Name: Akustoforeza mikroprzepływowa do przepływowego rozdzielania bakterii Gram-ujemnych za pomocą kulek powinowactwa aptamerowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj akustoforezę mikroprzepływową do szybkiego rozdzielania bakterii Gram-ujemnych z użyciem kulek powinowactwa aptamerowego. Ta metoda umożliwia izolację komórek bez kontaktu z wysoką przepustowością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) ufundowany przez rząd koreański (Ministerstwo Nauki i ICT). (Nie. NRF-2021R1A2C1011380)

1. Mikroprzepływowa konstrukcja układu akustoforetycznego
UWAGA: Rysunek 1 pokazuje schemat separacji i pobierania docelowych mikrokulek z mikrokanałów za pomocą akustoforezy. Mikroprzepływowy chip do akustoforezy został zaprojektowany za pomocą programu CAD.
<ol>
	<li>Zaprojektuj mikroprzepływowy chip do akustoforezy, który wykorzystuje mieszaninę kulek modyfikowanych aptamerem i kulek polistyrenowych pokrytych streptawidyną (PS) odpowiadających wielkości bakterii do badania wydajności separacji urządzenia.</li>
	<li>Zaprojektuj mikroprzepływowy układ akustoforezy, który zbiera kulki PS na docelowym wylocie i wyrzuca resztę przez wylot po wstrzyknięciu mieszaniny próbki PS do wlotu próbki (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2 i Tabela 1). 
	UWAGA: W tym celu zaprojektowano chip akustyczno-przepływowy składający się z dwóch wlotów do wstrzykiwania próbek i bufora, głównego kanału z dołączonym przetwornikiem piezoelektrycznym (PZT), który umożliwia centralne wyrównanie mikrogranulek, oraz dwóch wylotów, przez które zbierane są próbki i odprowadzane odpady (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A)</li>
	<li>Zaprojektuj mikroprzepływowy układ akustoforezowy, w którym mikrogranulki, bufor, bakterie i aptamery przechodzą przez główny kanał, z mikrokulkami ustawionymi centralnie za pomocą akustoforezy w chipie indukowanej przez PZT (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B, C)</li>
</ol>
2. Wytwarzanie chipów do akustoforezy mikroprzepływowej
UWAGA: Złóż cztery warstwy w następującej kolejności: warstwa szkła borokrzemianowego, warstwa krzemianu, warstwa szkła borokrzemianowego i warstwa PZT, jak pokazano w Rysunek 3A,B.
<ol>
	<li>Przygotuj szkło borokrzemianowe (najwyższa warstwa) z otworami o średnicy 2 mm za pomocą piaskowania17 na wlocie i wylocie do podłączenia rurek z polieteroeteroketonu (PEEK). Szkło borokrzemianowe ma wymiary 20 × 80 × 0,5 mm3.</li>
	<li>Przygotować warstwę kanału krzemowego o grubości 200 μm z mikrokanalikiem o polu przekroju poprzecznego 0,2 × 0,2mm2 uformowanym przy użyciu fotorezystu i wzoru krzemowego uzyskanego metodą głębokiego reaktywnego trawienia jonowego (RIE)18. Wywiercić otwory o średnicy 1 mm w kanałach wlotowych próbki i bufora oraz kanałach odbioru i odpływu podczas reaktywnego trawienia jonowego. 
	UWAGA: W tym przypadku trawienie jonowe wykorzystuje proces RIE do tworzenia mikrokanałów. Na płytkę krzemową nałożono fotorezystor w kształcie kanału na płytkę krzemową dla warstwy kanału krzemowego. Płytka krzemowa pokryta powłoką PR została wytrawiona plazmą wygenerowaną przez zastosowanie częstotliwości 13,56 Mhz do fluoru18.</li>
	<li>Przygotuj chip z warstwami powyżej i poniżej warstwy krzemu (20 × 80 × 0,5 mm3) przygotowanymi w kroku 2.2 (20 × 80 × 0,5 mm3) połączonymi ze szkłem borokrzemianowym w kroku 2.1 i trzecią warstwą szkła borokrzemianowego za pomocą anodowania przy 1 000 V i 400 °C19.</li>
	<li>Przymocować PZT (20 × 40 mm2) do warstwy szkła borokrzemianowego wzdłuż kanału mikroprzepływowego za pomocą kleju cyjanoakrylowego (10 μl lub mniej). 
	UWAGA: Nałóż klej jako bardzo cienką warstwę w kanale za pomocą bawełnianego wacika, aby zminimalizować zmianę wysokości. Rysunek 3C to zdjęcie urządzenia.</li>
</ol>
3. Szczepy i hodowle bakterii
UWAGA: Patrz Tabela 2, aby wybrać i inkubować bakterie GN i Gram-dodatnie (GP) do eksperymentów. Aby zapoznać się z metodą hodowli, zapoznaj się z krokami 3.1-3.4. Wszystkie bakterie powinny być inkubowane w warunkach tlenowych aż do uzyskania absorbancji 0,4 przy 600 nm (OD600).
<ol>
	<li>W przypadku bakterii GN, takich jak Escherichia coli DH5α, Escherichia coli KCTC2571, Sphingomonas insulae i Pseudomonas pictorum oraz bakterii GP, takich jak Staphylococcus epidermidis i Staphylococcus pasteuri, inkubować w pożywce Luria-Bertani w temperaturze 37 °C i 220 obr./min przez 16 godzin.</li>
	<li>Dla Enterobacter (GN) i Bacillus megaterium (GP; KCTC 1021), inkubować w pożywce bulionowej w temperaturze 37 °C i 220 obr./min przez 16 godzin.</li>
	<li>W przypadku Enterococcus thailandicus (GP) inkubować w pożywce de Mana, Rogosy i Sharpe'a (MRS) w temperaturze 37 °C i 220 obr./min przez 16 godzin.</li>
	<li>W przypadku Listeria grayi (GP) inkubować w pożywce do infuzji mózgu i serca w temperaturze 37 °C i 220 obr./min przez 16 godzin.</li>
	<li>Odwirować (9056 x g) wyhodowane bakterie przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie dwukrotnie przepłukać 1x buforem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).</li>
	<li>Przygotować wybrane bakterie GN i GP do analizy poprzez ponowne zawieszenie w buforze PBS.</li>
</ol>
4. Mikrogranulki i unieruchomienie aptameru na mikrokulkach
<ol>
	<li>Mieszaninę mikrogranulek pokrytych streptawidyną (10 μm) (tabela materiałów) zawiesić przed użyciem (mieszać przez wirowanie przez 20 s).</li>
	<li>Przygotować aptamer, skażając go w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie ponownie składając w temperaturze 0 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Przenieść 250 μl mieszaniny mikrogranulek pokrytych streptawidyną do probówki o pojemności 1,5 ml i przemyć buforem Tris-HCl (50 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 5 mM KCL, 100 mM NaCl) w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 100 μl biotynylowanego aptameru DNA do probówki.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, obracając (25 obr./min).</li>
	<li>Po odwirowaniu (9056 x g) przemyć probówkę dwukrotnie 200 μl buforu Tris-HCl w temperaturze pokojowej</li>
	<li>Dodać 10 μl BSA (100 mg/ml) do przepłukanej probówki z próbką i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z rotacją (25 obr./min).</li>
	<li>Na koniec przepłukać mikrogranulki modyfikowane aptamerem dwukrotnie przez odwirowanie (9056 x g) w buforze Tris-HCl w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
5. Konfiguracja i obsługa akustoforezy
<ol>
	<li>Podłącz rurki PEEK do dwóch wlotów do wstrzykiwania dwóch próbek i bufora oraz dwóch wylotów do zbierania i odprowadzania odpadów (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4).</li>
	<li>Ręcznie napełnij kanał akustoforezy mikroprzepływowej demineralizowaną wodą bez pęcherzyków powietrza za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Przygotuj precyzyjny regulator ciśnienia z dwoma lub więcej kanałami wyjściowymi do sterowania przepływem płynu. Następnie napełnić fiolki do połowy próbką i buforem z dwoma otworami odpowiednio w ich nakrętkach i podłączyć do wlotu chipów. 
	UWAGA: Precyzyjny regulator ciśnienia z dwoma lub więcej kanałami wyjściowymi można zastąpić wieloma precyzyjnymi regulatorami ciśnienia. Na wlocie buforu przez regulator przepływu wtryskiwany jest bufor zdolny do generowania przepływu laminarnego, który zapobiega przemieszczaniu się próbki do środka podczas wstrzykiwania próbki.</li>
	<li>Po przygotowaniu urządzenia wstrzyknąć próbkę i bufor, przykładając ciśnienie 2 kPa do wlotu próbki i 4 kPa do wlotu buforu za pomocą precyzyjnego urządzenia do kontroli ciśnienia. 
	UWAGA: W tym czasie, aby zapewnić płynny przepływ laminarny, ciśnienie wtrysku buforu powinno być wyższe niż ciśnienie wtrysku próbki. Przepływ jest kontrolowany przez regulator przepływu zamontowany na aspiratorze podłączonym do kanału doprowadzającego.</li>
	<li>Skoncentruj się na koraliku, aby przesunąć go do środka kanału mikroprzepływowego za pomocą PZT, sprawdzając przez mikroskop. 
	UWAGA: Im większy ścieg, tym większy wpływ na przebieg, dzięki czemu łatwiej jest wyrównać się z punktem węzła. Generator funkcyjny ze wzmacniaczem dostarcza moc do PZT w celu wygenerowania fali sinusoidalnej w mikrokanale. Ponieważ górna i dolna część mikrokanału są wykonane ze szkła, wygenerowana fala sinusoidalna jest odbijana i tworzy węzeł point7.</li>
	<li>Wygeneruj częstotliwość rezonansową 3,66 MHz za pomocą jednokanałowego generatora funkcyjnego i wzmocnij typowy sygnał o 16 dB (około dziewięciokrotnie) za pomocą wzmacniacza mocy (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). 
	UWAGA: Częstotliwość rezonansowa siłownika musi być dopasowana do rozmiaru kanału; ponieważ kanał jest kwadratowy, PZT działa z dokładną częstotliwością, aby utworzyć pojedynczy węzeł.</li>
	<li>Obserwuj procesy separacji i wzbogacania na chipie akustofluidycznym za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i szybkiej kamery działającej z prędkością 1 200 kl./s.</li>
	<li>Określ ilościowo i przeanalizuj obecność lub brak bakterii GN i bakterii GP, sprawdzając obrazy wykonane kamerą mikroskopu fluorescencyjnego kulek i bakterii związanych z bakteriami uwalnianych przez próbki do zbierania i wylotu odpadów. 
	UWAGA: Mikrogranulki z buforem, bakteriami i aptamerami przechodzą przez kanał główny, a mikrogranulki są wyrównywane centralnie za pomocą akustoforezy w chipie indukowanej przez PZT. Na koniec mikrogranulki, które związały bakterie GN, są zbierane w punkcie zbiórki, a niezebrane bakterie są odprowadzane przez wylot odpadów.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidic+separation+of+cells+and+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystem+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidic separation of cells and particles.</a> Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).</li>
<li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+affinity-bead+mediated+capture+and+displacement+of+Gram-negative+bacteria+using+acoustophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis.</a> Micromachines. 10 (11), 770(2019).</li>
<li>Hirvonen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+sample+preparation+of+positive+blood+cultures+for+the+direct+detection+of+methicillin-sensitive+and+-resistant+Staphylococcus+aureus+and+methicillin-resistant+coagulase-negative+staphylococci+within+one+hour+using+the+automated+GenomEra+CDXTM+PCR+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).</li>
<li>Swaminathan, B., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+food-borne+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria.</a> Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+manipulation+of+single+microparticles%2C+cells%2C+and+organisms+using+surface+acoustic+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).</li>
<li>Karthick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+impedance-based+size+independent+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+using+acoustophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 2802(2018).</li>
<li>Lenshof, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidics+8%3A+Applications+of+acoustophoresis+in+continuous+flow+microsystems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).</li>
<li>Persson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+microfluidic+chip+technology+to+facilitate+automation+of+phage+display+selection%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+journal%22%5BJournal%5D)">Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection.</a> The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).</li>
<li>Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKlussmann%2C+S+%22The+aptamer+handbook%3A+Functional+oligonucleotides+and+their+applications%22">The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications</a>. , John Wiley & Sons. Hoboken, New Jersey. (2006).</li>
<li>Ellington, A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li>
<li>Namnabat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+numerical+simulation+of+acoustophoretic+motion+induced+by+boundary-driven+acoustic+streaming+in+standing+surface+acoustic+wave+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11326(2021).</li>
<li>Nimjee, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+as+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Aptamer as therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+aptamer+discovery+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Recent advances in aptamer discovery and application.</a> Molecules. 24 (5), 941(2019).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acousto-microfluidics+for+screening+of+ssDNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Persson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+microfluidic+chip+technology+to+facilitate+automation+of+phage+display+selection%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection.</a> The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).</li>
<li>Van Toan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+processes+for+glass+micromachining%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">An investigation of processes for glass micromachining.</a> Micromachines. 7 (3), 51(2016).</li>
<li>Jansen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+on+the+reactive+ion+etching+of+silicon+in+microtechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14(1996).</li>
<li>Hanneborg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon-to-silicon+anodic+bonding+with+a+borosilicate+glass+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139(1991).</li>
<li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+filter+microchip+for+rapid+separation+of+plasma+and+viruses+from+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).</li>
<li>Ai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+Escherichia+coli+bacteria+from+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+standing+surface+acoustic+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves.</a> Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).</li>
<li>Ohlsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+impedance+matched+buffers+enable+separation+of+bacteria+from+blood+cells+at+high+cell+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+dielectrophoretic+bacterial+separation+and+concentration+from+physiological+media+of+high+conductivity%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity.</a> Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).</li>
<li>Kim, U., Soh, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+sorting+of+multiple+bacterial+targets+using+integrated+Dielectrophoretic-Magnetic+Activated+Cell+Sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter.</a> Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).</li>
<li>Cai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluidic+device+for+immunomagnetic+separation+of+foodborne+bacteria+using+self-assembled+magnetic+nanoparticle+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains.</a> Micromachines. 9 (12), 624(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opracowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe z lewitacją soniczną do wychwytywania i przenoszenia bakterii GN z próbek hodowlanych z dużą prędkością, w oparciu o metodę ciągłego działania w zależności od ich wielkości i rodzaju, oraz mikrogranulki modyfikowane aptamerami. Długi, kwadratowy mikrokanał umożliwia prostszą konstrukcję i większą efektywność kosztową akustoforezy 2D niż wcześniej zgłaszano 20,21,22,23,24,25,26.</sup...

Platformy mikroprzepływowe są opracowywane do izolowania bakterii z próbek medycznych i środowiskowych, oprócz metod opartych na transferze dielektrycznym, magnetoforezie, ekstrakcji perełek, filtrowaniu, mikrofluidyce odśrodkowej i efektach inercjalnych oraz powierzchniowych falach akustycznych1,2. Wykrywanie bakterii chorobotwórczych jest kontynuowane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), ale zwykle jest pracochłonne, złożone i czasochłonne3,4. Systemy akustoforezy mikroprzepływowej są alternatywą, aby rozwiązać ten problem poprzez rozsądną przepustowość i bezkontaktową izolację komórek5,6,7. Akustoforeza to technologia polegająca na oddzielaniu lub skupianiu koralików za pomocą zjawiska ruchu materiału przez falę dźwiękową. Kiedy fale dźwiękowe dostają się do mikrokanału, są sortowane według rozmiaru, gęstości itp. kulek, a komórki można rozdzielić zgodnie z właściwościami biochemicznymi i elektrycznymi podłoża zawiesinowego7,8. W związku z tym aktywnie prowadzono wiele badań akustoforetycznych 9,10,11, a ostatnio wprowadzono symulacje numeryczne 3D ruchu akustoforetycznego indukowanego przez sterowany granicami strumień akustyczny w mikrofluidyce fal akustycznych o stojącej powierzchni12.
Badania w różnych dziedzinach badają, jak zastąpić przeciwciała2,3. Aptamer jest materiałem docelowym o wysokiej selektywności i swoistości, a wiele badań jest obecnie prowadzonych2,9,10,13. Aptamery mają zalety takich jak niewielkie rozmiary, doskonała stabilność biologiczna, niski koszt i wysoka powtarzalność w porównaniu z przeciwciałami i są badane w zastosowaniach diagnostycznych i terapeutycznych2,3,14.
Tutaj ten artykuł opisuje protokół technologii akustoforezy mikroprzepływowej, który może być wykorzystany do szybkiego, skutecznego oddzielania bakterii Gram-ujemnych (GN) od podłoża za pomocą mikrogranulek modyfikowanych aptamerem. System ten generuje dwuwymiarową (2D) akustyczną falę stojącą poprzez pojedyncze uruchomienie piezoelektryczne, jednocześnie stymulując dwa ortogonalne rezonanse w długim prostokątnym mikrokanale w celu wyrównania i skupienia mikrokulek dołączonych do aptamera w punktach węzła i antywęzła w celu uzyskania skuteczności separacji2,11,15,16. Zarówno na wlocie, jak i wylocie znajduje się rozwidlony kanał, umożliwiający jednoczesną separację, oczyszczanie i zagęszczanie.
Ten protokół może być pomocny w dziedzinie wczesnej diagnostyki bakteryjnych chorób zakaźnych, a także szybkiej, selektywnej i czułej odpowiedzi na infekcje bakteryjne poprzez monitorowanie wody w czasie rzeczywistym.

<table><tbody><tr><td>1 &mikro; m Mikrogranulki polistyrenowe</td><td>Bang Laboratories</td><td>PS04001</td><td>Koraliki wielkości komórek</td></tr><tr><td>10 i mikro; m Mikrogranulki pokryte streptawidyną</td><td>Bang</td><td>Laboratories CP01007</td><td>Koraliki powinowactwa do aptamerów</td></tr><tr><td>4-calowa forma wafla krzemowego / SU-8</td><td>4science</td><td>29-03573-01</td><td>Elementy chipa</td></tr><tr><td>Aptamer</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>GN3-6'RNA</td> <td>do koniugacji bakterii</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe</td><td>Schott</td><td>BOROFLOAT 33</td> Elementy wirówki <td>do</td></tr><tr><td>chipów</td><td>Daihan</td><td>CF-10</td><td>Marzystwo cząstek</td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>3M</td><td>AD100</td><td>Dołącz PZT do mikroczipa</td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha;</td><td>KCTC</td><td>KCTC2571</td><td>Bakterie docelowe</td></tr><tr><td>Generator funkcjonalny</td><td>GW Instek</td><td>AFG-2225</td><td>Generuj częstotliwość</td></tr><tr><td>Szybka kamera</td><td>Photron</td><td>FASTCAM Mini</td><td>Obserwacja separacji</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Jako jeden</td><td>HI-1000</td><td>Płyta grzewcza do utwardzania płynu PDMS</td></tr><tr><td>KOVAX-STRZYKAWKA 10 ml</td><td>Strzykawka Koreavaccine</td><td>22G-10ML</td><td>Napełnij kanał akustoforezy mikroprzepływowej wodą demineralizowaną bez pęcherzyków powietrza.</td></tr><tr><td>Płynny polidimetylosiloksan, PDMS</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>Składniki chipa</td></tr><tr><td>LB Bulion Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Hodowla komórkowa (podłoże Luria-Bertani)</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corp.</td><td>IX-81</td><td>Obserwacja separacji</td></tr><tr><td>Bufor PBS</td><td>Koziorożec naukowy</td><td>PBS-1A Bakterie</td><td>marnujące</td></tr><tr><td>PEEK Tubes</td><td>Saint-Gobain Ppl Corp.</td><td>AAD04103</td><td>Wstrzykiwanie lub zbieranie cząstek</td></tr><tr><td>Przetwornik piezoelektryczny</td><td>Fuji Ceramics</td><td>C-213</td><td>Generuj falę właściwą w kanale</td></tr><tr><td>Wzmacniacz mocy</td><td>Badania</td><td>wzmacniacza 75A250A</td><td>Zwiększ częstotliwość</td></tr><tr><td>Regulator ciśnienia/&mu; flucon</td><td>AMED</td><td>AMED-&mu; flucon</td><td>Sterowanie regulatorem ciśnienia/przepływu powietrza</td></tr><tr><td>Bufor Tris-HCl</td><td>invitrogen</td><td>15567027</td><td>Marnowanie cząstek</td></tr><tr><td>Rotator rurowy</td><td>SeouLin Bioscience</td><td>SLRM-3</td><td>Modyfikujący aptamer i koralik</td></tr></tbody></table>

akustoforeza mikroprzepływowa do przepływowego rozdzielania bakterii gram-ujemnych za pomocą kulek powinowactwa aptamerowego

Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads

Ten artykuł opisuje wytwarzanie i działanie mikroprzepływowych chipów akustoforetycznych przy użyciu techniki akustoforezy mikroprzepływowej i mikrogranulek modyfikowanych aptamerami, które mogą być używane do szybkiej i efektywnej izolacji bakterii Gram-ujemnych z pożywki. Metoda ta zwiększa skuteczność separacji przy użyciu kombinacji długich, kwadratowych mikrokanałów. W tym systemie próbka i bufor są wstrzykiwane do portu wlotowego przez regulator przepływu. W celu centrowania kulek i separacji próbek, prąd przemienny jest doprowadzany do przetwornika piezoelektrycznego za pośrednictwem generatora funkcyjnego ze wzmacniaczem mocy w celu wytworzenia siły promieniowania akustycznego w mikrokanale. Zarówno na wlocie, jak i wylocie znajduje się rozwidlony kanał, który umożliwia jednoczesną separację, oczyszczanie i zagęszczanie. Urządzenie ma wskaźnik odzysku >98% i czystość 97,8% przy stężeniu dawki 10x. Badanie to wykazało wskaźnik odzysku i czystość wyższą niż istniejące metody separacji bakterii, co sugeruje, że urządzenie może skutecznie oddzielać bakterie.

Rysunek 5 przedstawia obraz przepływu kulek w funkcji napięcia PZT (WYŁ, 0,1 V, 0,5 V, 5 V). W przypadku chipa akustoforetycznego wprowadzonego w niniejszej badaniu potwierdzono, że wraz ze wzrostem napięcia PZT zwiększało się stężenie kulek o rozmiarze 10 µm w centrum. Większość kulek o rozmiarze 10 µm skoncentrowała się w centrum przy napięciu PZT wynoszącym 5 V. Na podstawie tego wyniku w jednokanałowym generatorze funkcji wygenerowano częstotliwość rezonansową 3,66 MHz, a ogólny sygnał z...

Ten artykuł opisuje wytwarzanie i działanie mikroprzepływowych chipów akustoforetycznych przy użyciu techniki akustoforezy mikroprzepływowej i mikrogranulek modyfikowanych aptamerem, które mogą być używane do szybkiej, efektywnej izolacji bakterii Gram-ujemnych z pożywki.

Akustoforeza mikroprzepływowa do przepływowego rozdzielania bakterii Gram-ujemnych za pomocą kulek powinowactwa aptamerowego

This article describes the fabrication and operation of microfluidic acoustophoretic chips using a microfluidic acoustophoresis technique and ...

Protokół ten opisuje naszą technologię akustoforezy mikroprzepływowej, która może być stosowana do szybkiego i skutecznego oddzielania bakterii Gram-ujemnych od podłoża za pomocą mikrokulek modyfikowanych aptamerem. Mikroprzepływowe systemy akustoforezy umożliwiają separację bakterii Gram-ujemnych z rozsądną przepustowością i bezkontaktową izolacją komórek. Akustoforezę mikroprzepływową można zoptymalizować w celu wyizolowania bakterii z próbek medycznych i środowiskowych.Na początek zaprojektuj mikroprzepływowy chip akustoforezy, który zbiera kulki PS na docelowym wylocie i odrzuca resztę po wstrzyknięciu mieszaniny próbki PS do wlotu próbki. Przygotuj chip z warstwami powyżej i poniżej warstwy krzemu połączonymi ze szkłem borokrzemianowym. A trzecia warstwa szkła borokrzemianowego, wykorzystująca anodowanie, dodaje 1000 woltów i 400 stopni Celsjusza.Przymocuj PZT do warstwy szkła borokrzemianowego wzdłuż kanału mikroprzepływowego, używając mniej niż 10 mikrolitrów kleju cyjanoakrylowego. Zaszczepić bakterie GN i GP w pożywce Luria-Bertani i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 220 obrotów na minutę przez 16 godzin. Odwirować wyhodowane bakterie w temperaturze 9 056 RCF przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Następnie umyj dwukrotnie buforem 1X PBS. Przygotować wybrane bakterie GN i GP do analizy, umieszczając je ponownie w buforze wiążącym. Przed użyciem zawiesić mieszaninę mikrokulek pokrytą streptawidyną o grubości 10 mikrometrów.Mieszaj mieszaninę przez 20 sekund. Przygotuj aptamer, denaturując go w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie składając go ponownie w temperaturze zero stopni Celsjusza przez dwie minuty. Przenieś 250 mikrolitrów mieszaniny mikrokulek pokrytej streptawidyną pokrytej streptawidyną do 1,5 mililitrowej probówki i dodaj 100 mikrolitrów biotynylowanego aptameru DNA do probówki.Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, obracając się z prędkością 25 obrotów na minutę. Odwirować mieszaninę reakcyjną przy 9 056 RCF przez 40 sekund w temperaturze pokojowej. Następnie dwukrotnie przemyć probówkę 200 mikrolitrami buforu Tris-HCl.Dodać 10 mikrolitrów po 100 miligramów na mililitr BSA do umytej probówki z próbką i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, obracając się z prędkością 25 obrotów na minutę. Na koniec przemyć mikrokulki zmodyfikowane aptamerem dwukrotnie w buforze Tris-HCl przez odwirowanie w temperaturze 9 056 RCF przez 40 sekund w temperaturze pokojowej. Podłączyć rurki PEEK do dwóch wlotów w celu wstrzyknięcia dwóch próbek i bufora oraz do dwóch wylotów do zbierania i odprowadzania odpadów.Za pomocą 10-mililitrowej strzykawki napełnij kanał akustoforezy mikroprzepływowej wodą demineralizowaną bez pęcherzyków. Przygotuj precyzyjny regulator ciśnienia z dwoma lub więcej kanałami wyjściowymi do sterowania przepływem płynu. Po przygotowaniu urządzenia wstrzyknąć próbkę i bufor, wywierając ciśnienie dwóch kilopaskali na wlocie próbki i czterech kilopaskali na wlocie buforu za pomocą precyzyjnego urządzenia do kontroli ciśnienia.Za pomocą mikroskopu ustaw ostrość na koraliku i przesuń go do środka kanału mikroprzepływowego za pomocą PZT. Generuj częstotliwość rezonansową 3,66 megaherca za pomocą jednokanałowego generatora funkcyjnego i wzmacniaj typowy sygnał o 16 decybeli za pomocą wzmacniacza mocy. Obserwuj procesy separacji i wzbogacania na chipie akustofluidycznym za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i szybkiej kamery działającej z prędkością 1 200 klatek na sekundę.Układ akustoforetyczny wprowadzony w tym badaniu potwierdził, że wraz ze wzrostem napięcia PZT wzrastało centralne stężenie kulek o wielkości 10 mikrometrów. Przy napięciu pięciu PZT o napięciu 5 mikrometrów większość kulek o wielkości 10 mikrometrów była skoncentrowana w środku. Stosunek liczby kulek zebranych na wylocie do całkowitej liczby wstrzykniętych kulek o wielkości 10 mikrometrów określono jako współczynnik odzysku.Stosunek liczby koralików o wielkości 10 mikrometrów do całkowitej liczby zebranych koralików określano mianem czystości. Wyniki wykazały, że urządzenie ma wysoką skuteczność separacji dla kulek o wielkości 10 mikrometrów. Liczbę bakterii GN i GP związanych z każdym mikrokulką zmodyfikowaną aptamerem zmierzono za pomocą mikroskopu z kamerą o dużej szybkości.Wszystkie pięć bakterii GN było związanych z kulkami, podczas gdy znacznie mniej bakterii GP było związanych z testowanymi substancjami. Siła sygnału różniła się znacznie między bakteriami GN i GP. Klej używany do mocowania PZT powinien być używany jak najmniej, aby zapewnić dokładność pofałdowania, a PZT i mikrokanał powinny być równoległe.Urządzenie to może być wykorzystywane do wykrywania żywych bakterii lub biomarkerów pochodzenia bakteryjnego w okresie wczesnej diagnostyki bakteryjnych chorób zakaźnych.

microfluidic-acoustophoresis-for-flowthrough-separation-gram-negative

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Urządzenia mikrofluidyczne mogą być wykorzystywane do wizualizacji złożonych procesów naturalnych w czasie rzeczywistym i w odpowiednich skalach fizycznych. Opracowaliśmy proste urządzenie mikrofluidyczne, które naśladuje kluczowe cechy naturalnych ośrodków porowatych, służące do badania wzrostu i transportu bakterii w podłożu gruntowym.

Okno na mikroświat: Proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Dielektroforeza (DEP) jest skuteczną metodą manipulowania komórkami. Płytki drukowane (PCB) mogą stanowić niedrogie, wielokrotnego użytku i wydajne elektrody do bezkontaktowego manipulowania komórkami w urządzeniach mikroprzepływowych. Poprzez połączenie kanałów mikroprzepływowych opartych na PDMS z szkiełkami nakrywowymi na płytkach PCB, demonstrujemy manipulację i separację kulek oraz komórek w wielokanałowych urządzeniach mikroprzepływowych.

Separacja kulek i komórek w wielokanałowych urządzeniach mikroprzepływowych z wykorzystaniem dielektroforezy i przepływu laminarnego

Źródło: Choi, H. J., et al. Akustoforeza mikroprzepływowa do przepływowego rozdzielania bakterii Gram-ujemnych za pomocą kulek powinowactwa aptamerowego. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia metodę selektywnego oddzielania bakterii Gram-ujemnych od mieszanej próbki bakteryjnej za pomocą mikrogranulek pokrytych aptamerem i sił akustycznych w chipie mikroprzepływowym.

Akustoforeza wspomagana aptamerem do mikroprzepływowej separacji bakterii Gram-ujemnych

W tym filmie najpierw opisujemy procedury produkcji i obsługi akustycznego urządzenia przeciwprądowego powierzchniowej fali akustycznej (SAW). Następnie demonstrujemy eksperymentalną konfigurację, która pozwala zarówno na jakościową wizualizację przepływu, jak i analizę ilościową złożonych przepływów w urządzeniu pompującym SAW.

Wytwarzanie, eksploatacja i wizualizacja przepływu w mikrofluidyce akustyczno-przeciwprądowej opartej na powierzchniowych falach akustycznych

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Urządzenia akustofluidyczne wykorzystują fale ultradźwiękowe w kanałach mikroprzepływowych do manipulowania, koncentracji i izolowania zawieszonych mikro i nanoskopowych jednostek. Protokół ten opisuje produkcję i działanie takiego urządzenia obsługującego masowe akustyczne fale stojące w celu skupienia cząstek w centralnym strumieniu bez pomocy płynów osłonowych.

Wytwarzanie i eksploatacja urządzeń akustyczno-przepływowych wspomagających masowe akustyczne fale stojące do bezosłonowego ogniskowania cząstek

Ten protokół opisuje wykorzystanie strategii wymiany opartej na inercyjnej mikroprzepływowości do oczyszczania komórek inżynierii mikro/nanocząsteczkowej z efektywnym usuwaniem niezwiązanych cząstek.

Mikroprzepływowa wymiana buforowa w celu inżynierii komórek mikro/nanocząsteczkowych bez zakłóceń

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Krzywe przełomu (BTC) są skutecznymi narzędziami do badania transportu bakterii w porowatych mediach. Tutaj przedstawiamy narzędzia oparte na urządzeniach fluidycznych w połączeniu z mikroskopią i zliczaniem metodą cytometrii przepływowej w celu uzyskania BTC.

Połączenie urządzeń fluidycznych z mikroskopią i cytometrią przepływową w celu badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych w skalach przestrzennych

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Poznaj akustoforezę mikroprzepływową do szybkiego rozdzielania bakterii Gram-ujemnych z użyciem kulek powinowactwa aptamerowego. Ta metoda umożliwia izolację komórek bez kontaktu z wysoką przepustowością.

Akustoforeza mikroprzepływowa do przepływowego rozdzielania bakterii Gram-ujemnych za pomocą kulek powinowactwa aptamerowego

Przeglądaj więcej filmów