Akustoforeza mikroprzepływowa do przepływowego rozdzielania bakterii Gram-ujemnych za pomocą kulek powinowactwa aptamerowego
17 października 2022
Ten artykuł opisuje wytwarzanie i działanie mikroprzepływowych chipów akustoforetycznych przy użyciu techniki akustoforezy mikroprzepływowej i mikrogranulek modyfikowanych aptamerem, które mogą być używane do szybkiej, efektywnej izolacji bakterii Gram-ujemnych z pożywki.
Protokół ten opisuje naszą technologię akustoforezy mikroprzepływowej, która może być stosowana do szybkiego i skutecznego oddzielania bakterii Gram-ujemnych od podłoża za pomocą mikrokulek modyfikowanych aptamerem. Mikroprzepływowe systemy akustoforezy umożliwiają separację bakterii Gram-ujemnych z rozsądną przepustowością i bezkontaktową izolacją komórek. Akustoforezę mikroprzepływową można zoptymalizować w celu wyizolowania bakterii z próbek medycznych i środowiskowych.
Na początek zaprojektuj mikroprzepływowy chip akustoforezy, który zbiera kulki PS na docelowym wylocie i odrzuca resztę po wstrzyknięciu mieszaniny próbki PS do wlotu próbki. Przygotuj chip z warstwami powyżej i poniżej warstwy krzemu połączonymi ze szkłem borokrzemianowym. A trzecia warstwa szkła borokrzemianowego, wykorzystująca anodowanie, dodaje 1000 woltów i 400 stopni Celsjusza.
Przymocuj PZT do warstwy szkła borokrzemianowego wzdłuż kanału mikroprzepływowego, używając mniej niż 10 mikrolitrów kleju cyjanoakrylowego. Zaszczepić bakterie GN i GP w pożywce Luria-Bertani i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 220 obrotów na minutę przez 16 godzin. Odwirować wyhodowane bakterie w temperaturze 9 056 RCF przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.
Następnie umyj dwukrotnie buforem 1X PBS. Przygotować wybrane bakterie GN i GP do analizy, umieszczając je ponownie w buforze wiążącym. Przed użyciem zawiesić mieszaninę mikrokulek pokrytą streptawidyną o grubości 10 mikrometrów.
Mieszaj mieszaninę przez 20 sekund. Przygotuj aptamer, denaturując go w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie składając go ponownie w temperaturze zero stopni Celsjusza przez dwie minuty. Przenieś 250 mikrolitrów mieszaniny mikrokulek pokrytej streptawidyną pokrytej streptawidyną do 1,5 mililitrowej probówki i dodaj 100 mikrolitrów biotynylowanego aptameru DNA do probówki.
Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, obracając się z prędkością 25 obrotów na minutę. Odwirować mieszaninę reakcyjną przy 9 056 RCF przez 40 sekund w temperaturze pokojowej. Następnie dwukrotnie przemyć probówkę 200 mikrolitrami buforu Tris-HCl.
Dodać 10 mikrolitrów po 100 miligramów na mililitr BSA do umytej probówki z próbką i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, obracając się z prędkością 25 obrotów na minutę. Na koniec przemyć mikrokulki zmodyfikowane aptamerem dwukrotnie w buforze Tris-HCl przez odwirowanie w temperaturze 9 056 RCF przez 40 sekund w temperaturze pokojowej. Podłączyć rurki PEEK do dwóch wlotów w celu wstrzyknięcia dwóch próbek i bufora oraz do dwóch wylotów do zbierania i odprowadzania odpadów.
Za pomocą 10-mililitrowej strzykawki napełnij kanał akustoforezy mikroprzepływowej wodą demineralizowaną bez pęcherzyków. Przygotuj precyzyjny regulator ciśnienia z dwoma lub więcej kanałami wyjściowymi do sterowania przepływem płynu. Po przygotowaniu urządzenia wstrzyknąć próbkę i bufor, wywierając ciśnienie dwóch kilopaskali na wlocie próbki i czterech kilopaskali na wlocie buforu za pomocą precyzyjnego urządzenia do kontroli ciśnienia.
Za pomocą mikroskopu ustaw ostrość na koraliku i przesuń go do środka kanału mikroprzepływowego za pomocą PZT. Generuj częstotliwość rezonansową 3,66 megaherca za pomocą jednokanałowego generatora funkcyjnego i wzmacniaj typowy sygnał o 16 decybeli za pomocą wzmacniacza mocy. Obserwuj procesy separacji i wzbogacania na chipie akustofluidycznym za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i szybkiej kamery działającej z prędkością 1 200 klatek na sekundę.
Układ akustoforetyczny wprowadzony w tym badaniu potwierdził, że wraz ze wzrostem napięcia PZT wzrastało centralne stężenie kulek o wielkości 10 mikrometrów. Przy napięciu pięciu PZT o napięciu 5 mikrometrów większość kulek o wielkości 10 mikrometrów była skoncentrowana w środku. Stosunek liczby kulek zebranych na wylocie do całkowitej liczby wstrzykniętych kulek o wielkości 10 mikrometrów określono jako współczynnik odzysku.
Stosunek liczby koralików o wielkości 10 mikrometrów do całkowitej liczby zebranych koralików określano mianem czystości. Wyniki wykazały, że urządzenie ma wysoką skuteczność separacji dla kulek o wielkości 10 mikrometrów. Liczbę bakterii GN i GP związanych z każdym mikrokulką zmodyfikowaną aptamerem zmierzono za pomocą mikroskopu z kamerą o dużej szybkości.
Wszystkie pięć bakterii GN było związanych z kulkami, podczas gdy znacznie mniej bakterii GP było związanych z testowanymi substancjami. Siła sygnału różniła się znacznie między bakteriami GN i GP. Klej używany do mocowania PZT powinien być używany jak najmniej, aby zapewnić dokładność pofałdowania, a PZT i mikrokanał powinny być równoległe.
Urządzenie to może być wykorzystywane do wykrywania żywych bakterii lub biomarkerów pochodzenia bakteryjnego w okresie wczesnej diagnostyki bakteryjnych chorób zakaźnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu przedstawiono technologię mikrofluidycznej akustoforezy służącą do szybkiej i wydajnej separacji bakterii Gram-ujemnych z różnych ośrodków. Metoda ta wykorzystuje zmodyfikowane aptamerami mikrokulki w celu usprawnienia procesu izolacji, umożliwiając bezkontaktową separację komórek przy zachowaniu odpowiedniej wydajności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Akustoforeza
- Mikrobiologia
Wstęp
- Systemy mikroprzepływowe umożliwiają precyzyjną manipulację płynami w skali mikro.
- Akustoforeza jest techniką wykorzystującą fale akustyczne do manipulacji cząstkami.
- Bakterie Gram-ujemne stanowią istotne wyzwanie w izolacji ze względu na ich właściwości strukturalne.
- Aptamery to krótkie, jednoniciowe oligonukleotydy, które mogą selektywnie wiązać się ze specyficznymi celami.
Cel badania
- Opracowanie mikrofluidycznego chipa do akustoforezy w celu wydajnej separacji bakterii.
- Optymalizacja procesu izolacji zarówno dla próbek medycznych, jak i środowiskowych.
- Wykazanie skuteczności mikrokulek modyfikowanych aptamerami w zwiększaniu wydajności separacji.
Zastosowane metody
- Projektowanie mikrofluidycznego chipa do akustoforezy.
- Łączenie warstw krzemu i szkła borokrzemianowego podczas produkcji chipa.
- Wstrzykiwanie mieszaniny próbek PS do chipa w celu ich rozdzielenia.
- Stosowanie anodyzacji przy określonych wartościach napięcia i temperatury.
Główne wyniki
- Mikrofluidyczny system akustoforezy skutecznie wyizolował bakterie Gram-ujemne.
- Osiągnięto wysoką przepustowość oraz bezkontaktową separację.
- Mikrokulki modyfikowane aptamerami znacząco poprawiły wydajność izolacji.
- Metoda ta jest applicable zarówno do próbek medycznych, jak i środowiskowych.
Wnioski
- Mikrofluidyczna akustoforeza jest obiecującą techniką izolacji bakterii.
- Modyfikacje aptamerami zwiększają selektywność i wydajność procesu.
- Technologia ta może być przydatna w różnych zastosowaniach w mikrobiologii.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta mikrofluidyczna metoda akustoforezy umożliwia szybką, wysokoczystą izolację bakterii Gram-ujemnych z kompleksowych matryc, rozwiązując krytyczny problem wąskiego gardła w diagnostyce wczesnych stadiów chorób zakaźnych oraz w monitorowaniu środowiska. Dzięki połączeniu bezznakowej separacji akustycznej ze specyficznością opartą na aptamerach, technologia ta wspiera ograniczanie ryzyka w procesach odkrywania leków przeciwdrobnoustrojowych oraz w przepływach pracy walidacji biomarkerów. Wykazana odzyskowalność >98% i czystość 97,8% przy 10-krotnym zagęszczeniu stanowi skalowalną, bezkontaktową alternatywę dla wirowania lub filtracji w przedklinicznym przygotowaniu próbek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia walidację funkcjonalną celów bakterii Gram-ujemnych poprzez izolację żywych patogenów z heterogenicznych próbek biologicznych lub środowiskowych.
- Wartość operacyjna: Skraca czas przetwarzania próbek i minimalizuje uszkodzenia biomolekularne w porównaniu do tradycyjnych technik separacji.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie oczyszczonych frakcji bakteryjnych do badań nad wiązaniem celu i mechanizmem działania.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie oczyszczonych materiałów bakteryjnych do testów przesiewowych fenotypowych, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich wynikających z zanieczyszczenia gatunkami Gram-dodatnimi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek dzięki powtarzalnemu ogniskowaniu akustoforetycznemu i wychwytowi z wykorzystaniem aptamerów.
- Skalowalność: Konstrukcja z rozgałęzionymi kanałami umożliwia jednoczesne przetwarzanie, oczyszczanie i zagęszczanie, co zwiększa wydajność w kaskadach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etapy odkrywania i badania przedkliniczne poprzez umożliwienie spójnej izolacji bakterii Gram-ujemnych z macierzy przypominających próbki kliniczne, takich jak krew lub mocz.
- Zgodność biomarkerów: Ułatwia wykrywanie żywych bakterii lub pochodnych biomarkerów w zastosowaniach wczesnej diagnostyki, wspierając rozwój biomarkerów translacyjnych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wysokie wskaźniki odzysku i czystości zwiększają pewność w badaniach analitycznych stosowanych do oceny związków wiodących.
Integracja potoku i procesu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając w szczególności przygotowanie próbek do walidacji celu, przygotowania testów oraz badań mechanistycznych, w których kluczowa jest czystość bakterii Gram-ujemnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez izolację konkretnych szczepów bakterii Gram-ujemnych z kultur mieszanych lub próbek środowiskowych w celu ograniczenia ryzyka związanego z celem badań.
- Screening: Umożliwia uzyskanie populacji bakterii gotowych do testów z minimalną ilością zanieczyszczeń komponentami interferującymi, co zwiększa wiarygodność screeningu.
- Analityka: Zapewnia dane ilościowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i obrazowania wysokiej prędkości, co pozwala na wyznaczenie stosunków wiązania koralików do bakterii oraz porównanie siły sygnału.
- Badania translacyjne: Wiąże się z procesami przedklinicznymi poprzez umożliwienie izolacji z próbek istotnych medycznie, wspierając ciągłość w opracowywaniu modeli chorób zakaźnych.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Konstrukcja oparta na chipie oraz płynowe sterowanie ciśnieniem pozwalają na standaryzację między laboratoriami i adaptację do różnych typów próbek bez konieczności ponownego projektowania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej wynikającej z zanieczyszczeń próbek.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki precyzyjnej kontroli siły akustycznej i standaryzowanemu przygotowaniu kompleksów aptamer-kulek.
- Wartość strategiczna: Poprawia niezawodność decyzji go/no-go w programach przeciwmikrobowych poprzez dostarczanie wysokiej wierności danych biologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację liderów w oparciu o analizę ryzyka na podstawie czystszych danych mechanistycznych z oczyszczonych frakcji bakteryjnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie projektowania mikroprzepływowego, optymalizacji parametrów akustoforetycznych oraz protokołów koniugacji aptamerów z kuleczkami.
- Metoda zależy od zastosowania przetworników piezoelektrycznych, generatorów funkcji, wzmacniaczy mocy oraz mikroskopii fluorescencyjnej z możliwością obrazowania wysokiej prędkości.
- Konieczna jest standaryzacja warunków buforowych, szybkości przepływu (próbka 2 kPa, bufor 4 kPa) oraz kalibracja napięcia PZT pomiędzy użytkownikami.
- Adaptacja do różnych gatunków bakterii lub macierzy próbek może wymagać ponownej optymalizacji doboru aptamerów oraz częstotliwości rezonansu akustycznego.
- Ograniczenia praktyczne obejmują powstawanie pofalowań kanału wywołanych przez adhezyjną warstwę kleju w przypadku użycia nadmiaru cyjanoakrylanu, co wpływa na jednorodność pola akustycznego.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Microuidic Acoustophoresis Chip Design and Fabrication
1:23
Bacterial Strains and Culture
1:56
Microbeads and Immobilization of Aptamer onto Microbeads
3:10
Acoustophoresis Setup and Operation
4:19
Results: Using Microfluidics to Capture GN Bacteria from Culture Samples at High Speed
5:26
Conclusion
