Szybka analiza wideomikroskopii w diagnostyce pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek
19 stycznia 2022
Szybka analiza mikroskopii wideo jest stosunkowo łatwym do przeprowadzenia, szybkim, opłacalnym i, w doświadczonych rękach, znacznie niezawodnym narzędziem do diagnostyki pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek, które powinno być dostępne w każdym ośrodku zajmującym się diagnostyką i leczeniem ciężkich chorób płuc.
Szybka analiza wideomikroskopii jest niezawodnym narzędziem do diagnostyki pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek. Ta technika jest stosunkowo łatwa do wykonania, szybka, opłacalna, a w doświadczonych rękach jest bardzo niezawodnym narzędziem. I ma zastosowanie do pacjentów we wszystkich grupach wiekowych.
Wideomikroskopia ujawnia również drugorzędową funkcję rzęsek. Na przykład z powodu infekcji bakteryjnych lub wirusowych. Ale jest stosowany głównie do diagnozowania pierwotnej dyskinezy rzęsek.
Naukowcy wykorzystują tę metodę również do wizualizacji procesów wewnątrzkomórkowych lub funkcji biologicznych w żywych komórkach. W tej procedurze będzie mi pomagała Pani Tina Peromaa, nasz technik laboratoryjny.
Przed pobraniem komórek nabłonka oddechowego należy poprosić pacjenta o dokładne wydmuchanie nosa. Kiedy pacjent jest gotowy, jedną ręką trzymaj głowę pacjenta nieruchomo, a drugą ręką użyj szczoteczki międzyzębowej o rozmiarze 0,6 milimetra, aby wyszczotkować dolną małżowinę nosa, aby zebrać wystarczającą ilość pasków komórek nabłonkowych. Wrzuć zebrane paski komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej DMEM odżywiany komórkami.
Po zamknięciu pokrywy probówki do mikrowirówki przyłóż probówkę do źródła światła i potrząśnij probówką, aby odkryć zebrane paski komórek i konglomeraty. Później umieść probówki do mikrowirówek z prawidłowo zamkniętymi pokrywkami w pudełku styropianowym. Przed szczelnym zamknięciem pudełka upewnij się, że rurki są zamocowane wewnątrz pudełka.
Następnie dodaj zimny okład do pudełka, unikając zamrażania próbki. Po wyjęciu probówek mikrowirówek zawierających próbki z pudełka polistyrenowego, umieść jedną probówkę pod osłoną urządzenia grzewczego mikroskopu, aby rozgrzała się do 37 stopni Celsjusza w celu szybkiej analizy wideomikroskopii lub HSVMA. Następnie uruchom kamerę i oprogramowanie modułu wideo na komputerze.
Za pomocą pipety pobrać małą próbkę i umieścić dwie krople próbki w kuwecie. Przykryj kuwetę pokrywką przed umieszczeniem jej pod mikroskopem. Użyj olejowej soczewki immersyjnej o powiększeniu 100x i nałóż kroplę olejku immersyjnego na powierzchnię optyki.
Zbliżając się do dna naczynia z soczewką mikroskopu, szukaj skupisk komórek bez czerwonych krwinek i o niskiej zawartości śluzu. Po znalezieniu reprezentatywnego obszaru zainteresowania lub ROI, skup się na jednej grupie bijących rzęsek z największymi ruchami rzęsek i nagraj sekwencję wideo. Nagraj komórki, w których biją rzęski na boki i od góry.
Reprezentatywna analiza pokazuje normalne ruchy rzęsek widziane na boki i z góry. Próbka pacjenta z pierwotną dyskinezą rzęsek lub PCD z mutacją w genie DNAH11 wykazała klasyczny, sztywny, minimalnie poruszający się wzorzec uderzenia rzęsek. Patrząc z boku i z góry.
U innego pacjenta z PCD z tą samą mutacją zaobserwowano inny, hiperkinetyczny, ale nieefektywny wzór bicia rzęsek. Patologiczny wzorzec pośladków rzęsek i częstotliwość uderzeń rzęsek zaobserwowano również u pacjenta z nawracającymi infekcjami górnych dróg oddechowych. Jeśli procedura szczotkowania jest przeprowadzana rygorystycznie, analiza HSVMA nie może być przeprowadzona, ponieważ komórki nabłonka rzęskowego były pokryte powłoką czerwonych krwinek.
Najważniejszym krokiem w procedurze jest pobranie wystarczającej ilości komórek oddechowych ze szczotkowania i utrzymanie tego materiału dobrze zachowanego do analizy wideo. Pozostały materiał można wykorzystać do wykonania mikroskopii elektronowej lub mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu wykrycia ewentualnych wad strukturalnych rzęsek lub ujawnienia wad i syntezy białek rzęskowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Analiza za pomocą wysokoprzepustowej mikroskopii wideo jest niezawodnym i kosztowo efektywnym narzędziem diagnostyki pierwotnej dyskinezji rzęsek. Jest ona łatwa w wykonaniu i możliwa do zastosowania we wszystkich grupach wiekowych, co czyni ją niezbędną w ośrodkach leczniczych zajmujących się ciężkimi chorobami płuc.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Medycyna oddechowa
- Techniki diagnostyczne
Wstęp
- Pierwotna dyskinezja rzęsek jest schorzeniem wpływającym na funkcję rzęsek.
- Wideo-mikroskopia wysokich prędkości pozwala na analizę pierwotnej i wtórnej funkcji rzęsek.
- Technika ta jest szczególnie przydatna w diagnostyce problemów oddechowych związanych z dysfunkcją rzęsek.
- Dla klinicystów istotny jest dostęp do wiarygodnych narzędzi diagnostycznych.
Cel badania
- Ocena skuteczności wysokichprędkościowej wideomikroskopii w diagnostyce pierwotnego dyskinezyjnego zaburzenia rzęsek.
- Ocena przydatności tej techniki w różnych grupach wiekowych pacjentów.
- Podkreślenie znaczenia tego narzędzia diagnostycznego w warunkach klinicznych.
Zastosowane metody
- Analiza za pomocą wysokofrazowej mikroskopii wideo.
- Ocena ruchu i funkcji rzęsek.
- Porównanie wyników w różnych grupach demograficznych pacjentów.
- Ocena wtórnej funkcji rzęsek w związku z infekcjami.
Główne wyniki
- Wysokoprzędkościowa mikroskopia wideo jest skuteczną metodą diagnostyki pierwotnego dyskinezji rzęsek.
- Technika ta jest niezawodna, gdy jest wykonywana przez doświadczony personel.
- Umożliwia ona uzyskanie informacji na temat wtórnej funkcji rzęsek.
- Metoda ta jest stosowalna u pacjentów w każdym wieku, co zwiększa jej użyteczność w praktyce klinicznej.
Wnioski
- Wysokoprędkościowa mikroskopia wideo powinna stać się standardowym narzędziem diagnostycznym w medycynie oddechowej.
- Łatwość obsługi i niezawodność sprawiają, że nadaje się ona do diagnostyki pierwszego rzutu.
- Szeroka dostępność tej metody może poprawić wyniki leczenia pacjentów z ciężkimi chorobami płuc.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza wideo-mikroskopowa o wysokiej prędkości (HSVMA) stanowi szybką i kosztowo efektywną metodę diagnostyki pierwszego rzutu w przypadku pierwotnego dyskinezy rzęsek (PCD), rzadkiego zaburzenia genetycznego wpływającego na oczyszczanie śluzowo-rzęskowe. Umożliwiając bezpośrednią wizualizację wzorców uderzeń rzęsek w żywych komórkach nabłonka oddechowego, HSVMA wspiera wczesne wykrywanie i zmniejsza zależność od bardziej zasobochłonnych technik, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa. Możliwość ta zwiększa przepustowość diagnostyczną w ośrodkach pulmonologicznych i centrach chorób rzadkich, ułatwiając szybką interwencję i ograniczając długoterminowe powikłania płucne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną ocenę ruchliwości rzęsek w komórkach pochodzących od pacjentów, wspierając walidację celów w badaniach nad ciliopatiami.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny odczyt służący do oceny interwencji genetycznych lub farmakologicznych w zakresie funkcji rzęsek.
- Wartość prognostyczna: Pozwala odróżnić defekty strukturalne od funkcjonalnych, co zwiększa pewność w stawianiu hipotez mechanistycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje dane ilościowe dotyczące częstotliwości uderzeń rzęsek i kształtu fali w celu standaryzacji testu.
- Wartość operacyjna: Wspiera opracowywanie zestandaryzowanych protokołów obrazowania żywych komórek w modelach chorób układu oddechowego.
- Skalowalność: Umożliwia wysokoprzepustową analizę dynamiki rzęsek w wielu próbkach pacjentów lub wariantach genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki in vitro z fenotypami klinicznymi poprzez korelację wyników HSVMA z ciężkością choroby.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Identyfikuje funkcjonalną naprawę w modelach przedklinicznych poprzez przywrócenie prawidłowego ruchu rzęsek.
- Zgodność z biomarkerami: Dostarcza funkcjonalnych odczytów, które uzupełniają biomarkery strukturalne lub molekularne w PCD.
Integracja potoku i przepływu pracy
HSVMA wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną – oferując funkcjonalny test do rozwoju terapii celowanych w rzęski.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących genów zaangażowanych w montaż i ruchliwość rzęsek, takich jak DNAH11.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych odczytów w czasie rzeczywistym, odpowiednich do przesiewania związków w modelach ciliopatii.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie parametrów bicia rzęsek w różnych warunkach, wspierając podejmowanie decyzji w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy komórkowe z wynikami klinicznymi, pomagając w przejściu z fazy przedklinicznej do klinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny funkcji rzęsek w różnych modelach chorób układu oddechowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez zapewnienie bezpośredniej wizualizacji dynamiki rzęsek w natywnych kontekstach komórkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym protokołom pobierania próbek, utrwalania i obrazowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go w walidacji celów poprzez potwierdzenie funkcjonalnej istotności trafień genetycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w ciliopatiach z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dowody funkcjonalnego ratowania fenotypu.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie pobierania komórek, obsługi mikroskopu i analizy wideo w celu zapewnienia dokładnej interpretacji.
- Zależne od systemów wysokichprędkościowej mikroskopii wideo z optyką imersyjną olejową i kontrolą środowiskową.
- Wymaga standaryzacji procedur obchodzenia się z próbkami w celu zapobiegania kontaminacji lub degradacji.
- Adaptacja w różnych systemach modelowych może wymagać optymalizacji warunków hodowli i parametrów obrazowania.
- Ograniczone koniecznością pozyskania żywotnych, niekontaminowanych próbek nabłonka; obecność erytrocytów lub śluzu może utrudniać analizę.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Collection and Transport of Respiratory Epithelial Cells
2:20
High-Speed Video Microscopy Analysis (HSVMA)
3:43
Results: Analysis of Ciliary Motion in Healthy Individual and Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) Patients
4:49
Conclusion
