Name: Ekstrakcja i oczyszczanie białka FAHD1 z nerki świń i wątroby myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji białka FAHD1 z nerki świń i wątroby myszy z zachowaniem jego formy fizjologicznej. Ta technika umożliwia uzyskanie czystego białka do badań biochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są bardzo wdzięczni za pomoc techniczną Ayse Öztürk i Evy Albertini. Myszy wykorzystywane do wytwarzania tkanki wątroby były utrzymywane pod nadzorem Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Instytut Biomedycznych Badań nad Starzeniem się Uniwersytetu w Innsbrucku, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria).

<ol><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD1%29+as+oxaloacetate+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+%28FAHD1%29+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li>
<li>Kang, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li>
<li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence%2C+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li>
<li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).</li>
<li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li>
<li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284(2020).</li>
<li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+crystallization%2C+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729(2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+%28FAHD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molcules%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009(2021).</li>
<li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).</li>
<li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins%3A+Between+meaning+and+different+methods%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Technologies+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li>
<li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802(2018).</li>
<li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li>
<li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li>
<li>Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sørensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
<li>Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).</li>
<li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%3A+A+5-year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+A+Publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Krytyczne kroki w protokole Niezbędne jest przestrzeganie wspólnych wytycznych dotyczących obchodzenia się z białkami, takich jak praca na lodzie oraz w umiarkowanych warunkach pH i soli. Stosowanie inhibitorów proteazy jest korzystne dla metody, podczas gdy stosowanie inhibitorów proteasomu jest wysoce zalecane. Zamrażanie i rozmrażanie próbki może zawsze powodować wytrącanie się białka (przynajmniej częściowo), dlatego każda rozmrożona podwielokrotność początkowego lizatu białkowego (etap 2) powin...

Eukariotyczne białko 1 zawierające domenę FAH (FAHD1) działa jako dwufunkcyjna szczawiooctanowa (OAA) dekarboksylaza (ODx)1 oraz acylopirogronianowa hydrolaza (ApH)2. Jest ono zlokalizowane w mitochondriach2 i należy do szerokiej superrodziny enzymów FAH1,2,3,4,5,6. Podczas gdy jego aktywność ApH ma jedynie niewielkie znaczenie, aktywność ODx białka FAHD1 bierze udział w regulacji strumienia cyklu TCA1,7,8,9. OAA jest niezbędne nie tylko do centralnej reakcji syntazy cytrynianowej w cyklu kwasu trójkarboksylowego, ale działa również jako konkurencyjny inhibitor dehydrogenazy bursztynianowej w ramach systemu transportu elektronów oraz jako metabolit kataplerotyczny. Obniżenie ekspresji genu FAHD1 w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) doprowadziło do znaczącego zmniejszenia szybkości proliferacji komórek10 oraz istotnego zahamowania potencjału błony mitochondrialnej, co wiązało się z towarzyszącym przejściem na glikolizę. Model roboczy odnosi się do fenotypu podobnego do starzenia związanego z dysfunkcją mitochondriów (MiDAS)118, w którym poziomy mitochondrialnego OAA są ściśle regulowane przez aktywność FAHD11,8,9.
Białko rekombinowane jest łatwiejsze do uzyskania poprzez ekspresję i oczyszczanie z bakterii12 niż z tkanki. Jednak białko wyekspresjonowane w bakteriach może być obarczone błędem wynikającym z możliwego braku modyfikacji potranslacyjnych lub może być po prostu problematyczne (np. ze względu na utratę plazmidu, bakteryjne odpowiedzi stresowe, zniekształcone/nieuformowane mostki dwusiarczkowe, brak lub słabą sekrecję, agregację białek, rozszczepienie proteolityczne itp.). W określonych zastosowaniach białko musi zostać uzyskane z lizatu komórkowego lub tkanki, aby uwzględnić takie modyfikacje i/lub wyeliminować możliwe artefakty. Oczyszczone białko z tkanki wspiera opracowywanie wysokiej jakości przeciwciał i/lub silnych i specyficznych inhibitorów farmakologicznych dla wybranych enzymów, takich jak FAHD113.
Niniejszy manuskrypt przedstawia serię metod ekstrakcji i oczyszczania białka FAHD1 z nerki świni oraz wątroby myszy. Opisane metody wymagają zastosowania szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), jednak w pozostałym zakresie wykorzystują powszechnie dostępny sprzęt laboratoryjny. Alternatywne metody można znaleźć w innych źródłach.14,15,16,17Po całkowitej ekstrakcji białek proponowany protokół obejmuje fazę testową, w której omówiono podprotokoły dotyczące wytrącania siarczanem amonu oraz chromatografii wymiany jonowej (Rysunek 1). Po zdefiniowaniu tych podprotokołów przeprowadza się ekstrakcję białka docelowego poprzez sekwencyjną strategię z wykorzystaniem chromatografii wymiany jonowej i chromatografii wykluczania z zastosowaniem systemu FPLC. W oparciu o te wytyczne końcowy protokół może zostać dostosowany indywidualnie do innych białek docelowych.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Ogólna strategia niniejszego protokołu. Od góry do dołu: Białko jest ekstrahowane z tkanek. Homogenat tkankowy jest przygotowywany, wirowany i filtrowany. Dla każdej pary próbek pochodzących z nadosadu i osadu należy przeprowadzić testy wytrącania siarczanem amonu oraz chromatografii wymiany jonowej (FPLC) w celu ustalenia optymalnych warunków. Po opracowaniu tych podprotokołów białko można ekstrahować poprzez sekwencyjną procedurę wytrącania siarczanem amonu, chromatografii wymiany jonowej oraz powtarzalnej chromatografii wykluczania wielkości (FPLC) przy zmiennym pH i stężeniach soli. Wszystkie etapy muszą być kontrolowane za pomocą western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m jednostki filtracyjne</td><td>MERCK</td><td>SLGP033RS</td><td>Millex-HP, 0,22 i mikro; m, PES 33 mm, nie sterylne</td></tr><tr><td>0,45 &mikro; m jednostki filtracyjne</td><td>MERCK</td><td>SLHP033NS</td><td>Millex-HP, 0,45 &mikro; m, PES 33 mm, nie sterylne</td></tr><tr><td>15 ml Probówki Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td>probówki odśrodkowe</td></tr><tr><td>50 ml Probówki Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0448</td><td>rurki odśrodkowe</td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka UV</td><td>Thermo-Fischer</td><td>8404</td><td>UV/VIS przezroczysta płaska 96-dołkowa płytka</td></tr><tr><td>Akrylamid/Bis roztwór (40%, stosunek 29:1)</td><td>BIO-RAD</td><td>#1610147</td><td>40% akrylamid/bis-akrylamid, roztwór sieciujący 29:1 (3,3% środek sieciujący) do odlewania żeli poliakrylamidowych</td></tr><tr><td>&Auml; System KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td> <td>-</td> <td>przy użyciu systemu FPLC firmy GE Healthcare; istnieją różne wersje niestandardowe; w tej pracy użyto "&Auml; System KTA pure"</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membrana, 10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC901024</td><td>filtry odśrodkowe do wzbogacania białek; filtr masy cząsteczkowej 10 kDa; 15 ml</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrana, 10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC801024</td><td>filtry odśrodkowe do wzbogacania białek; filtr masy cząsteczkowej 10 kDa; 4 ml</td></tr><tr><td>siarczan amonu w proszku</td><td>MERCK</td><td>A4418</td><td>siarczan amonu dla biologii molekularnej, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>Klasa odczynnika do nadsiarczanu amonu, 98%</td> <td>MERCK</td><td>215589</td><td>Katalizator do polimeryzacji żelu akrylamidowego.</td></tr><tr><td>Coomassie Błękit brylantowy R 250</td><td>MERCK</td><td>1125530025</td><td>Coomassie Błękit brylantowy R 250 (CI 42660) do elektroforezy Znak towarowy Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6,2 (10 g/l, H2O, 25 &deg; C)</td></tr> <tr><td>Rurki do dializy membrana celulozowa</td><td>MERCK</td><td>D9277</td><td>Membrany celulozowe do wymiany poprzez dializę.</td></tr><tr><td>Probówki Eppendof 1,5 ml</td><td>Mikrorurki mikroodśrodkowe</td><td>VWR</td><td>525-1042</td>; autoklawizowane</tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare Nauki Przyrodnicze / Cytiva</td><td>28989334</td><td>HiLoad Kolumny Superdex 75 pg są przeznaczone do chromatografii wykluczającej wielkości białek rekombinowanych o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immun-Blot</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620177</td><td>Membrany PVDF to membrany białkowe zoptymalizowane pod kątem zastosowań fluorescencyjnych i multipleksowych.</td></tr><tr><td>Elektroforetyczne ogniwo transferowe Mini Trans-Blot</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703930</td><td>Użyj ogniwa Mini Trans-Blot do szybkiego osuszania prefabrykatów Mini-PROTEAN i ręcznie odlewanych żeli.</td></tr><tr><td>Pionowe ogniwo do elektroforezy Mini-PROTEAN Tetra do mini żeli prefabrykowanych</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>4-żelowy pionowy system elektroforezy, zawiera zespół elektrod, towarzyszący moduł jezdny, zbiornik, pokrywę z zasilającymi, mini zaporę buforową ogniw.</td></tr><tr><td>Mono Q 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516701</td><td>Kolumny Mono Q to kolumny do chromatografii z silną anionitamiennością do analizy białek lub polerowania białek w wysokiej rozdzielczości na małą skalę.</td></tr><tr><td>Mono S 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516901</td><td>Kolumny Mono S to kolumny do chromatografii kationowymiennej o dużej mocy do analizy białek lub polerowania białek w wysokiej rozdzielczości na małą skalę.</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 do 180 kDa</td><td>Thermo-Fischer</td><td>26616</td><td>Mieszanina 10 białek barwionych na niebiesko, pomarańczowo i zielono (od 10 do 180 kDa) do stosowania jako wzorce wielkości w elektroforezie białek (SDS-PAGE) i western blotting.</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo-Fischer</td><td>23225</td><td>Dwuskładnikowy, wysoce precyzyjny, kompatybilny z detergentem test białkowy do oznaczania stężenia białka.</td></tr><tr><td>Sonifier 250; Ultradźwiękowy zakłócacz komórek z konwerterem</td><td></td> <td>Branson-Nowe</td> <td>modele w https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td></tr><tr><td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (powinowactwo izolowane)</td><td>Agilent Dako</td><td>P0399</td><td>Przeciwciało stosowane do koniugacji peroksydazy chrzanowej reaguje z immunoglobulinami króliczymi wszystkich klas.</td></tr><tr><td>TEMED, 1,2-Bis(dimetyloamino)etan, TMEDA</td><td>MERCK</td><td>T9281</td><td>TEMED (N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyloethelenodiamina) jest cząsteczką umożliwiającą szybką polimeryzację żeli poliakrylamidowych.</td></tr><tr><td>Rolka rurowa</td> <td>-</td><td></td> <td>ogólna rolka rotatora rury; np. nowy model w https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td></tr><tr><td>Rotary Tube -</td><td></td><td></td> <td>ogólne koło rotatora rurowego; np. nowy model w https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td></tr><tr><td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td><td>IKA</td><td>0003725000</td><td>Nowe modele na https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja i oczyszczanie białka fahd1 z nerki świń i wątroby myszy

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Białko zawierające domenę hydrolazy fumaryloacetooctanu 1 (FAHD1) jest pierwszym zidentyfikowanym członkiem nadrodziny FAH u eukariontów, działającym jako dekarboksylaza szczawiooctanu w mitochondriach. W artykule przedstawiono szereg metod ekstrakcji i oczyszczania FAHD1 z nerki i wątroby myszy świń. Omówione metody to chromatografia jonowa wymienna z szybką chromatografią cieczową białek (FPLC), preparatywna i analityczna filtracja żelowa za pomocą FPLC oraz podejścia proteomiczne. Po całkowitej ekstrakcji białka zbadano wytrącanie siarczanu amonu i chromatografię jonową, a FAHD1 ekstrahowano za pomocą strategii sekwencyjnej przy użyciu chromatografii jonowej i chromatografii wykluczającej rozmiar. To reprezentatywne podejście może być dostosowane do innych białek będących przedmiotem zainteresowania (wyrażonych na znacznych poziomach) i zmodyfikowane dla innych tkanek. Oczyszczone białko z tkanki może wspierać rozwój wysokiej jakości przeciwciał i/lub silnych i specyficznych inhibitorów farmakologicznych.

Białko FAHD1 zostało wyekstrahowane z nerki świni oraz wątroby myszy z zastosowaniem przedstawionego protokołu. W przypadku tkanki mysiej konieczne jest użycie wielu organów, aby uzyskać kilka µg białka po końcowym etapie oczyszczania. Z tego powodu niniejszy artykuł skupia się na ekstrakcji FAHD1 z nerek świni, co stanowi znacznie bardziej reprezentatywny eksperyment. Ekstrakcję FAHD1 z wątroby myszy przeprowadzono w celu zaprezentowania trudności oraz możliwych pułapek tego protokołu. Generalnie zaleca się stosowanie o...

Ten protokół opisuje, jak ekstrahować białko 1 zawierające hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu (FAHD1) z nerki świni i wątroby myszy. Wymienione metody mogą być dostosowane do innych białek będących przedmiotem zainteresowania i zmodyfikowane dla innych tkanek.

Ekstrakcja i oczyszczanie białka FAHD1 z nerki świń i wątroby myszy

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Oczyszczanie rekombinowanego białka z bakterii jest dobrze znaną metodą. Jednak podczas korzystania z tych technik może wystąpić kilka problemów. Posiadanie metod ekstrakcji białka z tkanki jest z pewnością atrakcyjne.Główną zaletą tej metody jest to, że można wyekstrahować białko w jego fizjologicznej formie, w tym wszystkie wzajemne efekty, które mogą wpływać na jego fałdowanie i aktywność katalityczną. Podejście to może być dostosowane do innych białek będących przedmiotem zainteresowania i zmodyfikowane dla innych tkanek. Oczyszczone białko z tkanek może wspomagać rozwój wysokiej jakości przeciwciał i inhibitorów farmakologicznych.Na początek przygotuj bufor do lizy białek, mieszając 250 mililitrów PBS z 50 milimolowym fluorkiem sodu, jednym milimolowym fluorkiem fenylometylosulfonylu, dwoma mikrogramami na mililitr aprotyniny i jednym milimolowym aktywowanym ortowadatem. Przefiltrować roztwór za pomocą strzykawki filtrującej o średnicy 0,22 mikrometra. Przygotuj probówki z dwoma mililitrami buforu do lizy na gram tkanki i umieść je na lodzie.Aby przygotować próbkę tkanki, należy wyciąć tkankę o grubości około 100 miligramów każda na wstępnie oczyszczonej szklanej płytce umieszczonej na lodzie w pudełku z pianki polistyrenowej. Przenieś kawałki tkanki do przygotowanych probówek w celu późniejszej lizy. Aby przygotować nasycony roztwór siarczanu amonu, podgrzej 500 mililitrów podwójnie destylowanej wody do 70 stopni Celsjusza.Mieszając, stopniowo dodawaj siarczan amonu w proszku, aż siarczan amonu przestanie się rozpuszczać. Schłodzić ten nasycony roztwór do temperatury pokojowej i przechowywać go przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W celu homogenizacji tkanek nerkowych świń, należy poddać zawiesinę sonikacji, najlepiej za pomocą sondy ultradźwiękowej, utrzymując próbkę na lodzie.W przypadku tkanek wątroby myszy należy użyć homogenizatora elektrycznego i regularnie myć go w PBS, aby zapobiec zatykaniu się podczas utrzymywania próbek na lodzie. Pobrać 20 mikrolitrów z próbek i sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki homogenizowanej tkanki są prawidłowo zniszczone. W przeciwnym razie powtórzyć homogenizację.Odwirować probówki w temperaturze 10 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant do świeżej probówki i umieścić go na lodzie. Następnie przefiltrować supernatant za pomocą strzykawek filtrujących o średnicy 0,45 mikrometra i 0,22 mikrometra.Podzielić supernatant na 10-mililitrowe partie i zamrozić je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w przypadku dłuższego przechowywania. Przygotować próbkę o objętości 50 mikrolitrów do analizy SDS-PAGE lub Western blot, dodając 10 mikrolitrów pięciokrotnego buforu próbki SDS do 40 mikrolitrów supernatantu, a następnie gotując w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Przygotować nieciągły żel 12,5%poliakryloamidu SDS-PAGE zgodnie z instrukcjami producenta.Aby przeprowadzić analizę SDS-PAGE, należy następnie załadować dołki żelu drabinką markerów białkowych, pięcioma nanogramami ludzkiego rekombinowanego białka FAHD1 jako kontrolą pozytywną, 20 mikrolitrami próbki do analizy, a pozostałe studzienki 20 mikrolitrami przygotowanego buforu próbki SDS-PAGE. Uruchom żele SDS-PAGE pod napięciem 125 woltów za pomocą bufora roboczego SDS. Po zakończeniu SDS-PAGE wykonaj analizę Western blot, zbadaj błony za pomocą dostępnego przeciwciała podniesionego przeciwko FAHD1.Po przygotowaniu podwielokrotności sklarowanych nad osadem, jak opisano powyżej, należy przeprowadzić proces po rozmrożeniu lub bezpośrednio po ekstrakcji białka bez zamrażania próbki. Przefiltrować próbkę za pomocą jednostki filtrującej 0,22 mikrometra, aby wykluczyć ewentualne wytrącenia się po rozmrożeniu. Przygotuj sześć 1,5-mililitrowych probówek na lodzie, a następnie przenieś 250 mikrolitrów próbki do każdej probówki.Przygotować serię rozcieńczeń siarczanu amonu w przygotowanych probówkach i uzupełnić końcową objętość do 1 000 mikrolitrów buforem do lizy białek. Próbki należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc na rotatorze probówkowym. Za pomocą wirówki stołowej odwirować w temperaturze 10 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie przenieść wszystkie supernatanty do oddzielnych probówek.Wysuszyć powstałe granulki na powietrzu i ponownie zawiesić każdy z nich w 1 000 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. Dla każdej pary zawieszonych osadów i supernatantu z poprzedniego etapu, wymieszać 40 mikrolitrów z 10 mikrolitrami pięciokrotnego buforu próbki SDS i gotować w temperaturze 95 stopni Celsjusza z otwartymi pokrywkami, aż większość płynu odparuje. Następnie ponownie zawiesić granulat w mieszaninie 50% dimetylosulfotlenku w wodzie podwójnie destylowanej.Wykonaj SDS-PAGE, ładując próbki pochodzące z zawieszonych osadów i supernatantu w parach, a następnie przeprowadzając analizę Western blot. Jednak uruchom żele pod napięciem 80 woltów przez trzy godziny. Skonfiguruj system FPLC z kolumną wymiany anionowej lub kationowej.Przemyć kolumnę pięcioma objętościami 20% etanolu w wodzie podwójnie destylowanej, a następnie w pięciu objętościach kolumny wodą podwójnie destylowaną. Nanieść próbkę na kolumnę przez wstrzyknięcie lub za pomocą pompy do pobierania próbek i zebrać przepływ. Przemyć kolumnę jedną objętością buforu o niskiej zawartości soli.Ustaw liniową elucję gradientową od 100% buforu o niskiej zawartości soli do 100% buforu o wysokiej zawartości soli w trzech objętościach kolumn. Stale zbieraj frakcje jednego mililitra. Po zakończeniu gradientu kontynuować pracę z buforem o wysokiej zawartości soli, aż do momentu, gdy na chromatogramie nie zostaną wykryte więcej pików związanych z białkiem w zakresie objętości jednej kolumny.Zastosuj jeden mililitr 25% SDS rozpuszczonego w 0,5 molowym wodorotlenku sodu i podwójnie destylowanej wodzie, aby oczyścić kolumnę. Następnie przemyć kolumnę trzema objętościami kolumny podwójnie destylowanej i trzema objętościami kolumny 20% etanolu w wodzie podwójnie destylowanej. Pobrać próbki SDS-PAGE wszystkich frakcji pikowych i przepływu.Zebrane frakcje należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po zbadaniu ich za pomocą Western blot, rozmrozić i połączyć frakcje zawierające interesujące białka, a pozostałe odrzucić. Aby wykonać etap oczyszczania, zmniejsz objętość roztworu białkowego do dwóch mililitrów za pomocą ultra wirujących jednostek filtrujących.Sekwencyjnie przefiltruj roztwór za pomocą strzykawek filtrujących o średnicy 0,45 mikrometra i 0,22 mikrometra, aby usunąć wszelkie mikroopady. Zrównoważyć kolumnę chromatografii wykluczającej wielkość z objętością jednej kolumny buforu bieżącego zawierającego jeden milimolowy ditiotreitol. Załadować próbkę do kolumny i uruchomić jednostkę chromatograficzną, aż wszystkie białka zostaną wymyte, jak opisano wcześniej.Przygotuj próbki o objętości 50 mikrolitrów do opisanej wcześniej analizy SDS-PAGE i Western blot. Następnie przemyć kolumnę jedną objętością podwójnej destylacji i jedną objętością 20% etanolu w wodzie podwójnie destylowanej. Po przeprowadzeniu analizy Western blot zbierz wszystkie frakcje zawierające FAHD1.Zmniejsz objętość roztworu białkowego do dwóch mililitrów za pomocą jednostek filtrujących do ultrawirowania. Badania przesiewowe Western blot wykazują obecność FAHD1 świń w supernatancie z pasmem na poziomie 25 kilodaltonów, podczas gdy oznakowana kontrola pozytywna przebiega na poziomie 34 kilodaltonów. FAHD1 świń z lizatu oczyszczono za pomocą chromatografii anionowej, a białka wiążące usunięto przez elucję.Frakcje zawierające FAHD1 świń zidentyfikowano za pomocą analizy Western blot, zebrano i zagęszczono. Próbki białek oczyszczono przez SEC i zidentyfikowano za pomocą analizy Western blot. Wydajność białka FAHD1 u świń wynosiła około jednego miligrama przy 80% poziomie czystości.Analiza Western blot wykryła mysie białko FAHD1 w przepływie wraz z innymi białkami. Przepływowy przepływ zastosowano do chromatografii wykluczania wielkości. Frakcje zawierające FAHD1 zostały połączone, skoncentrowane i zastosowane do analizy SDS-PAGE.Uzysk białka nie był jednak zbyt wysoki. Specyficzna aktywność enzymatyczna FAHD1 świń wzrasta wraz z poziomem czystości po zwiększeniu względnej ilości FAHD1 na białko całkowite. Wyższe stężenia siarczanu amonu powodują efekt uśmiechu, który można ustąpić przy niższym napięciu.Dalsze białko stwierdzono w lizacie i supernatancie w stężeniu 15%. Jednak przy wyższych stężeniach próbki mogą się wytrącać i nie można ich wykryć. Przedstawiony tutaj protokół wymaga, aby białko było rozpuszczalne.Należy zbadać i określić optymalne warunki wytrącania i dostosowania pH lub wielkości do chromatografii. Badanie funkcji enzymatycznych, badanie struktury białka i rozwój przeciwciał są bardzo wspierane, gdy białko jest ekstrahowane z tkanki, a nie ekstrahowane z bakterii.

extraction-purification-fahd1-protein-from-swine-kidney-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej żywotności i wysokiej wydajności hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego z wątroby. Osiąga się to poprzez perfuzję wątroby roztworem kolagenazy typu IV przez żyłę wrotną, a następnie wirowanie różnicowe w celu uzyskania hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka.

Oczyszczanie hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka z perfuzji wątroby myszy

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Tutaj prezentujemy protokół izolacji zdrowych i funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy. Opracowano instrukcje dotyczące wykrywania powstającej syntezy białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek w kontekście homeostazy metabolizmu energetycznego w wątrobie.

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Ten protokół ma na celu opisanie izolacji hepatocytów świń i dostarczania genów ex vivo w celu leczenia modeli chorób metabolicznych poprzez autologiczny przeszczep komórek. Chociaż ten konkretny model cieszy się wyjątkowymi zaletami, które sprzyjają skutecznej terapii, aplikacja jest istotną podstawą do zajęcia się dodatkowymi chorobami i wskazaniami.

Terapia genowa hepatocytów ex vivo za pośrednictwem wektora lentiwirusowego do autologicznego przeszczepu u świń

Ekspresja i oczyszczanie białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu jest opisane przykładami (ekspresja w E. coli, FPLC). Oczyszczone białka są używane do krystalizacji i produkcji przeciwciał oraz wykorzystywane do testów enzymatycznych. Przedstawiono wybrane testy fotometryczne w celu wykazania wielofunkcyjności FAHD1 jako dekarboksylazy szczawiooctanu i hydrolazy acylopirogronianowej.

Ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) umożliwia szybką i efektywną izolację mRNA translującego specyficznego dla typu komórki. Tutaj demonstrujemy metodę, która łączy hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej w mysim modelu ponownego zasiedlania wątroby i TRAP w celu zbadania profilu ekspresji repopulujących hepatocytów.

Profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy

Prezentujemy metodę, która łączy oczyszczanie białek błonowych i rekonstytucję w peptydyskach w jednym kroku chromatograficznym. Biotynylowane rusztowania są używane do bezpośredniego przylegania do powierzchni i pomiaru interakcji białko-ligand za pomocą interferometrii biowarstw.

PeptiQuick, jednoetapowa inkorporacja białek błonowych do biotynylowanych peptydysków w celu usprawnienia testów wiązania białek

Tutaj prezentujemy metodę oczyszczania powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus, która jest prosta, tania i efektywna.

Oczyszczanie powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Ten protokół opisuje izolację mięśni szkieletowych i mięśni sercowych włóknisto-adipogennych (FAP) od myszy kolczastej (Acomys) poprzez dysocjację enzymatyczną i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. FAP uzyskane z tego protokołu mogą być skutecznie rozszerzane i różnicowane do miofibroblastów i adipocytów.

Izolacja, ekspansja i różnicowanie fibro-adipogennych progenitorów od modelu myszy kolczastej

Poznaj metodę ekstrakcji białka FAHD1 z nerki świń i wątroby myszy z zachowaniem jego formy fizjologicznej. Ta technika umożliwia uzyskanie czystego białka do badań biochemicznych.

Ekstrakcja i oczyszczanie białka FAHD1 z nerki świń i wątroby myszy

Przeglądaj więcej filmów