Name: Szybka analiza wideomikroskopii w diagnostyce pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 32 s
Description: Poznaj szybką analizę wideomikroskopii w diagnostyce pierwotnej dyskinezy rzęsek. Ta niezawodna metoda pozwala ocenić funkcję rzęsek u pacjentów w każdym wieku i wykryć zarówno pierwotne, jak i wtórne zaburzenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy wyrazić szczególne podziękowania dla pielęgniarki pediatrycznej, Pani Johanny Juvankoski, za jej doskonałą pomoc przy szczotkowaniu. Szczególne podziękowania kierujemy również do profesora Heymuta Omrana (Klinika Uniwersytecka w Münster, UKM) za udzielenie zgody na wykorzystanie schematycznego rysunku normalnego ruchu rzęsek z ich strony internetowej. Na koniec chcielibyśmy podziękować Panu Alanowi Brownowi BA (z wyróżnieniem), PGCE, za korektę manuskryptu.

Oświadczenie etyczne:
Badanie to zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną (69/2017) i przeprowadzono je zgodnie z deklaracją helsińską.
1. Pobieranie i transport komórek nabłonka dróg oddechowych
<ol>
	<li>Szczotkowanie
	<ol>
		<li>Przed szczotkowaniem podaj pacjentowi dwutygodniową dawkę doustnego amoksycyliny z kwasem klawulanowym w celu wyeliminowania biofilmu zakłócającego funkcję rzęsek. Upewnij się, że antybiotykoterapia zostanie zakończona 2 dni przed procedurą.</li>
		<li>Aby zmniejszyć ilość warstwy materiału śluzowego na pobranych pasmach komórek nabłonkowych, poproś pacjenta o dokładne wydmuchanie nosa. W przypadku małych dzieci poproś rodziców o pomoc w wydmuchaniu nosa.</li>
		<li>Do szczotkowania użyj szczoteczki międzyzębowej o rozmiarze 0,6 mm (patrz Tabela Materiałów). Jedną ręką unieruchom głowę pacjenta, a drugą szczotkuj małżowinę nosową dolną w obu nozdrzach, aby zebrać wystarczającą ilość pasm komórek nabłonkowych. 
		UWAGA: Podczas głębokiego wprowadzania szczoteczki międzyzębowej pod małżowinę dolną zazwyczaj odczuwalny jest lekki opór. Szczotkowanie nosa wykonuje się poprzez szybkie obracanie i pobieranie przez około 2 s. Dłuższe i intensywne szczotkowanie mogłoby spowodować poważne uszkodzenie nabłonka i następujący po nim epistaxis.</li>
		<li>Jeśli planowana jest bronchoskopia z przyczyn innych niż podejrzenie PCD, pobierz próbki podczas bronchoskopii poprzez szczotkowanie karyny lub nabłonka oskrzeli lub poprzez biopsję13.</li>
		<li>Umieść pobrane pasma komórek w probówce do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL zawierającej pożywkę Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM). 
		UWAGA: Pasma komórek nabłonkowych zazwyczaj łatwiej oddzielają się od szczoteczki poprzez potrząsanie i obracanie szczoteczki o ściankę probówki.</li>
		<li>Zamknij pokrywkę probówki do mikrowirowania i przyłóż ją do źródła światła. Potrząśnij probówką, aby zidentyfikować pobrane pasma i konglomeraty komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transport materiału
	<ol>
		<li>Umieść probówki do mikrowirowania w szczelnie zamkniętym pudełku polistyrenowym; upewnij się, że pokrywki probówek są prawidłowo zamknięte, a probówki są stabilne wewnątrz pudełka.</li>
		<li>Dodaj wkład chłodzący, unikając jednak zamrażania materiału. 
		UWAGA: Optymalna temperatura przechowywania materiału przed badaniem wynosi około 4-8 °C (39,2-46,4 °F).</li>
		<li>Upewnij się, że zabezpieczone próbki zostaną poddane analizie w ciągu następnych 24 h. 
		UWAGA: W tych eksperymentach średni czas pomiędzy szczotkowaniem a HSVMA wynosił 3 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza za pomocą szybkozdejmującej mikroskopii wideo (HSVMA)
<ol>
	<li>Mikroskopia wideo próbek
	<ol>
		<li>Po otrzymaniu probówek do mikrowirówki zawierających próbki, ogrzej je do 37 °C (98.6 °F), aby odtworzyć optymalne warunki zbliżone do in vivo.</li>
		<li>Jeśli mikroskop jest wyposażony w moduł grzewczy, umieść probówki pod osłoną i ogrzej je w tym miejscu. Alternatywnie, do ogrzania próbek można użyć inkubatora.</li>
		<li>Uruchom kamerę oraz oprogramowanie jednostki wideo na komputerze PC.</li>
		<li>Za pomocą pipety pobierz niewielką ilość próbki i nanieś dwie krople do kuwety lub szkiełka nakrywkowe z dna szklanego (patrz Tabela materiałów). Przykryj kuwetę lub szkiełko pokrywką i umieść pod mikroskopem.</li>
		<li>Do oceny próbek użyj mikroskopu z kontrastem różnicowym (DIC), wyposażonego w chłodne źródło światła i kamerę wideo zdolną do rejestracji z wysoką prędkością (co najmniej 200 klatek/s). Użyj obiektywu imersyjnego o powiększeniu 100x i nanieś kroplę oleju imersyjnego na powierzchnię optyki. 
		UWAGA: Zaleca się stosowanie mikroskopów z obiektywem zbliżającym się od dołu.</li>
		<li>Zbliż obiektyw mikroskopu do dna szkiełka i wyszukaj skupiska komórek pozbawione erytrocytów i o niskiej zawartości śluzu. Po znalezieniu reprezentatywnego obszaru zainteresowania (ROI), ustaw ostrość na jedną konkretną grupę bijących rzęsek z najsilniejszymi ruchami i zarejestruj sekwencję wideo. Nagraj komórki z bijącymi rzęskami z boku oraz z góry. Następnie wyszukaj kolejne reprezentatywne skupisko komórek i powtórz nagrywanie. 
		UWAGA: Komórki pokryte rzęskami należy badać przy powiększeniu 1,000x, a bijące rzęski należy rejestrować za pomocą cyfrowej kamery wideo o wysokiej prędkości (DHSV) ustawionej na częstotliwość od 200 klatek/s wzwyż (w tym protokole 256/s). Ponieważ dane uzyskane z nagranych klipów wideo wymagają dużej ilości miejsca na dysku twardym, zaleca się stosowanie zewnętrznego dysku SSD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza sekwencji wideo
	<ol>
		<li>Aby wyznaczyć CBF i CBP, odtwórz klipy wideo klatka po klatce.</li>
		<li>Aby wyznaczyć CBF, ustaw prędkość odtwarzania w zwolnionym tempie na 15 klatek/s i odlicz 10 kolejnych uderzeń.</li>
		<li>Zapisz liczbę klatek, które upłynęły podczas jednego cyklu 10 uderzeń, i podstaw wynik do równania (1). Wyznacz częstotliwość obliczając średnią ze wszystkich zarejestrowanych cykli uderzeń rzęsek i porównaj wynik z wartościami referencyjnymi dla wieku (patrz Tabela 1)14. 
		<img alt="Wzór na Hz, Hz=10/(X/256), wyrażenie matematyczne, obliczenia fizyczne, zastosowanie edukacyjne." src="/files/ftp_upload/63292/63292eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> (1) 
		Gdzie X to liczba klatek, które upłynęły podczas cyklu 10 uderzeń.</li>
		<li>W celu oceny CBP sprawdź, czy ruch bijących rzęsek odbywa się w pełnym zakresie (patrz Rysunek 1) i jest zsynchronizowany. Aby zapobiec błędowi selekcji, oceny CBP powinni dokonać dwaj niezależni operatorzy.</li>
		<li>Wyniki analizy HSVMA należy zaraportować jako zgodne, mało prawdopodobne lub niejednoznaczne w kontekście PCD.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia.</a> Cilia. 4 (1), 2(2015).</li>
<li>Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ciliary+dyskinesia%3A+An+update+on+clinical+aspects%2C+genetics%2C+diagnosis+and+future+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 135(2017).</li>
<li>Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+novel+mutations+in+the+DNAH11+gene+in+primary+ciliary+dyskinesia+%28CILD7%29+with+considerable+variety+in+the+clinical+and+beating+cilia+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype.</a> BMC Medical Genetics. 21 (1), 237(2020).</li>
<li>Knowles, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+DNAH11+in+patients+with+primary+ciliary+dyskinesia+with+normal+ciliary+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure.</a> Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).</li>
<li>Boon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ciliary+dyskinesia%3A+critical+evaluation+of+clinical+symptoms+and+diagnosis+in+patients+with+normal+and+abnormal+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11(2014).</li>
<li>Kouis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+primary+ciliary+dyskinesia+in+consecutive+referrals+of+suspected+cases+and+the+transmission+electron+microscopy+detection+rate%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis.</a> Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).</li>
<li>Marthin, J. K., Nielsen, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+nasal+nitric+oxide+technique+as+first-line+test+for+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).</li>
<li>Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+diagnostic+testing+in+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).</li>
<li>Lucas, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+Respiratory+Society+guidelines+for+the+diagnosis+of+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090(2017).</li>
<li>Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERS+and+ATS+diagnostic+guidelines+for+primary+ciliary+dyskinesia%3A+similarities+and+differences+in+approach+to+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis.</a> European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066(2019).</li>
<li>Kouis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effectiveness+analysis+of+three+algorithms+for+diagnosing+primary+ciliary+dyskinesia%3A+a+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142(2019).</li>
<li>Rubbo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+high-speed+video+analysis+to+diagnose+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia.</a> Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).</li>
<li>Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+technique+to+diagnose+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia.</a> The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).</li>
<li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+cilia+and+ciliated+epithelial+ultrastructure+in+healthy+children+and+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults.</a> Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).</li>
<li>Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+methods+in+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Paediatric+Respiratory+Reviews%22%5BJournal%5D)">Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia.</a> Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).</li>
<li>Ballenger, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+effect+of+cigarette+smoke+on+human+respiratory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia.</a> New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).</li>
<li>Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cigarette+smoking+on+nasal+mucociliary+clearance+and+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency.</a> Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).</li>
<li>Kobbernagel, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+azithromycin+maintenance+therapy+in+primary+cilia+dyskinesia+%28BESTCILIA%29%3A+a+multicentre%2C+double-blind%2C+randomised%2C+placebo-controlled+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial.</a> Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).</li>
<li>Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+macrolide+antibiotics+on+ciliary+motility+in+rabbit+airway+epithelium+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).</li>
<li>Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+cells+harvested+with+nasal+brushing%3A+a+method+for+evaluating+ciliary+function%5BTitle%5D)+AND+%22Rhinology%22%5BJournal%5D)">Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function.</a> Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).</li>
<li>Pifferi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+cell+culture+method+for+the+diagnosis+of+atypical+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia.</a> Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).</li>
<li>Hirst, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+primary+ciliary+dyskinesia+epithelial+cells+at+air+liquid+interface+can+alter+ciliary+phenotype+but+remains+a+robust+and+informative%2C+diagnostic+aid%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid.</a> PLoS One. 9 (2), 89675(2014).</li>
<li>Papon, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ciliary+beating+in+primary+ciliary+dyskinesia%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78(2012).</li>
<li>Smith, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+FA%3A+a+research+tool+for+automated%2C+high-throughput+measurement+of+ciliary+beat+frequency+using+freely+available+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software.</a> Cilia. 1 (8), 14(2012).</li>
<li>Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliar+Move%3A+new+software+for+evaluating+ciliary+beat+frequency+helps+find+novel+mutations+by+a+Portuguese+multidisciplinary+team+on+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792(2021).</li>
<li>Mullowney, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ciliary+dyskinesia+and+neonatal+respiratory+distress%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress.</a> Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).</li>
<li>Leigh, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+nasal+nitric+oxide+measurement+as+a+test+for+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia.</a> Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisano i omówiono proces diagnostyki PCD za pomocą HSVMA w świetle diagnostyki pierwszego rzutu. Pomimo tego, że jest stosunkowo łatwa do ustalenia, opłacalna11 i niezawodna metoda w doświadczonych rękach12, HSVMA nie jest środkiem diagnostycznym pozbawionym pułapek. Nieprawidłowe CBF i CBP mogą być spowodowane wtórnym zakażeniem, prowadzącym do zapalenia nabłonka oskrzelowo-oddechowego15 i z tego samego powodu osoby palące mogą mieć n...

Pierwotna dyskineza rzęsek (PCD) jest rzadką, dziedziczną chorobą genetyczną, która powoduje zaburzenia w ruchu rzęsek bijących. Jeśli nie zostanie zdiagnozowana, prowadzi do poważnego uszkodzenia płuc w późniejszym życiu z powodu ciężkiego upośledzenia MCC. W przeszłości jego rozpowszechnienie szacowano na zakres od 1:4 000 do 50 000. Ze względu na stale poprawiającą się diagnostykę i rosnącą świadomość tego schorzenia, aktualizacje dotyczące częstości występowania PCD sugerują, że może ona być znacznie bardziej powszechna i prawdopodobnie w zakresie od 1:4 000 do 20 000 zamiast1,2. Jednak pacjenci z PCD są nadal niedostatecznie diagnozowani lub diagnozowani zbyt późno1,3. W związku z tym niemowlęta z wrodzoną lokalizacją wrodzoną i/lub heterotaksją lub okołoporodowym wyciekiem z nosa, niewydolnością oddechową noworodków, zatkanym nosem i trudnościami w karmieniu powinny być podejrzane o PCD. W późniejszym życiu przewlekłe zapalenie ucha, nawracające zapalenie płuc, zapalenie zatok przynosowych i zatok przynosowych oraz przewlekły, typowy mokry kaszel spowodowany upośledzonym MCC są charakterystycznymi objawami PCD, które w połączeniu z rozstrzeniem oskrzeli i upośledzoną czynnością płuc utrzymują się w wieku dorosłym2. 
Pacjenci z podejrzeniem PCD mogą być diagnozowani za pomocą różnych narzędzi diagnostycznych. W przeszłości TEM był uważany za złoty standard w diagnostyce pierwszego rzutu. Jednak do 30% przypadków PCD nie wykazuje nieprawidłowej ultrastruktury1,3,4,5,6, co wymaga innego podejścia diagnostycznego. Dlatego coraz więcej ośrodków i wytyczne Europejskiego Towarzystwa Chorób Układu Oddechowego (ERS) sugerują połączenie nosowego tlenku azotu (nNO) i HSVMA jako diagnostyki pierwszego rzutu1,7,9,10. HSVMA i nNO są również najbardziej opłacalnymi opcjami identyfikacji pacjenta z PCD11. Jednak nawet gdyby badania genetyczne zostały włączone do diagnostyki, należy pamiętać, że obecnie nie ma samodzielnego testu lub kombinacji testów, które mogłyby wykluczyć PCD ze 100% pewnością8,9,10. 
Spośród dostępnych opcji diagnostycznych, HSVMA jest jedynym testem, który skupia się na żywych, pokrytych rzęskami komórkach oddechowych i ocenia wzorzec dudnienia rzęsek (CBP) oraz częstotliwość uderzeń rzęsek (CBF). W przeciwieństwie do TEM, wyniki HSVMA są dostępne szybko, zwykle w dniu badania, podczas gdy wyniki TEM mogą nadejść kilka miesięcy po pobraniu próbki. HSVMA może być stosowany we wszystkich grupach wiekowych, podczas gdy nNO wymaga wysokiego stopnia zgodności; Próby użycia go poniżej 5 roku życia zwykle kończą się niepowodzeniem10. W doświadczonych rękach HSVMA ma doskonałą czułość i swoistość do diagnozowania PCD odpowiednio na poziomie 100% i 96%12.
Ten artykuł opisuje krok po kroku procedurę przeprowadzania HSVMA, w tym pobieranie pokrytych rzęskami komórek oddechowych z dolnej małżowiny nosa, przechowywanie pobranych komórek w pożywce odżywczej dla komórek w celu transportu do miejsca badania, oraz proces mikroskopowej analizy wideo w celu określenia CBF i CBP. Dodatkowo pokazano kilka klipów wideo od pacjentów, porównujących normalne CBP i CBF z nieprawidłową funkcją rzęsek (Wideo 3, Wideo 4, Wideo 5, Wideo 6, Wideo 7 i Wideo 8).

<table><tbody><tr><td>Kwas amoksycylino-klawulanowy</td><td>Orion Oyj</td><td></td><td>40 mg/kg podzielony na 2 dawki/dobę, dla dorosłych 875/125 mg 1 tabletka x2/dzień</td></tr><tr><td>Oprogramowanie kamery</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>HCI</td></tr><tr><td>Obraz Zimny pakiet</td><td>dowolny</td><td></td><td>do konserwacji i transportu</td></tr><tr><td>Mikroskop interferencji różnicowej</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Odwrócony, mikroskop obserwatora komórek</td></tr><tr><td>Digitial High Szybka kamera wideo</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>Orca Flash 4.0, kamera cyfrowa typ C11440</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s Zmodyfikowana pożywka do</td><td>hodowli komórkowych</td><td>Eagle Thermo Fisher</td><td>10565018</td></tr><tr><td>Probówka Eppendorf Probówka</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1,5 ml Naczynie</td></tr><tr><td>mikrodołkowe ze szklanym dnem</td> Kuweta <td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>do mikroskopii</td></tr><tr><td>Jednostka grzewcza</td><td>Carl Zeiss/PeCon</td><td>810-450001</td><td>Elementy inkubacyjne Carl Zeiss z regulatorem</td></tr> <tr><td>temperatury PeCon TempModule S1Szczoteczka międzyzębowa 0,6 mm</td><td>Doft</td><td>872267</td><td>Szczoteczka międzyzębowa na długim drucie z rączką wielokrotnego użytku i nasadką w woreczku strunowym</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>100x/1,46, &alpha; Obiektyw Plan-Apochromat DIC</td></tr><tr><td>Małe pudełko polistyrenowe z pokrywką</td><td>dowolną</td><td></td><td>do transportu</td></tr></tbody></table>

szybka analiza wideomikroskopii w diagnostyce pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek

High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

Pierwotna dyskineza rzęsek (PCD) jest wrodzoną chorobą dziedziczoną głównie w autosomalnej cesywnej charakterystyce. Zaburzenie powoduje zaburzenia ruchu rzęsek, prowadząc do ciężkiego upośledzenia klirensu śluzowo-rzęskowego (MCC). Jeśli nie zostanie zdiagnozowany lub zostanie zdiagnozowany zbyt późno, stan ten prowadzi do rozwoju rozstrzeni oskrzeli i poważnego uszkodzenia płuc w późniejszym życiu. Większość metod diagnozowania PCD jest czasochłonna i wymaga znacznych zasobów ekonomicznych w celu ich ustalenia. Szybka analiza wideomikroskopii (HSVMA) jest jedynym narzędziem diagnostycznym do wizualizacji i analizy żywych komórek układu oddechowego z bijącymi rzęskami in vitro. Jest szybki, ekonomiczny i w doświadczonych rękach bardzo niezawodny jako narzędzie diagnostyczne PCD. Ponadto klasyczne środki diagnostyczne, takie jak transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), nie mają zastosowania w przypadku niektórych mutacji, ponieważ zmiany morfologiczne są nieobecne. 
Ten artykuł opisuje proces pobierania komórek nabłonka oddechowego, dalsze przygotowanie próbki oraz proces HSVMA. Opisujemy również, w jaki sposób szczotkowane komórki mogą być z powodzeniem utrzymywane w stanie nieuszkodzonym i bijącym, przechowując je w pożywce odżywczej do przechowywania i transportu do miejsca badania w przypadkach, gdy klinika nie posiada sprzętu do wykonywania HSVMA. Pokazano również filmy z patologicznymi wzorcami bicia od pacjentów z mutacją w genie 11 łańcucha ciężkiego ramienia dyneiny (DNAH11), których nie można zdiagnozować za pomocą TEM; wynik niejednoznacznego HSVMA z powodu zakażenia górnych dróg oddechowych, a także nieudanego szczotkowania z nałożeniem czerwonych krwinek. Tym artykułem chcielibyśmy zachęcić każdą jednostkę zajmującą się pacjentami pulmonologicznymi i rzadkimi chorobami płuc do wykonywania HSVMA w ramach codziennej rutynowej diagnostyki w kierunku PCD lub wysłania próbek do ośrodka specjalizującego się w wykonywaniu HSVMA.

Wideo 1 i Wideo 2 przedstawiają normalną kontrolę, w której CBF i CBP mieszczą się w normie (patrz Rysunek 1). Wideo 3, Wideo 4, Wideo 5 i Wideo 6 reprezentują dwa przypadki pacjentów z PCD z homozygotyczną mutacją w genie DNAH11 (c.2341G &gt; A; p. Glu781Lys)3. Te reprezentatywne nagrania wybrano ze względu na fakt, że fenotypy mutacji w gen...

Szybka analiza mikroskopii wideo jest stosunkowo łatwym do przeprowadzenia, szybkim, opłacalnym i, w doświadczonych rękach, znacznie niezawodnym narzędziem do diagnostyki pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek, które powinno być dostępne w każdym ośrodku zajmującym się diagnostyką i leczeniem ciężkich chorób płuc.

Szybka analiza wideomikroskopii w diagnostyce pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the ...

Szybka analiza wideomikroskopii jest niezawodnym narzędziem do diagnostyki pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek. Ta technika jest stosunkowo łatwa do wykonania, szybka, opłacalna, a w doświadczonych rękach jest bardzo niezawodnym narzędziem. I ma zastosowanie do pacjentów we wszystkich grupach wiekowych.Wideomikroskopia ujawnia również drugorzędową funkcję rzęsek. Na przykład z powodu infekcji bakteryjnych lub wirusowych. Ale jest stosowany głównie do diagnozowania pierwotnej dyskinezy rzęsek.Naukowcy wykorzystują tę metodę również do wizualizacji procesów wewnątrzkomórkowych lub funkcji biologicznych w żywych komórkach. W tej procedurze będzie mi pomagała Pani Tina Peromaa, nasz technik laboratoryjny.Przed pobraniem komórek nabłonka oddechowego należy poprosić pacjenta o dokładne wydmuchanie nosa. Kiedy pacjent jest gotowy, jedną ręką trzymaj głowę pacjenta nieruchomo, a drugą ręką użyj szczoteczki międzyzębowej o rozmiarze 0,6 milimetra, aby wyszczotkować dolną małżowinę nosa, aby zebrać wystarczającą ilość pasków komórek nabłonkowych. Wrzuć zebrane paski komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej DMEM odżywiany komórkami.Po zamknięciu pokrywy probówki do mikrowirówki przyłóż probówkę do źródła światła i potrząśnij probówką, aby odkryć zebrane paski komórek i konglomeraty. Później umieść probówki do mikrowirówek z prawidłowo zamkniętymi pokrywkami w pudełku styropianowym. Przed szczelnym zamknięciem pudełka upewnij się, że rurki są zamocowane wewnątrz pudełka.Następnie dodaj zimny okład do pudełka, unikając zamrażania próbki. Po wyjęciu probówek mikrowirówek zawierających próbki z pudełka polistyrenowego, umieść jedną probówkę pod osłoną urządzenia grzewczego mikroskopu, aby rozgrzała się do 37 stopni Celsjusza w celu szybkiej analizy wideomikroskopii lub HSVMA. Następnie uruchom kamerę i oprogramowanie modułu wideo na komputerze.Za pomocą pipety pobrać małą próbkę i umieścić dwie krople próbki w kuwecie. Przykryj kuwetę pokrywką przed umieszczeniem jej pod mikroskopem. Użyj olejowej soczewki immersyjnej o powiększeniu 100x i nałóż kroplę olejku immersyjnego na powierzchnię optyki.Zbliżając się do dna naczynia z soczewką mikroskopu, szukaj skupisk komórek bez czerwonych krwinek i o niskiej zawartości śluzu. Po znalezieniu reprezentatywnego obszaru zainteresowania lub ROI, skup się na jednej grupie bijących rzęsek z największymi ruchami rzęsek i nagraj sekwencję wideo. Nagraj komórki, w których biją rzęski na boki i od góry.Reprezentatywna analiza pokazuje normalne ruchy rzęsek widziane na boki i z góry. Próbka pacjenta z pierwotną dyskinezą rzęsek lub PCD z mutacją w genie DNAH11 wykazała klasyczny, sztywny, minimalnie poruszający się wzorzec uderzenia rzęsek. Patrząc z boku i z góry.U innego pacjenta z PCD z tą samą mutacją zaobserwowano inny, hiperkinetyczny, ale nieefektywny wzór bicia rzęsek. Patologiczny wzorzec pośladków rzęsek i częstotliwość uderzeń rzęsek zaobserwowano również u pacjenta z nawracającymi infekcjami górnych dróg oddechowych. Jeśli procedura szczotkowania jest przeprowadzana rygorystycznie, analiza HSVMA nie może być przeprowadzona, ponieważ komórki nabłonka rzęskowego były pokryte powłoką czerwonych krwinek.Najważniejszym krokiem w procedurze jest pobranie wystarczającej ilości komórek oddechowych ze szczotkowania i utrzymanie tego materiału dobrze zachowanego do analizy wideo. Pozostały materiał można wykorzystać do wykonania mikroskopii elektronowej lub mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu wykrycia ewentualnych wad strukturalnych rzęsek lub ujawnienia wad i syntezy białek rzęskowych.

high-speed-video-microscopy-analysis-for-first-line-diagnosis-primary

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisana jest łatwa i niezawodna technika wizualizacji i ilościowego określania ruchliwości rzęsek w drogach oddechowych oraz przepływu generowanego przez rzęski za pomocą tchawicy myszy.  Technikę tę można zmodyfikować w celu określenia, w jaki sposób szeroki zakres czynników wpływa na ruchliwość rzęsek, w tym czynniki farmakologiczne, czynniki genetyczne, narażenie środowiskowe i/lub czynniki mechaniczne, takie jak obciążenie śluzem.

Ex vivo Metoda obrazowania w wysokiej rozdzielczości ruchliwości rzęsek w nabłonku dróg oddechowych gryzoni

W tym badaniu, szczegółowa technika mikroskopii świetlnej została zoptymalizowana do obserwacji i analizy ruchu rzęsek CPEC w czasie rzeczywistym ex vivo wraz z metodą mikroskopii elektronowej do analizy ultrastrukturalnej.

Obserwacja ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo

Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.

Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej

W tej publikacji opisujemy protokoły oceny klirensu śluzowo-rzęskowego dróg oddechowych (MCC) u myszy in vivo z wykorzystaniem obrazowania radionuklidów o podwójnej modalności. Protokół ten jest przeznaczony do tomografii komputerowej z emisją pojedynczych fotonów (SPECT) i protokołu akwizycji tomografii komputerowej (CT) przy użyciu mysich kolimatorów całego ciała (MWB) w podwójnym systemie SPECT/CT.

Ocena in vivo klirensu śluzowo-rzęskowego u myszy

Aby zagwarantować skuteczną i wysokiej jakości analizę funkcjonalną rzęsek w celu diagnozy PCD, niezbędna jest precyzyjna i staranna metoda pobierania i przetwarzania nabłonka oddechowego. Aby kontynuować świadczenie usług diagnostycznych w kierunku PCD podczas pandemii COVID-19, protokół wideomikroskopii rzęskowej został zaktualizowany w celu uwzględnienia odpowiednich środków kontroli zakażeń.

Pobieranie próbek i przetwarzanie szczotkowania nosa za pomocą cyfrowej wideomikroskopii rzęskowej o dużej prędkości – adaptacja do pandemii COVID-19

Ten protokół opisuje zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie komórek nabłonka nosa do organotypowych modeli komórek nabłonka dróg oddechowych oraz kwantyfikację częstotliwości uderzeń rzęsek za pomocą obrazowania żywych komórek i niestandardowych skryptów.

Zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie pierwotnych modeli ludzkich komórek nabłonka nosa w celu ilościowego określenia częstotliwości uderzeń rzęsek

Kultura interfejsu powietrze-ciecz jest powszechnie stosowana do tworzenia pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych poprzez różnicowanie pierwotnych normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli, które naśladują wierzchołkową stronę drogi oddechowej płuc. W tym miejscu opisujemy prosty protokół określania jego jakości poprzez monitorowanie jego właściwości biofizycznych, takich jak funkcja rzęsek i integralność błony.

Określanie funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych płuc

Ta metoda opisuje wykorzystanie endogennego sygnału w transgenicznym modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2 do obrazowania pierwotnych rzęsek in situ, w trzech wymiarach na dużych obszarach zmineralizowanej tkanki, od pobrania tkanki do analizy organizacji rzęsek. Protokół ten może być również stosowany do innych rodzajów tkanek.

Obrazowanie wolumetryczne i analiza rzęsek pierwotnych w tkance mięśniowo-szkieletowej przy użyciu modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2

Niniejszy artykuł opisuje dobór odpowiednich sond do techniki single-cell FISH, metody preparowania jąder blastomerów, a także hybrydyzację in situ i ocenę sygnałów w kontekście diagnostyki przedimplantacyjnej (PGD) stosowanej w warunkach klinicznych.

FISH w diagnostyce preimplantacyjnej

Przezbrzuszne ultrasonografie jest opisywane jako skuteczny, nieinwazyjny sposób oceny statusu reprodukcyjnego u jelenia muntjac Reevesa. Metody te można wykorzystać do wczesnej diagnozy ciąży i oceny żywotności płodu. Przyszłe zastosowania tej techniki obejmują szacowanie wieku ciążowego i wpływu chorób matki na rozwój płodu.

USG przezbrzuszne w diagnostyce ciąży u jelenia Muntjac Reevesa

Poznaj szybką analizę wideomikroskopii w diagnostyce pierwotnej dyskinezy rzęsek. Ta niezawodna metoda pozwala ocenić funkcję rzęsek u pacjentów w każdym wieku i wykryć zarówno pierwotne, jak i wtórne zaburzenia.

Szybka analiza wideomikroskopii w diagnostyce pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek

Przeglądaj więcej filmów