Name: Dostarczanie egzogennego, sztucznie syntetyzowanego miRNA naśladującego mimikę do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w kilku mysich modelach choroby nerek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj metodę dostarczania miRNA do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w modelach mysich chorób nerek. Technika ta umożliwia terapię bez wywoływania odpowiedzi interferonowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez JSPS KAKENHI (Grant nr 21K08233). Dziękujemy Edanzowi (https://jp.edanz.com/ac) za redakcję szkiców tego rękopisu.

Wszystkie protokoły eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt Uniwersytetu Medycznego Jichi i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi z Przewodnika dla zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego Jichi. Tutaj wykazaliśmy naśladujące dostarczanie miRNA do nerki, co spowodowało jego nadekspresję przy użyciu myszy UUO. Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Uniwersytetu Medycznego Jichi [Zatwierdzenia nr 19-12 dla zwłóknienia nerek, 17-024 dla ostrej infekcji nerek (AKI) i 19-11 dla nefropatii cukrzycowej].
1. Przygotowanie kompleksu PEI-NPs-miRNA-mimimicznego
UWAGA: Tutaj opisano przygotowanie PEI-NPs-mimimic13,14,15 i PEI-NPs-control-miRNA (jako kontrola negatywna) są opisane dla jednej myszy.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy:
	<ol>
		<li>Przygotować 10 μl liniowych PEI-NPs.</li>
		<li>Przygotować 50 μl sztucznie zsyntetyzowanych miRNA rozpuszczonych w wodzie wolnej od nukleaz o stężeniu 100 μM (5 nmol miRNA rozpuszczone w 50 μl wody wolnej od nukleaz).</li>
		<li>Przygotować 50 μl sztucznie zsyntetyzowanych kontrolnych (niedocelowych) miRNA rozpuszczonych w wodzie wolnej od nukleaz o stężeniu 100 μM (5 nmol miRNA rozpuszczone w 50 μl wody wolnej od nukleaz).</li>
		<li>Przygotuj 5% i 10% roztwory glukozy. Upewnij się, że dostępne są probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i mieszalnik wirowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuścić 10 μl PEI-NPs w 90 μl 5% roztworu glukozy w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Następnie delikatnie przekręć rurkę i odwiruj w dół.</li>
	<li>Wymieszać 50 μl sztucznie zsyntetyzowanych miRNA (5 nmol) rozpuszczonych w wodzie wolnej od nukleaz (stężenie 100 μM) z 50 μM 10% roztworu glukozy w 1,5 ml probówkach do mikrowirówek. Następnie delikatnie przekręć rurkę i odwiruj w dół. W wyniku tego procesu miRNA rozpuszcza się w 5% roztworze glukozy.</li>
	<li>Wymieszać 100 μl PEI-NPs w 5% roztworze glukozy i 100 μl mimiku miRNA (5 nmol) w 5% roztworze glukozy. Następnie delikatnie przekręć rurkę i odwiruj w dół.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby przygotować stabilny kompleks mimików PEI-NPs-miRNA. Roztwór ten zawiera PEI-NP i miRNA naśladujące (5 nmol) w stosunku azotów (N) w polimerze do fosforanu (P) w kwasach nukleinowych (stosunek N / P) = 6 (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1). 
	UWAGA: Kompleks PEI-NPs-control-miRNA można przygotować przy użyciu tego samego procesu, który opisano w krokach 1.1-1.5 dla wszystkich modeli myszy z chorobą nerek opisanych w tym manuskrypcie (UUO, nefropatia cukrzycowa i AKI). Jedna objętość iniekcji mimimiku PEI-NP-miRNAs jest taka sama jak 5 nmol miRNAs-mimików sprzężonych z PEI-NP w stosunku N / P = 6. Czas trwania i częstotliwość wstrzykiwania każdego mimimika PEI-NP-miRNA zależy od modelu choroby, w którym jest stosowany.</li>
</ol>
2. Potwierdzenie znaczącego dostarczenia mimiki miRNA do nerki u myszy UUO przez PEI-NP poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
UWAGA: Tutaj opracowano metodę dostarczania sztucznie oczyszczonego miRNA naśladującego do nerki, co wskazuje na ustanowienie metod leczenia różnych chorób nerek. Krótko mówiąc, myszom UUO podawano mimimikę miRNA znakowaną cyjanininą3 kwasem karboksylowym (Cy3) dodaną do 100 μl PEI-NP przez żyłę ogonową. Dostarczenie do nerek potwierdzono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Opisano mimimikę miRNA (oligonukleotydy) znakowane kwasem PEI-NPs-cyjanininy3 (Cy3) dla jednej myszy. Ta metoda może znacząco dostarczyć miRNA naśladujące nerki w kilku modelach myszy, takich jak myszy UUO, myszy z cukrzycową chorobą nerek i myszy AKI produkowane przez IRI. W tym przypadku użyliśmy modelu myszy UUO do demonstracji wideo. Metoda indukcji UUO została opisana wcześniej w innym miejscu13. Postępuj zgodnie z tymi protokołami w ciągu sześciu dni po operacji UUO.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy:
	<ol>
		<li>Przygotować 2 μl PEI-NPs i 100 μl dwuniciowych oligonukleotydów znakowanych Cy3 [miRNA znakowane Cy3 (1 nmol; 10 μM)].</li>
		<li>Przygotuj 5% i 10% roztwory glukozy. Upewnij się, że dostępne są probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i mieszalnik wirowy.</li>
		<li>Użyj plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z małym otworem w nasadce, aby wyizolować żyły ogonowe myszy UUO.</li>
		<li>Do mikroskopii fluorescencyjnej przygotuj związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), kriostat, ciekły azot, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), strzykawki 1,0 ml z igłą 27 G i szkło pokryte silanem. 
		UWAGA: Znakowana fluoresceiną lektyna Lotus tetragonolobus (marker kanalików proksymalnych) i 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) mogą być przygotowane do opcjonalnego barwienia kanalików proksymalnych i jąder komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuścić 2 μl PEI-NPs w 98 μl 10% roztworu glukozy w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Następnie delikatnie przekręć rurkę i odwiruj w dół.</li>
	<li>Dodaj 100 μl miRNA znakowanego Cy3 do 100 μl PEI-NPs w 10% roztworze glukozy (przygotowanym w kroku 2.2). Następnie delikatnie przekręć rurkę i odwiruj w dół.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby przygotować stabilny kompleks mimimiku miRNA znakowanego PEI-NPs-Cy3.</li>
	<li>Umieść mysz UUO głową do przodu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml bez znieczulenia, a następnie umieść ogonek przez przygotowany otwór w nasadce.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1,0 ml igłą 27 G z 200 μl kompleksu naśladującego PEI-NPs-Cy3-miRNA.</li>
	<li>Wstrzyknąć PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) przez żyłę ogonową myszy za pomocą strzykawki 1,0 ml z igłą 27 G. 
	UWAGA: Przetrzyj żyłę ogonową watą nasączoną etanolem (70%-80%), aby rozszerzyć żyłę ogonową i zdezynfekować obszar wstrzyknięcia.</li>
	<li>Godzinę po wstrzyknięciu 200 μl kompleksu naśladującego PEI-NPs-Cy3-miRNA, znieczulij mysz izofluranem (4%-5%) za pomocą odpowiedniego urządzenia znieczulającego dla małych zwierząt. Potwierdź głębokość znieczulenia przy braku odruchu szczypania palców u stóp. Utrzymuj znieczulenie izofluranem (3%) przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Następnie wykonaj nacięcie w skórze, mięśniach i żebrach za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby odsłonić serce. Po wykonaniu nacięcia w prawym przedsionku wstrzyknij PBS do lewej komory, aby wyciągnąć krew z całego ciała, aż kolor nerek zmieni się na bladożółty (co wskazuje, że całe ciało myszy jest perfundowane PBS). 
	UWAGA: Perfuzja serca jest wykonywana w celu skutecznego usunięcia krwi z całego organizmu.</li>
	<li>Odstaw izofluran i usuń nerki od myszy i umyj je PBS. Następnie usuń kapsułki nerkowe z nerek i dwukrotnie przemyj nerki PBS.</li>
	<li>Zanurz próbki tkanki nerkowej w związku OCT i zamroź w ciekłym azocie.</li>
	<li>Do przygotowania skrawków za pomocą kriostatu (o grubości 5 μm). Zamontuj sekcje na szkiełkach szklanych pokrytych silanem i przymocuj je 4% paraformaldehydem. 
	UWAGA: Tkanki nerkowe można opcjonalnie barwić lektyną Lotus tetragonolobus znakowaną fluoresceiną (2 mg / ml) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny dla kanalików proksymalnych, a następnie DAPI (30 nM w PBS) w temperaturze pokojowej przez 15 minut dla jąder komórkowych.</li>
	<li>Delikatnie umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą PBS.</li>
	<li>Wizualizacja barwienia fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy powiększeniu 100x i 400x oraz odpowiedniego oprogramowania do obrazowania.</li>
</ol>
3. Potwierdzenie docelowych zmian miRNA po dostarczeniu mimimiki do nerki przez PEI-NP poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej
<ol>
	<li>Przeprowadź ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), aby potwierdzić docelowe zmiany miRNA. 
	UWAGA: Zapoznaj się z wcześniej opublikowanym artykułem, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat qRT-PCR18,19,20. System qRT-PCR wykorzystany do wygenerowania reprezentatywnych wyników podanych poniżej został zmieniony przez producenta. qRT-PCR należy przeprowadzić zgodnie z najnowszym protokołem producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Mohr, A. M., Mott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+microRNA+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Overview of microRNA biology.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).</li>
<li>Bushati, N., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">microRNA functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).</li>
<li>Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs+in+diabetic+nephropathy%3A+From+biomarkers+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy.</a> Current Diabetes Reports. 16 (3), 35(2016).</li>
<li>Yheskel, M., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+microRNAs+in+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).</li>
<li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li>
<li>Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+revolution%3A+RNA+interference+as+basic+biology%2C+research+tool%2C+and+therapeutic%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic.</a> Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).</li>
<li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+treatment%3A+siRNAs+as+small+molecule+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li>
<li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li>
<li>Deng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klotho+gene+delivery+ameliorates+renal+hypertrophy+and+fibrosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats+by+suppressing+the+Rho-associated+coiled-coil+kinase+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressor+of+cytokine+signaling+%28SOCS%29+2+attenuates+renal+lesions+in+rats+with+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy.</a> Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).</li>
<li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).</li>
<li>Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+therapy%3A+Current+state+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry.+Biokhimiia%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives.</a> Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).</li>
<li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+microRNA-146a+with+polyethylenimine+nanoparticles+inhibits+renal+fibrosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).</li>
<li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%3A+The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).</li>
<li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%3A+The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in acute kidney injury.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).</li>
<li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+non-viral+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li>
<li>Swami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+and+highly+efficient+nonviral+DNA%2FsiRNA+delivery+system+based+on+PEI-bisepoxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+microRNA+expression+in+the+kidneys+of+immunoglobulin+a+nephropathic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535(2020).</li>
<li>Yanai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+evaluation+of+microRNA+expressions+in+mouse+kidney+with+unilateral+ureteral+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383(2020).</li>
<li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+detection+method+for+microRNAs+in+the+kidney+of+an+ischemic+kidney+injury+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378(2020).</li>
<li>Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-fibrotic+activity+of+plasmid+DNA+expressing+small+interference+RNA+for+TGF-beta+type+II+receptor+for+a+mouse+model+of+obstructive+nephropathy+by+cationized+gelatin+prepared+from+different+amine+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+renal+tubulointerstitial+fibrosis+by+small+interfering+RNA+targeting+heat+shock+protein+47%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47.</a> American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+of+hepatocyte+growth+factor+to+skeletal+muscle+prevents+changes+in+rat+kidneys+after+5%2F6+nephrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%3A+Official+Journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy.</a> American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).</li>
<li>Hamar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA+targeting+Fas+protects+mice+against+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenon+preconditioning+protects+against+renal+ischemic-reperfusion+injury+via+HIF-1alpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA+knockdown+of+connective+tissue+growth+factor+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction+improves+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Korzystając z protokołu przedstawionego w tym manuskrypcie, PEI-NP mogą dostarczać miRNA naśladujące nerki w celu wywołania nadekspresji docelowych miRNA, co skutkuje efektami leczenia w mysich modelach in vivo kilku chorób nerek, w tym zwłóknienia nerek, cukrzycowej choroby nerek i AKI.
Sposób przygotowania kompleksu naśladowców PEI-NP i miRNA jest bardzo prosty. Dodatnio naładowana powierzchnia PEI-NP więzi mimikę miRNA, gdy są one po prostu zmieszane 13,14,15,16,17 <sup ...

miRNA, małe niekodujące RNA (21-25 zasad), które nie są przekształcane w białka, hamują wiele docelowych informacyjnych RNA (mRNA) poprzez destabilizację ich i hamowanie ich translacji w różnych chorobach nerek1,2. Dlatego terapia genowa wykorzystująca egzogenne, sztucznie syntetyzowane mimiki lub inhibitory miRNA jest potencjalną nową opcją hamowania rozwoju wielu chorób nerek3,4,5.
Pomimo obietnicy mimików lub inhibitorów miRNA dla terapii genowej, dostarczanie do docelowych organów pozostaje dużą przeszkodą dla eksperymentów in vivo w celu rozwinięcia ich potencjału klinicznego. Ponieważ sztucznie zsyntetyzowane mimiki lub inhibitory miRNA podlegają natychmiastowej degradacji przez RNazę surowicy, ich okres półtrwania ulega skróceniu po podaniu ogólnoustrojowym in vivo6. Dodatkowo, skuteczność mimików lub inhibitorów miRNA w przenikaniu przez błonę plazmatyczną i transfekcję cytoplazmy jest na ogół znacznie niższa bez odpowiednich wektorów7,8. Te dowody sugerują, że konieczne jest opracowanie systemu dostarczania miRNA lub inhibitorów miRNA, aby umożliwić ich stosowanie w warunkach klinicznych i uczynić je nową opcją leczenia dla pacjentów z różnymi chorobami nerek.
Wektory wirusowe zostały użyte jako nośniki do dostarczania egzogennych mimików lub inhibitorów do nerki9,10. Chociaż wektory wirusowe zostały opracowane z myślą o bezpieczeństwie biologicznym i skuteczności transfekcji, mogą nadal powodować odpowiedź interferonową i/lub niestabilność genetyczną11,12. Aby przezwyciężyć te obawy, opracowaliśmy system dostarczania miRNA naśladujący nerki przy użyciu nanocząstek polietyleneniminy (PEI-NPs), wektora niewirusowego, w kilku mysich modelach choroby nerek13,14,15.
PEI-NPs to liniowe nanocząsteczki na bazie polimerów, które mogą skutecznie dostarczać oligonukleotydy, w tym mimiki miRNA, do nerki i są uważane za preferowane do przygotowania wektorów niewirusowych ze względu na ich długoterminowe bezpieczeństwo i biokompatybilność13,16,17.
To badanie pokazuje efekty systematycznego dostarczania egzogennych miRNA za pomocą PEI-NPs poprzez iniekcję do żyły ogonowej u myszy modelujących zwłóknienie nerek wytwarzanych przez jednostronną niedrożność moczowodu (UUO). Dodatkowo pokazujemy efekty systematycznego egzogennego dostarczania mimimicznego miRNA za pomocą PEI-NPs poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej u myszy modelowych z cukrzycową chorobą nerek (myszy db / db: C57BLKS / J Iar -+ Leprdb / + Leprdb) i myszy z modelem ostrego uszkodzenia nerek wytwarzanego przez uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne nerek (IRI).

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol do barwienia jądra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RPE</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Bufor do płukania 2</td></tr><tr><td>Bufor RWT</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>Bufor do płukania 1</td></tr><tr><td>Kontrolny miRNA-mimiczny (sztucznie zsyntetyzowany miRNA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nie przypisano</td><td>5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3' (sens) 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3&prime; (antysens)</td></tr><tr><td>Dwuniciowe oligonukleotydy znakowane Cy3</td><td>Takara Bio Inc.</td><td></td><td></td>MIR7900</tr><tr><td>Znakowana fluoresceiną lektyna Lotus tetragonolobus</td><td>Vector Laboratories Inc</td><td>FL-1321</td><td></td></tr><tr><td>In vivo-jetPEI</td><td>Polyplus</td><td>101000021</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Opyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna do qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96-dołkowa płytka reakcyjna</td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczna folia samoprzylepna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>Folia adhezyjna do 96-dołkowej płytki reakcyjnej</td></tr><tr><td>miRNA-146a-5p mimicznej (sztucznie zsyntetyzowanej miRNA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nie przypisano</td><td>5'-UGAGAACUAUUCCAUGGGU UT-3&prime; (sens) 5'-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUUU -3&prime; (antysens)</td></tr><tr><td>starter miRNA-146a-5p</td><td>Qiagen</td><td>MS00001638</td><td>Niedostępne, ponieważ Qiagen zmienił zestawy qRT-PCR (z systemu miRNA PCR miRNA miRCRY na miRCURY LNA miRNA PCR System od maja 2021 r.)</td></tr><tr><td>miRNA-181b-5p mimic (sztucznie zsyntetyzowane miRNA)</td><td>Projekt genu</td><td>Nie przypisano</td><td>5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3'</td></tr><tr><td>miRNA-181b-5p starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00006083</td><td>Niedostępne, ponieważ Qiagen zmienił zestawy qRT-PCR (z systemu miScript miRNA PCR na miRCURY LNA miRNA PCR System od maja 2021 r.)</td></tr><tr><td>miRNA-5100-mimic (sztucznie zsyntetyzowane miRNA)</td><td>Projekt genu</td><td>Nie przypisano</td><td>5'-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&prime;</td></tr><tr><td>miRNA-5100-primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00042952</td><td>Niedostępne, ponieważ firma Qiagen zmieniła zestawy qRT-PCR (z systemu miScript miRNA PCR na miRCURY LNA miRNA PCR System od maja 2021 r.)</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Kolumna wirowa zakotwiczona w membranie w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml</td></tr><tr><td>zestaw miScript II RT</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Niedostępne, ponieważ firma Qiagen zmieniła zestawy qRT-PCR (z systemu miScript miRNA PCR na system miRCURY miRNA miRNA PCR od maja 2021 r.)</td></tr><tr><td>Zestaw miScript SYBR Green PCR</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Niedostępne, ponieważ firma Qiagen zmieniła zestawy qRT-PCR (z systemu miScript miRNA PCR na system miRCURY LNA miRNA PCR od maja 2021 r.)</td></tr><tr><td>Niszczarka QIA</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Biopolimerowe kolumny wirowe w probówce</td></tr> <tr><td>zbiorczej o pojemności 2,0 mlQIAzol Odczynnik do lizy</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny</td></tr><tr><td>System Real-Time PCR QuantStudio 12K Flex Scientific</td> Turbo <td>Scientific</td><td>4472380</td><td>Instrument do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Oprogramowanie w wersji 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific 4472380</td><td></td><td>Oprogramowanie instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Starter RNU6-2</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>Niedostępne, ponieważ Qiagen zmienił zestawy qRT-PCR (z systemu miRNA PCR miRNA miRCRY na system miRCURY LNA miRNA PCR od maja 2021 r.)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT (Związek o optymalnej temperaturze cięcia)</td><td>Sakura Finetek Japan Co., Ltd.</td><td>Nie przypisano</td><td></td></tr></tbody></table>

dostarczanie egzogennego, sztucznie syntetyzowanego mirna naśladującego mimikę do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w kilku mysich modelach choroby nerek

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

mikroRNA (miRNA), małe niekodujące RNA (21-25 zasad), które nie są translowane na białka, hamują wiele docelowych informacyjnych RNA (mRNA) poprzez destabilizację i hamowanie ich translacji w różnych chorobach nerek. Dlatego zmiana ekspresji miRNA przez egzogenne sztucznie zsyntetyzowane mimiki miRNA jest potencjalnie użyteczną opcją leczenia w hamowaniu rozwoju wielu chorób nerek. Ponieważ jednak RNAaza w surowicy natychmiast ulega systematycznej degradacji podawanych egzogennych mimimików in vivo, dostarczanie miRNA do nerki pozostaje wyzwaniem. Dlatego niezbędne są wektory, które mogą chronić egzogenne mimimiki przed degradacją przez RNAazę i w znacznym stopniu dostarczać je do nerek. W wielu badaniach wykorzystano wektory wirusowe do dostarczania egzogennych mimimików lub inhibitorów do nerek. Jednak wektory wirusowe mogą powodować odpowiedź interferonową i/lub niestabilność genetyczną. W związku z tym rozwój wektorów wirusowych jest również przeszkodą w klinicznym zastosowaniu egzogennych mimików lub inhibitorów. Aby przezwyciężyć te obawy dotyczące wektorów wirusowych, opracowaliśmy metodę wektora niewirusowego do dostarczania miRNA naśladujących miRNA do nerki za pomocą wstrzykiwania do żyły ogonowej nanocząstek polietyleniminy (PEI-NPs), co doprowadziło do znacznej nadekspresji docelowych miRNA w kilku mysich modelach choroby nerek.

Docelowe miRNA dla włóknienia nerek, nefropatii cukrzycowej i AKI, opisane poniżej, zostały wybrane na podstawie analizy mikromacierzy, qRT-PCR i/lub badań baz danych pod kątem zastosowań w terapii genowej. Aby uzyskać więcej szczegółów, należy odnieść się do wcześniejszych publikacji13,14,15.
Dostarczanie i efekty mimiku miRNA-146a-5p przy użyciu PEI-NP u myszy z włóknieniem nerek<st...

Tutaj dostarczamy egzogenne, sztucznie syntetyzowane mimiki miRNA do nerki poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej wektora niewirusowego i nanocząsteczek polietyleniminy w kilku modelach myszy z chorobą nerek. Doprowadziło to do znacznej nadekspresji docelowego miRNA w nerce, co spowodowało zahamowanie progresji choroby nerek w kilku modelach mysich.

Dostarczanie egzogennego, sztucznie syntetyzowanego miRNA naśladującego mimikę do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w kilku mysich modelach choroby nerek

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w terapii mikroRNA nerki, która pozostaje wyzwaniem. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwiła terapię mikroRNA naśladującą nerki bez powodowania odpowiedzi interferonowej lub niestabilności genetycznej. Zacznij od rozpuszczenia 10 mikrolitrów PEI-NPs w 90 mikrolitrach 5% roztworu glukozy w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.Następnie delikatnie przekręć rurkę i odwiruj w dół. Wymieszaj 50 mikrolitrów sztucznie zsyntetyzowanych miRNA rozpuszczonych w 100 mikromolach wody wolnej od nukleaz z 50 mikromolami 10% roztworu glukozy w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Delikatnie przekręć rurkę i odwiruj w dół.W wyniku tego procesu powstaje miRNA rozpuszczone w 5% roztworze glukozy. Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów PEI-NP w 5% roztworze glukozy i 100 mikrolitrów miRNA naśladujących w 5% roztworze glukozy. Delikatnie przekręć rurkę i odwiruj w dół.Inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby przygotować stabilny kompleks miRNA naśladujący PEI-NPs. Rozpuść dwa mikrolitry PEI-NPs w 98 mikrolitrach 10% roztworu glukozy w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej. Delikatnie przekręć rurkę i odwi

delivery-exogenous-artificially-synthesized-mirna-mimic-to-kidney

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie prezentujemy protokół hydrodynamicznego wstrzykiwania plazmidów do miedniczki nerkowej myszy w celu transfekcji kwasów nukleinowych. Technika ta umożliwia dostarczanie plazmidów specyficznie dla narządu, wykorzystując zasadę wysokiego ciśnienia hydrostatycznego, które z impetem kieruje plazmidy do określonego miejsca, nie powodując uszkodzenia tkanek.

Hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miednicy nerkowej: technika bezpośredniego dostarczania DNA do komórek nerkowych modelu mysiego

Ten artykuł opisuje protokół hybrydyzacji in situ zoptymalizowany do kolormetrycznego wykrywania ekspresji mikroRNA w stałych odcinkach nerki z formaliną.

Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

Ten protokół opisuje metodę wstrzykiwania plazmidowego DNA do nerki myszy przez miedniczkę nerkową w celu wytworzenia ekspresji transgenu specyficznie w nerce.

Hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej w celu niewirusowej ekspresji białek w nerce

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu ostrego uszkodzenia nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Protokół ten kładzie nacisk na mysi model niedokrwiennego uszkodzenia nerek i staranną ekstrakcję próbek mikroRNA.

Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

Opisujemy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO) za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Protokół ten jest odpowiedni do badania profili ekspresji mikroRNA nerek u myszy z UUO oraz w kontekście innych stanów patologicznych.

Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

mikroRNA biorą udział w patogenezie nefropatii IgA. Opracowaliśmy niezawodną metodę wykrywania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Ta nowa metoda ułatwi sprawdzenie udziału miRNA w nefropatii IgA.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A

Niniejszy manuskrypt opisuje metodę celowanego podania do pojedynczej nerki za pomocą cewnika umieszczonego w aorcie podnierzeni brzusznej myszy.

Bezpośrednie podawanie leku do nerki przez tętnicę nerkową

Przedstawiamy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją.

Ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek

Tutaj opisujemy protokół dostarczania in vivo magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przenoszących oligomery RNA do przerzutowego raka piersi w modelach zwierzęcych, zapewniając klinicznie realne podejście do terapeutycznego wyciszania onkogennych kwasów nukleinowych.

Monitorowanie akumulacji nanoleków w przerzutach mysiego raka piersi

Ten raport szczegółowo opisuje zlokalizowany sposób wstrzyknięcia wektorów AAV za pośrednictwem miednicy nerkowej w celu skutecznego i bezpiecznego przeniesienia genu do nerki myszy.

Skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do nerki myszy poprzez powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów adeno-stowarzyszonych wirusów

Poznaj metodę dostarczania miRNA do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w modelach mysich chorób nerek. Technika ta umożliwia terapię bez wywoływania odpowiedzi interferonowej.

Dostarczanie egzogennego, sztucznie syntetyzowanego miRNA naśladującego mimikę do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w kilku mysich modelach choroby nerek (Wideo) | JoVE Journal

Dostarczanie egzogennego, sztucznie syntetyzowanego miRNA naśladującego mimikę do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w kilku mysich modelach choroby nerek

Przeglądaj więcej filmów