zobaczenia tych kroków ma kluczowe znaczenie dla uproszczenia i powtarzalności tej procedury. Trzy do czterech tygodni po zapłodnieniu umieść kijanki na szalce Petriego i sprawdź morfologię i wygląd kończyn przednich i tylnych.Zwróć uwagę na następujące cechy anatomiczne zwierząt w stadium 50: kończyny przednie, które dopiero się pojawiają i są kuliste, oraz kończyny tylne, które wystają i są kuliste. Przed zabiegiem znieczulij kijanki, umieszczając je w 0,02% mesylanu trikainy w 0,1-krotnym roztworze Bartha i sprawdź, czy zwierzęta nie reagują, odwracając je do góry nogami. Aby wykonać operację przecięcia rdzenia kręgowego, użyj łyżki stołowej i kleszczy, aby umieścić znieczuloną kijankę w stadium 50 grzbietową do góry na mokrym kawałku gazy w górnej połowie szklanej szalki Petriego.Następnie za pomocą nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji należy wykonać nacięcie skóry i mięśni grzbietowych na poziomie środkowej części klatki piersiowej. W przypadku zwierząt pozorowanych należy upewnić się, że rozmiar nacięcia wynosi tylko 0,2 milimetra i nie uszkadza rdzenia kręgowego. U zwierząt, u których dokonano transektu, wykonaj drugie nacięcie o długości 0,2 milimetra, aby w pełni przeciąć rdzeń kręgowy.Po operacji przenieś kijanki do zbiornika zawierającego 500 mililitrów 0,1-krotnego roztworu Bartha z jednorazową penicyliną i streptomycyną o gęstości od 10 do 12 kijanek na zbiornik. Utrzymuj transektowane i kontroluj kijanki pozorne w oddzielnych zbiornikach. Utrzymuj kijanki z napowietrzeniem w temperaturze od 20 do 21 stopni Celsjusza.Zmieniaj roztwór Bartha z antybiotykami co drugi dzień aż do końca eksperymentu. Zacznij karmić kijanki dzień po operacji i wyeliminuj martwe zwierzęta. Do testu pływania należy zaopatrzyć się w pudełko z oświetleniem LED od wewnątrz, pokryte przezroczystym arkuszem polistyrenu przepuszczającym światło, a następnie zainstalować kamerę nad skrzynką LED.Następnie umieść szalkę Petriego o średnicy 15 centymetrów na pudełku wypełnionym 100 mililitrami 0,1-krotnego roztworu Bartha. Jednego dnia po przecięciu umieść kijankę na szalce Petriego i pozostaw ją na pięciominutowy okres adaptacji. Po adaptacji rozpocznij nagrywanie wideo zachowania podczas swobodnego pływania za pomocą oprogramowania referencyjnego przez pięć minut.Po zakończeniu filmu przenieś kijankę z powrotem do zbiornika. Ten reprezentatywny wykres punktowy pokazuje odzyskiwanie funkcji motorycznych w czasie. Pięć dni po przecięciu kijanki przepłynęły średnio 0,7 metra w ciągu pięciu minut, wykazując zmniejszoną zdolność pływania.Pojemność ta rosła wraz z upływem dni, wykazując średnio 2,1 metra w ciągu pięciu minut po 10 dniach i 3,1 metra w ciągu pięciu minut po 15 dniach od przecięcia. Całkowite odzyskanie zdolności pływackich zaobserwowano po 20 dniach od przecięcia, ze średnią 5,7 metra w ciągu pięciu minut. Średnia pływania może się różnić w zależności od każdej partii zwierząt.W związku z tym grupa eksperymentalna powinna być zawsze porównywana z odpowiednimi kontrolami i nie uzyskanymi wcześniej danymi. Po operacji zwierzęta mogą być wykorzystywane do analiz globalnych, w tym transkryptomiki, proteomiki i metabolomiki, a także do badań przesiewowych w poszukiwaniu związków, które hamują lub promują regenerację rdzenia kręgowego, w celu opracowania nowych podejść terapeutycznych.

spinal-cord-transection-in-xenopus-laevis-tadpoles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Demonstracja izolacji rdzenia kręgowego noworodka myszy do badań elektrofizjologicznych.

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego

Matryce fibrynowe zawierające czynniki wzrostu zostały użyte do zatrzymania przeszczepionych nerwowych komórek macierzystych w miejscach całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego. Przeszczepione komórki całkowicie wypełniły jamę chorobową i zróżnicowały się w wiele typów komórek nerwowych, w tym neurony, które rozciągały aksony do rdzenia kręgowego gospodarza na duże odległości.

Promowanie przeżycia i różnicowania nerwowych komórek macierzystych z koktajlami fibryny i czynnika wzrostu po ciężkim urazie rdzenia kręgowego

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Minogi odzyskują lokomocję po całkowitym urazie rdzenia kręgowego. Jednak niektóre neurony projekcji rdzeniowej są dobrymi regeneratorami, a inne nie. W artykule przedstawiono techniki przetrzymywania larw minoga morskiego (i niedawno przekształconych osobników dorosłych), wytwarzania kompletnych przekrojów rdzenia kręgowego oraz przygotowania całych mózgów i rdzeni kręgowych do hybrydyzacji in situ.

Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego

Ten artykuł opisuje technikę wprowadzania pustego przewodu między kikuty rdzenia kręgowego po całkowitym przecięciu i wypełnieniu komórkami Schwanna (SC) oraz wstrzykiwalną macierzą błony podstawnej w celu wypełnienia i wspomagania regeneracji aksonów w poprzek szczeliny.

Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki

Kijanki Xenopus oferują unikalną platformę do badania funkcji układu nerwowego in vivo. Opisano metodologie oceny przetwarzania informacji węchowych u żywych larw Xenopus w normalnych warunkach chowu lub po urazie.

Ocena funkcjonalna szlaków węchowych u żyjących kijanek ksenopusa

Hemisekcja kręgosłupa piersiowego u szczurów jest cennym i powtarzalnym modelem jednostronnego uszkodzenia rdzenia kręgowego do badania neuronalnych mechanizmów regeneracji lokomotorycznej i skuteczności leczenia. Ten artykuł zawiera szczegółowy przewodnik krok po kroku, jak wykonać zabieg hemisekcji i ocenić sprawność lokomotoryczną na arenie na otwartym boisku.

Operacja hemisesekcji rdzenia kręgowego klatki piersiowej i ocena lokomotoryczna w otwartym polu u szczura

Ten manuskrypt przedstawia protokoły chirurgicznego zadawania kontrolowanych i ostrych uszkodzeń rdzenia kręgowego regeneracyjnemu aksolotlowi (Ambystoma mexicanum).

Stłuczenie Uszkodzenie rdzenia kręgowego poprzez mikrochirurgiczną laminektomię w regeneracyjnym aksolotlu

Ten protokół opisuje, jak stworzyć precyzyjną laminektomię do indukcji stabilnego uszkodzenia rdzenia kręgowego typu transsection w modelu mysim, z minimalnymi szkodami ubocznymi dla badań nad uszkodzeniem rdzenia kręgowego.

Indukcja całkowitego uszkodzenia rdzenia kręgowego typu transsection u myszy

Obecny protokół opisuje metodę wywoływania specyficznych tkankowo i wysoce powtarzalnych urazów u larw danio pręgowanego za pomocą laserowego systemu uszkodzeń połączonego z automatyczną platformą mikroprzepływową do obsługi larw.

Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Tutaj opisujemy nową, szybką technikę modelowania uszkodzenia otwartego rdzenia kręgowego u szczurów, która eliminuje laminektomię. Hemisekcję boczną wykonuje się podczas oglądania przez mikroskop. Technika ta jest wszechstronna i może być również stosowana w odcinku szyjnym, piersiowym i lędźwiowym rdzenia kręgowego innych zwierząt.

Minimalnie inwazyjna, szybka technika hemisekcji bocznej rdzenia kręgowego do modelowania otwartych urazów rdzenia kręgowego u szczurów

Poznaj metodę przecięcia rdzenia kręgowego u kijanek Xenopus laevis, która naśladuje urazy u ludzi. Technika ta pozwala badać mechanizmy regeneracji i identyfikować nowe cele terapeutyczne.

Przecięcie rdzenia kręgowego u kijanek Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów