Name: Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak chirurgia molekularna kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metodę włączania analogów proliny do białek fluorescencyjnych w celu badania fałdowania i stabilności. Technika ta pozwala na precyzyjną modyfikację szkieletu białkowego bez konieczności stosowania drogiego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą (Klaster Doskonałości "Unifying Systems in Catalysis") dla T.F. i N.B. oraz przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Nauki (BMBF Program "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) dla F.-J.S. i T.M.T.T.

Autorzy ujawniają wszelkie konflikty interesów.

W naturze manipulacje strukturami i funkcjami białek zwykle zachodzą z powodu mutacji, zjawiska, które prowadzi do wymiany tożsamości aminokwasów w określonych pozycjach w sekwencji białka. Ten naturalny mechanizm jest szeroko stosowany jako metoda biotechnologiczna inżynierii białkowej w postaci mutagenezy i opiera się na repertuarze 20 kanonicznych aminokwasów biorących udział w tym procesie. Wymiana reszt proliny jest jednak problematyczna. Ze względu na specjalną architekturę grupy szkieletowej, jest on prawie niewymienny z pozostałymi 19 pozostałościami do wymiany72. Na przykład prolina jest zwykle znana jako łamacz struktur drugorzędowych w sekwencjach polipeptydowych ze względu na jej słabą kompatybilność z najczęstszymi strukturami drugorzędowymi, tj. α-helisą i nicią β. Ta cecha proliny jest łatwo tracona, gdy reszta jest zmutowana do innego aminokwasu ze wspólnego repertuaru. Zastąpienie proliny jej chemicznymi analogami stanowi alternatywne podejście, które umożliwia zachowanie podstawowych cech szkieletu macierzystej reszty proliny, przy jednoczesnym narzuceniu odchylenia na jej specyficzne przejścia konformacyjne lub wytwarzaniu modulacji objętości cząsteczkowej i polarności. Na przykład możliwe jest dostarczanie kultur bakteryjnych o strukturach analogowych, takich jak hydroksy-, fluoro-, alkilo-, dehydroproliny, struktury o zmiennych rozmiarach pierścieni i inne, ułatwiając w ten sposób produkcję białka zawierającego specyficzne zmiany reszty proliny.
Opisana w tym badaniu metoda selektywnego włączania ciśnienia (SPI) pozwala na globalną, tj. specyficzną dla reszty wymianę wszystkich prolin w białku docelowym na pokrewne analogi chemiczne. O znaczeniu metody świadczy fakt, że SPI pozwala na tworzenie zmian sekwencji niedostępnych dla powszechnych technik mutagenezy. Na przykład pozwala na produkcję docelowego białka zawierającego raczej niewielkie zmiany strukturalne, które zazwyczaj nie mogą przekraczać jednej lub dwóch podmian/delecji/addycji atomów, jak wykazano w tym badaniu. Takie modyfikacje białek nazywane są "mutacjami atomowymi"73,74. W białku fluorescencyjnym, takim jak GFP, wynik tej intruzji molekularnej można zaobserwować w prędkości fałdowania, lokalnych polaryzacjach, upakowaniu białek, stabilności zaangażowanych cech strukturalnych. Zmiany właściwości absorbancji i fluorescencji powstają pośrednio w wyniku wpływu na fałdowanie białek i mikrośrodowiska pozostałości. Precyzja zmian molekularnych zachodzących w SPI jest zazwyczaj znacznie wyższa w porównaniu z mutacjami prolin do innych reszt kanonicznych, przy czym te ostatnie są zazwyczaj szkodliwe dla fałdowania, produkcji i izolacji białek.
Jako metodę produkcji, podejście SPI wykorzystuje tolerancję substratową kieszeni syntetazy aminoacylo-tRNA w stosunku do chemicznych analogów natywnego aminokwasu. Syntetaza jest odpowiedzialna za prawidłową identyfikację struktury aminokwasu, podczas gdy włączenie do białek następuje w dalszej części procesu translacji. Instrumentalnie produkcja, izolacja i oczyszczanie białek w SPI odbywa się w sposób typowy dla wszelkich innych technik ekspresji białek rekombinowanych; jednak z pewnymi dodatkami do protokołu, jak następuje: Prolina, która jest związana z wymianą, jest dostarczana na początku procesu fermentacji, dzięki czemu komórki mogą rosnąć i rozwijać swoją nienaruszoną maszynerię komórkową. Jednak hodowla komórkowa nie może osiągnąć maksymalnej gęstości optycznej, aby utrzymać komórki w fazie logarytmicznej optymalnej dla ekspresji białek. W tym momencie istnieją dwie główne odmiany metody SPI. W pierwszym z nich stężenie proliny jest regulowane w początkowym pożywce wzrostowej (pożywce zdefiniowanej chemicznie) w taki sposób, że wyczerpanie proliny następuje bez ingerencji z zewnątrz. Komórki wydalają prolinę w pożywce, zanim będą mogły wyjść z logarytmicznej fazy wzrostu, a następnie dodaje się analog i indukuje się produkcję białka będącego przedmiotem zainteresowania. W drugiej wersji metody komórki hoduje się w pożywce zawierającej prolinę do połowy ich fazy logarytmicznej. W tym momencie komórki należy wyjąć i fizycznie przenieść do innego podłoża, które nie zawiera już proliny, tylko analog, z późniejszą indukcją interesującego białka. W obu wersjach analog i odczynnik do indukcji białek są dostarczane do wstępnie wyhodowanych komórek. Izolację i oczyszczanie białka typu dzikiego przeprowadza się w taki sam sposób, jak w przypadku wariantów. W zasadzie każdy dostępny szczep proauksotroficzny może być używany jako gospodarz ekspresji. Niemniej jednak wskazane są testy ekspresji w celu zidentyfikowania najbardziej odpowiedniego gospodarza. Testy różnych chemicznie zdefiniowanych pożywek mogą być również wykorzystane do optymalizacji wydajności białka.
Istnieją pewne wymagania dotyczące analogów chemicznych, które należy wziąć pod uwagę dla SPI, takie jak rozpuszczalność i stężenie. Dostępność metaboliczna i wychwyt aminokwasów zależą od liczby rozpuszczonych cząsteczek w pożywce. Aby zwiększyć rozpuszczalność określonego związku, można wybrać warunki lekko kwaśne lub zasadowe. Ponieważ sztuczne cząsteczki mogą powodować działanie hamujące wzrost ze względu na ich toksyczność komórkową, stężenie powinno być obniżone do minimum, aby uniknąć stresu komórkowego75.
Drobną słabością SPI jest spadek efektywności inkorporacji przy większej liczbie pozycji, które trzeba wymienić. Zasadniczo zmniejszenie częstości aminokwasów w docelowej biomolekułach przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce może rozwiązać ten problem. Jednak na właściwości strukturalne i funkcjonalne pożądanego białka może mieć wpływ zmiana struktury pierwszorzędowej.
Jak wspomniano wcześniej, SPI umożliwia specyficzną dla reszty wymianę aminokwasu kanonicznego. Oznacza to, że aminokwasy niekanoniczne są wprowadzane w każdą pozycję aminokwasu kanonicznego w białku docelowym, w tym konserwatywne reszty, które są niezbędne do funkcjonowania białka lub fałdowania. Alternatywne metody włączania specyficznego dla danego miejsca są jedyną możliwością przezwyciężenia tego problemu3. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano metodę par ortogonalnych, która może wytwarzać białka zawierające zmodyfikowane reszty w określonych miejscach. Najczęstszą modyfikacją tej metody jest tzw. supresja kodonu stop. Metoda ta opiera się na zaprojektowanym ortogonalnym systemie translacji dedykowanym do specyficznego dla miejsca wprowadzania syntetycznych aminokwasów76. Do tej pory przy użyciu tego podejścia do białek włączono ponad 200 aminokwasów o różnych modyfikacjach łańcucha bocznego77. Jednak te systemy translacyjne nadal nie nadają się do insercji analogów proliny do białek docelowych. Co więcej, wydajność metody jest uważana za niską w przypadku niewielkich modyfikacji aminokwasów, ponieważ pewna rozwiązłość tła syntetazy aminoacylo-tRNA zwykle pozostaje w zmodyfikowanych systemach translacji.
Za pomocą SPI wyprodukowaliśmy szereg β-beczkowych wariantów białek fluorescencyjnych i zbadaliśmy wyniki wymiany proliny z jej nienaturalnymi analogami. W przypadku zastąpienia proliny przez R-Flp i Dfp, dysfunkcyjne białko zostało wytworzone przez gospodarza ekspresji. Efekt ten jest prawdopodobnie spowodowany nieprawidłowym fałdowaniem białek. Ten ostatni może pochodzić z konformacji C 4-egzo promowanej przez R-Flp, która nie jest faworyzowana przez macierzyste struktury białkowe27. W przypadku Dfp nieprawidłowe fałdowanie prawdopodobnie jest spowodowane zmniejszoną prędkością izomeryzacji wiązania peptydowego trans-to-cis na reszcie proliny27. Wiadomo, że ten ostatni jest jednym z etapów ograniczających w profilu kinetycznym fałdowania białka, który wpływa na tworzenie β-beczki, a następnie dojrzewanie chromoforu. Rzeczywiście, w przypadku obu aminokwasów, R-Flp i Dfp, produkcja białka doprowadziła do zagregowanego i nierozpuszczalnego białka. W związku z tym nie mogło dojść do powstania chromoforu, a fluorescencja została całkowicie utracona. Jednak w przypadku S-Flp i Dhp zaobserwowano prawidłowe dojrzewanie białek, w wyniku czego uzyskano próbki białek fluorescencyjnych dla każdej kombinacji analog/białko. Pomimo pewnych modulacji cech absorbancji i fluorescencji białka, w dużej mierze pozostały one podobne do tych w białkach typu dzikiego. Efekt substytucji aminokwasów został ujawniony w badaniach kinetyki fałdowania. Ten ostatni wykazał szybsze ponowne fałdowanie w przypadku zastąpienia S-Flp. Badania modelowe wykazały, że ta pozostałość może powodować pewną poprawę prędkości rotacji amidu trans-do cisu i prowadzić do powstania konformacji C4-endo. Oba te czynniki mogą przyczyniać się do korzystnych skutków kinetycznych tej pozostałości w EGFP. W przeciwieństwie do tego, Dhp wytwarzał kinetyczne profile fałdowania maksymalnie podobne do białka macierzystego. Różnorodność wyników uzyskanych przez zwykłe mutacje atomowe w badanych białkach fluorescencyjnych ilustruje potencjał metody produkcji SPI w zmianie właściwości białek docelowych. Zmiany białek wywołane przez zastąpienie proliny analogami mają dalsze implikacje w inżynierii enzymów 78,79,80 i kanałów jonowych 81,82, a także w ogólnej inżynierii stabilności białek.
Podstawowym ograniczeniem metody SPI jest jej tryb "all-or-none" w wymianie proliny na pokrewne analogi. Byłoby bardzo korzystne, gdyby można było precyzyjnie wybrać, które reszty proliny należy zastąpić analogami, a które powinny pozostać niezmodyfikowane. Jednak obecnie nie ma techniki, która pozwoliłaby na przeprowadzenie tak wyrafinowanej produkcji przy użyciu gospodarza produkcji mikrobiologicznej. Chemiczna synteza białek83,84, a także produkcja bezkomórkowa85,86, to dwie alternatywne metody, które mogą powodować modyfikacje proliny specyficzne dla pozycji. Niemniej jednak ich złożoność operacyjna i niska wydajność produkcji sprawiają, że są gorsze w porównaniu z produkcją w żywych komórkach. Jak dotąd, SPI pozostaje najprostszym pod względem operacyjnym i niezawodnym podejściem do produkcji złożonych białek z mutacjami atomowymi. Wprowadzając nienaturalne substytuty aminokwasów, metoda pozwala na modyfikację cech białek w sposób ukierunkowany, czego przykładem są zmiany w fałdowaniu i absorpcji/emisji światła białek fluorescencyjnych generowanych przez substytucje proliny.

Klasyczna mutageneza ukierunkowana na miejsce pozwala na permutację dowolnej istniejącej sekwencji białka kodowanej przez gen poprzez manipulację kodonami na poziomie DNA. Aby zbadać fałdowanie i stabilność białek, często pożądane jest zastąpienie podobnych aminokwasów podobnymi odpowiednikami. Jednak tradycyjna mutageneza białek jest zdecydowanie ograniczona do strukturalnie podobnych zamienników wśród kanonicznych aminokwasów, takich jak Ser/Ala/Cys, Thr/Val, Glu/Gln, Asp/Asn, Tyr/Phe, które są obecne w standardowym repertuarze kodów genetycznych. Z drugiej strony, nie ma takich możliwości dla innych kanonicznych aminokwasów, takich jak Trp, Met, His lub Pro, które często odgrywają istotną rolę strukturalną i funkcjonalną w białkach1. Idealnym podejściem do badania tych oddziaływań w kontekście wysoce specyficznej wewnętrznej architektury białek i ich procesu fałdowania jest generowanie niezakłócających modyfikacji izosterycznych. Rzeczywiście, gdy izosteryczne analogi aminokwasów tych kanonicznych aminokwasów, znanych również jako aminokwasy niekanoniczne (ncAA), są wprowadzane do białek, pozwalają na subtelne zmiany nawet na poziomie pojedynczych atomów lub grup atomów, takich jak H/F, CH2/S/Se/Te znanych jako "mutacje atomowe"<klasa sup = "xref">2. Taka "chirurgia molekularna" wytwarza zmienione białka, których właściwości wynikają wyłącznie z wymiany pojedynczych atomów lub grup atomów, które w sprzyjających przypadkach mogą być analizowane, a wykryte zmiany mogą być racjonalizowane. W ten sposób zakres syntezy białek w celu badania fałdowania i struktury białek wykracza daleko poza klasyczną mutagenezę DNA. Należy zauważyć, że białka generowane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce są zwykle określane jako "mutanty", podczas gdy białka z podstawionymi aminokwasami kanonicznymi są określane jako "warianty" 3, "alloproteins"4, lub "kongenery białkowe"5.
Białko zielonej fluorescencji (GFP), po raz pierwszy zidentyfikowane w organizmie morskim Aequorea victoria, wykazuje jasnozieloną fluorescencję po wystawieniu na działanie światła ultrafioletowego do niebieskiego6,7. Obecnie GFP jest powszechnie stosowany jako bardzo czułe narzędzie do znakowania do rutynowej wizualizacji ekspresji genów i lokalizacji białek w komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. GFP okazał się również przydatny w różnych badaniach biofizycznych8,9,10 i biomedical11,12, a także w inżynierii białek13,14,15. Wnikliwa analiza struktury GFP pozwoliła na stworzenie licznych wariantów charakteryzujących się zróżnicowaną stabilnością i maksimami fluorescencji16,17. Większość wariantów GFP stosowanych w biologii komórkowej i molekularnej to białka monomeryczne zarówno w roztworze, jak i w klasie crystal<sup="xref">18. Ich główna organizacja strukturalna jest typowa dla wszystkich członków rodziny GFP, niezależnie od ich pochodzenia filogenetycznego, i składa się z 11 β-nici tworzących tzw. β-beczkę, podczas gdy załamana α-helisa biegnie przez środek lufy i nosi chromofor (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Autokatalityczne dojrzewanie chromoforu (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1B) wymaga precyzyjnego umiejscowienia otaczających go łańcuchów bocznych w centralnym miejscu białka; wiele z tych łańcuchów bocznych jest wysoce konserwatywnych w innych wariantach GFP19. W większości białek fluorescencyjnych z meduz, takich jak Aequorea victoria, chromofor emitujący zieleń składa się z dwóch pierścieni aromatycznych, w tym pierścienia fenolowego Tyr66 i pięcioczłonowej heterocyklicznej struktury imidazolinonu (<silna klasa = "xfig">Figura 1B). Chromofor, odpowiednio osadzony w matrycy białkowej, odpowiada za charakterystyczną fluorescencję całego białka. Znajduje się w centrum konstrukcji, podczas gdy struktura beczki izoluje ją od medium wodnego20. Wystawienie chromoforu na działanie wody spowodowałoby wygaszenie fluorescencji, tj. utratę fluorescencji21.
Prawidłowe zagięcie struktury przypominającej beczkę jest niezbędne do ochrony chromoforu przed wygaszaniem fluorescencji22. Pozostałości proliny (Pro) odgrywają szczególną rolę w organizacji strukturalnej GFP23. Nie będąc w stanie utrzymać nici β, stanowią pętle łączące odpowiedzialne za utrzymanie struktury białka jako całości. Nic dziwnego, że 10-15 reszt proliny znajduje się zarówno w GFP pochodzących z Aequorea, jak i Anthoathecata; Niektóre z nich są wysoce konserwatywne w innych typach fluorescencyjnych białek β-beczkowych. Oczekuje się, że proliny będą miały decydujący wpływ na właściwości składania ze względu na ich szczególne cechy geometryczne. Na przykład w GFP pochodzących z Aequorea, z dziesięciu reszt proliny (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A), dziewięć tworzy trans-, a tylko jedna tworzy wiązanie cis-peptydowe (Pro89). Pro58 jest niezbędny, tzn. nie można go stosować zamiennie z pozostałymi 19 aminokwasami kanonicznymi. Pozostałość ta może być odpowiedzialna za prawidłowe pozycjonowanie reszty Trp57, która została uznana za kluczową dla dojrzewania chromoforu i ogólnego składania GFP24. Fragment PVPWP z trzema resztami proliny (Pro54, Pro56, Pro58) i Trp57 jest zasadniczą częścią "dolnej powieki" w strukturze GFP z <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. Motyw strukturalny PVPWP znajduje się w kilku białkach, takich jak cytochromy i eukariotyczne kanały potasowe aktywowane napięciem25. Substytucja proliny do alaniny w pozycjach 75 i 89 jest również szkodliwa dla ekspresji i fałdowania białek oraz znosi dojrzewanie chromoforów. Pro75 i Pro89 są częścią "górnej pokrywy" zakopującej chromofor (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) i są zachowane w 11-niciowych β-beczkowych białkach fluorescencyjnych23. Te dwie "pokrywki" utrzymują chromofor z dala od wodnego rozpuszczalnika, nawet jeśli stabilna struktura trzeciorzędowa została częściowo złamana26. Taka specyficzna architektura molekularna chroni fluorofor przed kolizyjnym (dynamicznym) wygaszaniem fluorescencji, np. przez wodę, tlen lub inne dyfuzyjne ligandy.
Aby przeprowadzić inżynierię molekularną struktury GFP, należy wprowadzić podstawienia aminokwasów w podstawowej strukturze białka. Na GFP przeprowadzono liczne mutacje, które zapewniły wariantom podwyższoną stabilność, szybkie i niezawodne fałdowanie oraz zmienne właściwości fluorescencji17. Niemniej jednak w większości przypadków mutacja reszt proliny jest uważana za ryzykowne podejście ze względu na fakt, że żaden z pozostałych 19 kanonicznych aminokwasów nie jest w stanie prawidłowo przywrócić profilu konformacyjnego reszty proliny27. W związku z tym opracowano alternatywne podejście, w którym reszty proliny są zastępowane innymi strukturami opartymi na prolinie, nazwanymi analogami proliny28. Ze względu na swoją unikalną cykliczną strukturę chemiczną, prolina wykazuje dwie charakterystyczne przemiany konformacyjne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C): 1) marszczenie się pierścienia proline, szybki proces pociągający za sobą organizację kręgosłupa, który wpływa przede wszystkim na kąt skrętu φ, oraz 2) izomeryzację wiązania peptydowego cis/trans, powolny proces wpływający na fałdowanie kręgosłupa pod kątem skrętu ω. Ze względu na swój powolny charakter, to ostatnie przejście jest powszechnie odpowiedzialne za etapy ograniczające szybkość w procesie fałdowania całego białka. Wykazano wcześniej, że izomeryzacja wiązania peptydowego cis / trans wokół niektórych reszt proliny charakteryzuje się powolnymi etapami fałdowania wariantów GFP. Na przykład, tworzenie wiązania cis-peptydowego w Pro89 charakteryzuje się powolnym krokiem w procesie składania, ponieważ opiera się na przejściu wiązania z trans do cis29. Szybsze ponowne fałdowanie można osiągnąć po zastąpieniu Pro89 pętlą peptydową all-trans, tj. poprzez zniesienie zdarzenia izomeryzacji cis-to-trans<sup class="xref">30. Oprócz izomeryzacji cis/trans, przejścia fałdowania mogą również generować głębokie zmiany w fałdowaniu białek ze względu na organizację szkieletu i upakowanie we wnętrzu białka27,31.
Modyfikacje chemiczne powodują zmianę wewnętrznych przemian konformacyjnych reszt proliny, wpływając tym samym na zdolność białka do fałdowania. Niektóre analogi proliny są szczególnie atrakcyjnymi kandydatami do substytucji proliny w białkach, ponieważ umożliwiają manipulację i badanie właściwości fałdowania. Na przykład (4R)-fluoroprolina (R-Flp), (4S)-fluoroprolina (S-Flp), 4,4-difluoroprolina (Dfp) i 3,4-dehydroprolina (Dhp) to cztery analogi (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D), które różnią się minimalnie od proliny zarówno pod względem objętości cząsteczkowej, jak i polarności32. W tym samym czasie każdy analog wykazuje wyraźne marszczenie pierścienia: S-Flp stabilizuje marszczenie C4-endo, R-Flp stabilizuje marszczenie C 4-exo, Dfp nie wykazuje widocznej preferencji marszczenia, podczas gdy Dhp znosi marszczenie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D)33. Stosując te analogi w strukturze białka, można manipulować przejściem konformacyjnym reszt proliny, a tym samym wpływać na właściwości powstałych wariantów GFP.
W tej pracy postanowiliśmy włączyć wyznaczony zestaw analogów proliny (Rysunek 1D) do struktury wariantów GFP za pomocą metody selektywnego włączania ciśnienia (SPI, Rysunek 3)34. Zastąpienie reszt aminokwasowych ich najbliższymi analogami izostrukturalnymi jest koncepcją biotechnologiczną stosowaną w projektowaniu białek35,36. Tak więc wpływ analogów proliny w białku modelowym ilustruje ich potencjał do wykorzystania jako narzędzia w inżynierii białek37. Produkcję białek zawierających pożądane analogi prowadzono w zmodyfikowanych szczepach E. coli, które nie są w stanie wytwarzać proliny (auksotrofia proliny). W ten sposób mogą zostać zmuszeni do zaakceptowania wymiany substratów w procesie biosyntezy białek38. Ta globalna substytucja proliny jest możliwa dzięki naturalnej elastyczności substratów endogennych syntetaz aminoacylo-tRNA39, kluczowych enzymów katalizujących estryfikację tRNA odpowiednimi aminokwasami40. Ogólnie rzecz biorąc, jak opisano w Rysunek 3, wzrost komórek odbywa się w określonym podłożu, aż do osiągnięcia środkowej fazy wzrostu logarytmicznego. W kolejnym kroku aminokwas, który ma zostać zastąpiony, jest wewnątrzkomórkowo wytracany z systemu ekspresji podczas fermentacji, a następnie wymieniany przez pożądany analog lub ncAA. Ekspresja białka docelowego jest następnie indukowana w celu włączenia aminokwasów niekanonicznych specyficznych dla reszt. Substytucja pokrewnego aminokwasu jego analogiem zachodzi w sposób obejmujący cały proteom. Chociaż ten efekt uboczny może mieć negatywny wpływ na wzrost szczepu gospodarza, jakość produkcji białka docelowego w większości nie jest zagrożona, ponieważ w ekspresji rekombinowanej zasoby komórkowe są głównie kierowane do produkcji białka docelowego41,42. Dlatego ściśle regulowany, indukowalny system ekspresji i silne promotory są kluczowe dla wysokiej efektywności inkorporacji43. Nasze podejście opiera się na wielokrotnym wprowadzaniu ncAA specyficznych dla reszt w odpowiedzi na kodony zmysłowe (reprzydział kodonów zmysłowych), przy czym w obrębie genu docelowego liczbą pozycji do insercji analogu Pro można manipulować za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce44. Podobne podejście zostało zastosowane w naszym poprzednim raporcie na temat otrzymywania rekombinowanych peptydów o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych45. W niniejszej pracy zastosowaliśmy metodę SPI, która pozwala na zastąpienie wszystkich reszt proliny przez pokrewne analogi, w celu wytworzenia białek, od których oczekuje się, że będą miały odrębne właściwości fizykochemiczne, nieobecne w białkach syntetyzowanych z kanonicznym repertuarem aminokwasów. Charakteryzując profil fałdowania i fluorescencji otrzymanych wariantów, staramy się pokazać efekty podstawień atomowych w wariantach GFP.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>VWR</td><td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA do LC-MS, wymagany stopień 83642</td><td>LC-MS</td></tr><tr><td>Wodny roztwór podstawowy akryloamidu i bisakryloamidu w stosunku 37,5:1 (żel ROTIPHORESE 30)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>Carl Roth</td><td>5210</td><td></td></tr><tr><td>Molibdenian amonu ((NH4)2MoO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277908</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenosiarczan amonu (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.2</td><td>&ge; 98 %, rocznie, wymagany stopień ACS</td></tr><tr><td>Siarczan amonu ((NH4)2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Carl Roth</td><td>K029</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brillant Blue R 250</td><td>Carl Roth</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (CuSO4)</td><td>Carl Roth</td><td>CP86.1</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Carl Roth</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>1,2-bis-(dimetyloamino)-etan,&nbsp; N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td>&ge; 99 % rocznie, do elektroforezy</td></tr><tr><td>1,4-ditiotreitol (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>wodorofosforan dipotasu (K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>P749.1</td><td></td></tr><tr><td>wodorofosforan disodowy (Na2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>X987</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50WX8-100 (forma wodorowa)</td><td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, Stany Zjednoczone)</td><td>10731181</td><td>żywica kationowymienna</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>VWR</td><td>HiPerSolv CHROMANORM dla LC-MS, wymagany 84865</td><td>LC-MS</td></tr><tr><td>Lodowcowy kwas octowy</td><td>Carl Roth</td><td>3738.5</td><td>100 %, p. a.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Carl Roth</td><td>X998</td><td></td></tr><tr><td>Chlroide wodoru (HCl)</td><td>Merck</td><td>295426</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek żelaza(II) (FeCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Carl Roth</td><td>AE73.1</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1- tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Carl Roth</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek manganu (MnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63535</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Carl Roth</td><td>4227.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Niebarwiona drabinka białkowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Carl Roth</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Carl Roth</td><td>7156</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Carl Roth</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu (NaH2PO4)</td><td>Carl Roth</td><td>T879</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (NaC12H25SO4)</td><td>Carl Roth</td><td>0183</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek Tris (Tris-HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)-aminometan (Tris)</td><td>Carl Roth</td><td>5429</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Carl Roth</td><td>8952</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Carl Roth</td><td>2363</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek (ZnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr><tr><td>L-alanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8381</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-glutaminowy kwas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2128</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-izoleucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-leucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-fenyloalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-seryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptofan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-walina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>(4S)-fluoroprolina</td><td>Bachem</td><td>4033274</td><td>Upewnij się, że wszystkie analogi proliny nie zawierają proliny, sprawdź zawartość. W przeciwnym razie należy wykonać krok w celu spożycia zanieczyszczeń proliną podczas odciągania.</td></tr><tr><td>(4R)-fluoroproline</td><td>Bachem</td><td>4033275</td><td>Upewnij się, że wszystkie analogi proliny są wolne od proliny, sprawdź zawartość. W przeciwnym razie uwzględnij krok do spożycia zanieczyszczeń proliny podczas odciągania</td></tr><tr><td>3,4-dehydroproliny</td><td>Bachem</td><td>4003545</td><td>Upewnij się, że wszystkie analogi proliny są wolne od proliny, sprawdź zawartość. W przeciwnym razie uwzględnij krok do spożycia zanieczyszczeń proliną podczas odciągania</td></tr><tr><td>4,4-difluoroproliny</td><td>Enamine</td><td>EN400-17448</td><td>Upewnij się, że wszystkie analogi proliny są wolne od proliny, sprawdź zawartość. W przeciwnym razie uwzględnij krok do spożycia zanieczyszczeń proliną podczas odciągania</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki polistyrenowe (Falcon), 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki polistyrenowe (Falcon), 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Membrana do dializy, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td><td>Spectrum Medical Industries</td><td>Spectra/Por MWCO 5000 membrana dializacyjna, 133198</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna do chromatografii powinowactwa do immobilizowanych jonów metali (IMAC) 1 ml, Ni-NTA</td><td>GE Healthcare</td><td>HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Luer-Lock, 5 ml</td> Strzykawka Carl <td>Roth</td><td>EP96.1</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock, 20 ml</td> Strzykawka Carl <td>Roth</td><td>T550.1</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock, 50 ml</td><td>Carl Roth</td><td>T552.1</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>szalki Petriego (polistyren, sterylne)</td><td>Carl Roth</td><td>TA19</td><td></td></tr><tr><td>pQE-80L wektor plazmidowy</td><td>Qiagen</td><td>nie jest już dostępny</td><td>zastąpiony przez N-koniec pQE Zestaw wektorów Nr kat./ID: 32915</td></tr><tr><td>Pro-auksotroficzny E. coli szczep JM83</td><td>Addgene</td><td>50348</td><td>https://www.addgene.org/50348/</td></tr> <tr><td>Proauksotroficzny E. coli szczep JM83</td><td>ATCC</td><td>35607</td><td></td></tr><tr><td>Rurki z polistyrenu okrągłodennego, 14 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>Corning Falcon, 14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,45 i mikro; m z membraną z polifluorku winylidenu (PVDF)</td> Carl <td>Roth</td><td>CCY1.1</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) do LC-ESI-TOF-MS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC, 3 i mikro; m wielkość cząstek, 10 cm x 2,1 mm</td><td>ze stożkowymi wkładkami szklanymi 0,1 ml, nakrętkami i</td></tr><tr><td>fiolkami z autosamplerem przegrodowym HPLC 1,5 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco 854165</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy do LC-ESI-TOF-MS</td><td>Agilent</td><td>Agilent 6530 Oprogramowanie</td> do analizy danych spektrometrii mas Accurate-Mass QTOF <td></td></tr><tr>Oprogramowanie do analizy<td>danych</td><td>Agilent</td><td>MassHunter do analizy jakościowej v. B.06.00</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa do probówek Eppendorf 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5427 R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka chłodząca do probówek Falcon 50 ml</td><td>System Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>do szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)</td><td>GE Healthcare</td><td>&Auml; KTA pure 25 L</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr fluorescencyjny</td><td>Perkin Elmer</td><td>LS 55</td><td></td></tr><tr><td>Wysokociśnieniowy mikrofluidyzator do rozbijania komórek bakteryjnych</td><td>Mikrofluidyka</td><td>Seria LM z " Z&rdquo; typ komora</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna do hodowli bakterii</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna do chromatografii cieczowej (LC)</td><td>GE Healthcare</td><td>P-1</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator ultradźwiękowy do rozbijania komórek bakteryjnych</td><td>Omnilab</td><td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td><td>z końcówką sonifikatora MS72</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Biochrom</td><td>ULTROSPEC 2100</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis/NIR</td><td>Perkin Elmer</td><td>LAMBDA 950 UV/Vis/NIR</td><td></td></tr></tbody></table>

specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Zastąpienie reszt proliny (Pro) w białkach przez tradycyjną mutagenezę ukierunkowaną przez którykolwiek z pozostałych 19 kanonicznych aminokwasów jest często szkodliwe dla fałdowania białek, a w szczególności dojrzewania chromoforów w białkach zielonej fluorescencji i pokrewnych wariantach. Rozsądną alternatywą jest manipulowanie translacją białka w taki sposób, aby wszystkie reszty Pro zostały zastąpione przez analogi, metoda znana jako selektywne włączenie ciśnienia (SPI). Wbudowane modyfikacje chemiczne mogą być wykorzystywane jako rodzaj "chirurgii molekularnej" do precyzyjnej analizy mierzalnych zmian, a nawet racjonalnego manipulowania różnymi właściwościami białek. W niniejszej pracy wykazano przydatność metody SPI do badania roli prolin w organizacji typowej struktury β-beczkowej wariantów spektralnych białka zielonej fluorescencji (GFP) z 10-15 prolinami w swojej sekwencji: wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP), NowGFP i KillerOrange. Pozostałości Pro są obecne w odcinkach łączących między poszczególnymi β-pasmami i stanowią pokrywy zamykające rusztowanie beczki, odpowiadając tym samym za izolację chromoforu od wody, czyli właściwości fluorescencyjne. Eksperymenty z selektywnym włączaniem ciśnienia z (4R)-fluoroproliną (R-Flp), (4S)-fluoroproliną (S-Flp), 4,4-difluoroproliną (Dfp) i 3,4-dehydroproliną (Dhp) przeprowadzono przy użyciu prolino-auksotroficznego szczepu E. coli jako gospodarza ekspresji. Odkryliśmy, że białka fluorescencyjne z S-Flp i Dhp są aktywne (tj. fluorescencyjne), podczas gdy pozostałe dwa analogi (Dfp i R-Flp) wytwarzają dysfunkcyjne, nieprawidłowo sfałdowane białka. Kontrola profili absorpcji i emisji fluorescencji UV-Vis wykazała niewiele charakterystycznych zmian w białkach zawierających analogi Pro. Badanie profili kinetycznych fałdowania w wariantach EGFP wykazało przyspieszony proces ponownego fałdowania w obecności S-Flp, podczas gdy proces ten był podobny do typu dzikiego w białku zawierającym Dhp. Badanie to pokazuje zdolność metody SPI do wytwarzania subtelnych modyfikacji reszt białkowych na poziomie atomowym ("chirurgia molekularna"), które można zastosować do badania innych białek będących przedmiotem zainteresowania. Ilustruje on wyniki substytucji proliny z bliskimi analogami chemicznymi na właściwości fałdowania i spektroskopowe w klasie białek fluorescencyjnych z β beczkami.

Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznej mutagenezy ukierunkowanej, analogi proliny ze specyficznymi modyfikacjami zostały włączone do kilku białek fluorescencyjnych. Pokazujemy, jak zastąpienie wodoru przez fluor lub pojedynczego przez wiązania podwójne w resztach proliny ("chirurgia molekularna") wpływa na podstawowe właściwości białek, w tym ich fałdowanie i interakcję ze światłem.

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

W większości przypadków konwencjonalna mutageneza ukierunkowana na miejsce nie jest odpowiednia do badania funkcjonalnej roli prolin w białkach. W tym miejscu przedstawiamy metodę włączania analogów proliny jako aminokwasów niekanonicznych do białek syntetyzowanych rybosomalnie w celu zbadania roli reszt proliny w fałdowaniu i funkcji białek. Substytucja prolin przez standardowe aminokwasy jest ryzykownym podejściem.Włączenie analogów proliny pozwala na rodzaj chirurgii molekularnej. Innymi słowy, wprowadza subtelne zmiany molekularne, aby racjonalnie wpływać na właściwości białek i manipulować nimi. Ponieważ reszty proliny odgrywają zasadniczą rolę w stabilności rusztowań białkowych, nasza technologia może być pomocna w zrozumieniu przyczyn deficytów fałdowania białek, które leżą u podstaw pewnych stanów patologicznych u ludzi.Zmiany w białkach wywołane przez wymianę proliny mają implikacje dla inżynierii biotechnologicznej enzymów i dają możliwości poprawy translacji lub fałdowania białek rybosomalnych. Ta metoda nie wymaga specjalnego sprzętu i drogiego oprzyrządowania. Szczególną ostrożność należy zachować przy podejmowaniu kroków protokołu, w których natywna prolina jest zubożana z kultur E. coli przed dodaniem analogów proliny.Aby rozpocząć produkcję białek fluorescencyjnych z natywną proliną, należy zaszczepić 200 mililitrów świeżej pożywki NMM w dwulitrowej kolbie Erlenmeyera z dwoma mililitrami kultury przez noc. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 220 obr./min przez około 3,5 godziny. Podczas inkubacji należy co 30 minut mierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach w spektrofotometrze.Gdy gęstość optyczna osiągnie 0,7, odwiruj zawiesinę ogniw i delikatnie zdekantuj supernatant do odpadów. Następnie umyj komórki, ponownie zawieszając w 50 mililitrach lodowatego NMM bez żadnych aminokwasów lub NMM bez proliny. Ponownie odwiruj komórki i zdekantuj supernatant do odpadów.Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy przez delikatne pipetowanie w 200 mililitrach NMM bez proliny i uzupełniony ampicyliną w dwulitrowej kolbie Erlenmeyera i inkubować komórki w wytrząsarce orbitalnej przez 30 minut, aby umożliwić całkowite wyczerpanie proliny. Po inkubacji dodać odpowiednią objętość L-proliny lub analogów proliny z 50-milimolowych roztworów podstawowych, aby uzyskać jednomilimolowe stężenie końcowe w zawiesinie komórek. Następnie indukuj ekspresję białka docelowego, dodając 500-mikromolowy IPTG z jednomolowego roztworu podstawowego.Ekspresję białka docelowego przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce orbitalnej i zmierzenie gęstości optycznej następnego dnia. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie i zdekantować supernatant do odpadów. Następnie umyj komórki, ostrożnie pipetując 50 mililitrów buforu wiążącego zawierającego 10% glicerolu.Ponownie zakręć komórki, zdekantuj supernatant i przechowuj osad komórek w 50-mililitrowej probówce w temperaturze minus 20 lub 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Przed oceną emisji fluorescencji należy wykonać SDS-PAGE, aby upewnić się, że czystość próbki przekracza 95%Następnie dostosuj próbki każdego oczyszczonego wariantu białka do stężenia 0,3 mikromola, przyjmując jako odniesienie obliczoną wartość absorbancji przy odpowiedniej długości fali. Upewnij się, że przybliżona końcowa objętość próbki wynosi 200 mikrolitrów.Pozostawić rozcieńczone próbki do zrównoważenia w temperaturze pokojowej. Po godzinie przenieś próbki do jednocentymetrowej kuwety kwarcowej i zmierz widmo emisji fluorescencji próbek za pomocą spektrometru fluorescencyjnego. Aby wywołać denaturację, rozcieńczyć próbki każdego wariantu białka dwudziestokrotnie, dodając dwa mikrolitry próbek o pojemności 300 mikromolów do 18 mikrolitrów buforu 1,11X PBS zawierającego 8,89-molowy mocznik i 5,56-milimolowy DTT.Próbki należy inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie rozcieńczyć próbki 100-krotnie, dodając 1 980 mikrolitrów PBS zawierających pięciomilimolowy DTT w celu wywołania renaturacji i natychmiast przenieść 200 mikrolitrów próbek do jednocentymetrowej kuwety kwarcowej. Włóż kuwetę kwarcową do odpowiedniego spektrometru fluorescencyjnego i monitoruj ponowne fałdowanie białek, uzyskując widmo fluorescencji co trzy sekundy przez 30 minut.Przenieś ponownie składane próbki do 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówek, a następnie zamknij pokrywę i przechowuj próbki w temperaturze pokojowej w ciemności, aby umożliwić całkowite ponowne złożenie wariantów EGFP. Po 24 godzinach zmierz emisję fluorescencji ponownie złożonych próbek białek przy użyciu tej samej długości fali wzbudzenia, co poprzednio, aby uchwycić czasowy punkt końcowy odzyskiwania fluorescencji. Osady z komórek wykazujących ekspresję białka natywnego i warianty zawierające S-fluoroprolinę i dehydroprolinę miały typowy jasny kolor ze względu na nienaruszony chromofor.Natomiast warianty zawierające R-fluoroprolinę i difluoroprolinę pozostały bezbarwne, co wskazuje na nieprawidłowe fałdowanie i odkładanie się niesfałdowanego białka w ciałach inkluzyjnych. Analiza SDS-PAGE potwierdziła obecność nierozpuszczalnych białek zawierających R-fluoroprolinę. Natomiast we frakcjach rozpuszczalnych stwierdzono białka natywne oraz warianty zawierające S-fluoroprolinę i dehydroprolinę.W analizie chromatografii cieczowej/spektrometrii mas każde zastąpienie proliny S-fluoroproliną powodowało dodatnie przesunięcie o 18 daltonów na resztę proliny, podczas gdy zastąpienie dehydroproliną powodowało ujemne przesunięcie o dwa daltony na resztę. W widmach absorpcji i emisji światła stwierdzono absorbancję chromoforu na poziomie 488 nanometrów dla EGFP i 493 nanometrów dla NowGFP. W KillerOrange obszar absorbancji chromoforu składał się z dwóch pasm odpowiadających dwóm możliwym stanom konfiguracyjnym i ładunkowym chromoforu złożonego.Co więcej, widma fluorescencji zarejestrowane po wzbudzeniu przy odpowiednich maksymalnych długościach fal absorbancji sugerowały, że analogi nie zmieniły środowiska chemicznego chromoforów. W eksperymentach z ponownym fałdowaniem natywna fluorescencja chromoforu EGFP częściowo się poprawiła, chociaż fluorescencja specyficzna dla tryptofanu była większa po renaturacji. Podobne zachowanie zaobserwowano w przypadku wariantu zawierającego dehydroprolinę.W przypadku S-fluoroproliny zawierającej EGFP podobny wynik zaobserwowano przy wzbudzeniu 295 nanometrów, podczas gdy fluorescencja powróciła w znacznie większym stopniu przy 488 nanometrach. Tylko warianty EGFP wykazywały szybką kinetykę fałdowania, przy czym odzyskiwanie emisji tryptofanu było dwukrotnie szybsze w porównaniu z emisją chromoforu. Należy użyć świeżych kultur bakteryjnych z odpowiednimi pożywkami wzrostowymi.Sterylne techniki i regularne monitorowanie wzrostu kultur są również ważnymi warunkami wstępnymi powodzenia eksperymentu. Metoda ta ma zastosowanie w inżynierii białek, ponieważ pozwala badać rolę innych aminokwasów kanonicznych. W tym celu potrzebne są odpowiednie auksotroficzne szczepy E. coli i analogi aminokwasów.Spektrometria mas całych białek jest wymagana jako dowód analityczny w celu potwierdzenia włączenia niekanonicznych analogów aminokwasów. Metoda SPI do włączania analogów proliny pozwala nam na bezpośrednie manipulowanie szkieletem białkowym i oferuje korzyści w zakresie racjonalnego projektowania i ułatwionej produkcji białek poprzez globalną stabilizację i poprawę translacji lub fałdowania rybosomów.

residue-specific-exchange-proline-proline-analogs-fluorescent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Opisujemy tutaj ulepszoną metodę transferu energii rezonansu luminescencji (LRET), w której wprowadzamy miejsce rozszczepienia proteazy między miejscem fluoroforu dawcy i akceptora. Modyfikacja ta pozwala na uzyskanie specyficznych sygnałów LRET pochodzących z interesujących nas białek błonowych, co pozwala na badanie białek błonowych bez oczyszczania białek.

Transfer energii rezonansu luminescencyjnego w celu zbadania zmian konformacyjnych w białkach błonowych ulegających ekspresji w komórkach ssaków

Syntetyczne sekwencje białek oparte na motywach konsensusu zazwyczaj ignorują współewoluujące resztki, które implikują zależności interpozycyjne (IPD).  IPD mogą być niezbędne do działania, a projekty, które je ignorują, mogą skutkować nieoptymalnymi wynikami.  Protokół ten wykorzystuje StickWRLD do identyfikacji IPD i pomaga w racjonalnym projektowaniu białek, co skutkuje bardziej wydajnymi wynikami.

Optymalizacja białek syntetycznych: identyfikacja zależności interpozycyjnych wskazujących na strukturalnie i/lub funkcjonalnie powiązane reszty

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Ten artykuł opisuje protokoły do oceny wpływu białek fluorescencyjnych na agregację i toksyczność nieprawidłowo sfałdowanej ekspansji poliglutaminy w celu szybkiej oceny nowo niescharakteryzowanego białka fluorescencyjnego w kontekście reporterów fluorescencyjnych.

Wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

Ten artykuł zawiera prosty i przejrzysty protokół oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE) specyficznie dla miejsca i obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)...

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Funkcje białek nadrodziny dynamin zależą od zmian konformacyjnych sprzężonych z hydrolizą GTP. System opisano za pomocą techniki jednocząsteczkowego FRET (smFRET) do monitorowania dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy w różnych stanach obciążenia nukleotydami.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy

Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje procedurę eksperymentalną służącą do wyznaczenia energii swobodnej Gibbsa fałdowania białek błonowych za pomocą fluorescencji tryptofanu.

Termodynamika fałdowania białek błonowych pomierzona za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę włączania analogów proliny do białek fluorescencyjnych w celu badania fałdowania i stabilności. Technika ta pozwala na precyzyjną modyfikację szkieletu białkowego bez konieczności stosowania drogiego sprzętu.

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak chirurgia molekularna kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność (Wideo) | JoVE Journal

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

Przeglądaj więcej filmów