Name: Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Naucz się izolować mitochondria z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych. Ta metoda skraca czas oczyszczania i umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu próbek do badań metabolizmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Juanowi J. Tena za korzystanie z homogenizatora oraz obiektom CABD Proteomics and Animal Husbandry za wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez hiszpańskie Ministerstwo Edukacji, Kultury i Sportu poprzez stypendium FPU16/03264 dla J.D.H.C., Association Française contre les Myopathies (AFM) poprzez grant stypendialny #22450 dla C.V.-G., grant instytucjonalny MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Departament Regulacji Genów i Morfogenezy w CABD) oraz BFU2017-83150-P dla J.J.C. Junta de Andalucía przyznała P18-RT-4572, Program Finansowania FEDER z Unii Europejskiej oraz hiszpańskie Ministerstwo Nauki, Innowacji i Uniwersytetów przyznało P.N. RED2018-102576-T.

<ol><li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>Alberts, B., et al. The mitochondrion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%2C+4th+edition%22">Molecular Biology of the Cell, 4th edition</a>. , Garland Science. New York. (2002).</li>
<li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li>
<li>Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li>
<li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III%3A+biochemistry+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li>
<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080(2016).</li>
<li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).</li>
<li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746(2011).</li>
<li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977(2018).</li>
<li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-%C4%B8B%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li>
<li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li>
<li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li>
<li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li>
<li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li>
<li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350(2015).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452(2011).</li>
<li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li>
<li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart%3A+role+of+superoxide+dismutase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li>
<li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42(2016).</li>
<li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer%3A+applications+for+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li>
<li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217(2015).</li>
<li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria%3A+implications+for+mechanistic+stroke+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li>
<li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216(2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Wszystkie metody stosowane do badania oddychania mitochondrialnego mają swoje ograniczenia; Dlatego tak ważne jest, aby wybrać metodę, która najlepiej pasuje do konkretnego pytania eksperymentalnego. Praca ta zapewnia zaktualizowany i szczegółowy protokół izolacji mitochondriów od mięśni szkieletowych myszy w celu wykonania różnych testów oddechowych w celu zbadania funkcji mitochondriów. Rzeczywiście, badanie bioenergetyki mitochondriów w izolowanych mitochondriach przy użyciu technologii opartych na mikropłytkach jest ...

Mitochondria są głównymi organellami metabolicznymi w komórce1. Te wyspecjalizowane organelle otoczone błoną wykorzystują cząsteczki składników odżywczych do wytwarzania energii w postaci adenozynotrójfosforanu (ATP) firmy OXPHOS. Proces ten opiera się na przenoszeniu elektronów z cząsteczek donorowych w serii reakcji redoks w klasie ETC<sup="xref">2. CoQ jest jedynym lipidem aktywnym redoks, który jest endogennie wytwarzany we wszystkich błonach komórkowych i krążących lipoproteinach, który wykazuje funkcję przeciwutleniającą3. Jest niezbędnym składnikiem ETC, przenoszącym elektrony z zależnego od NADH kompleksu I i zależnego od FADH2 kompleksu II do kompleksu III, chociaż wiele innych reduktaz może napędzać redukcję mitochondrialnego CoQ do ubichinolu jako obowiązkowy krok w wielu komórkowych szlakach metabolicznych4,5.
W trakcie procesu, na wewnętrznej błonie mitochondrialnej powstaje elektrochemiczny gradient protonów, który jest przekształcany w biologicznie aktywną energię przez kompleks syntazy ATP V2. W związku z tym dysfunkcja mitochondriów prowadzi do niezliczonych stanów patologicznych, które dotykają głównie tkanki o wysokim zapotrzebowaniu na energię - mózg, serce i mięśnie szkieletowe6,7. Dlatego fundamentalne znaczenie ma opracowanie metod dokładnej analizy bioenergetyki mitochondriów w celu zbadania jej roli w zdrowiu i chorobie, szczególnie w tkankach wysokoenergetycznych, takich jak mięśnie szkieletowe.
Elektroda tlenowa typu Clark była klasycznie używana w badaniach nad oddychaniem mitochondrialnym8. Jednak system ten był stopniowo wypierany przez technologie o wyższej rozdzielczości, przy czym szczególnie popularne są technologie zużycia tlenu oparte na mikropłytkach, takie jak analizatory Agilent Seahorse XF9. W dziedzinie mięśni szkieletowych badania te są zwykle przeprowadzane w hodowanych komórkach, głównie w unieśmiertelnionej linii komórkowej myszy C2C12 lub w kulturach pierwotnych pochodzących z komórek satelitarnych10,11. Jednak badania te nie oddają w pełni sytuacji in vivo, zwłaszcza gdy bada się biologię mitochondriów i ich funkcjonowanie na poziomie tkanek w przypadku określonych zniewag, interwencji niegenetycznych lub manipulacji genetycznych.
Ponadto, testy oddychania w komórkach są bardziej skomplikowane ze względu na dodatkowe czynniki, w tym pozamitochondrialne zapotrzebowanie na ATP i substraty testowe lub zdarzenia sygnalizacyjne, które mogłyby zmylić interpretację wyników. Alternatywnie możliwe jest również użycie pojedynczych lub wiązek świeżo wyizolowanych włókien mięśniowych z mięśni. Jednak metoda izolacji jest technicznie trudna i możliwa do wykonania tylko dla kilku typów mięśni. W tym przypadku używane są głównie mięśnie zginacza palca krótkiego (FDB) i prostownika długiego palca (EDL)10,12,13, chociaż kilka raportów opisuje również użycie innych typów mięśni14,15.
Opisano również profilowanie bioenergetyczne sekcji mięśni szkieletowych16. Główną zaletą tej metody jest to, że można badać nienaruszone mięśnie (autorzy wykazują, że przecinanie włókien nie zaburza wyników w porównaniu z izolowanymi włóknami mięśniowymi). Jednak dostęp mitochondriów do substratów i inhibitorów testów jest ograniczony, a zatem można zmierzyć tylko kilka parametrów16. Wreszcie, izolowane mitochondria mogą być również zastosowane9,17,18,19. W takim przypadku mitochondria tracą środowisko cytozolowe, co może wpływać na ich funkcjonowanie. W przeciwieństwie do tego, metoda ta gwarantuje dostęp do substratów i inhibitorów, umożliwia analizę wielu typów próbek i zazwyczaj wymaga mniejszej ilości materiału.
Ten artykuł opisuje metodę przeprowadzania bioenergetycznego profilowania wyizolowanych mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W szczególności szczegółowo opisano trzy protokoły: test sprzęgający, CA do oceny stopnia sprzężenia między ETC a maszynerią OXPHOS; test przepływu elektronów, NNKT do pomiaru aktywności poszczególnych kompleksów ETC; oraz test BOX w celu określenia zdolności mitochondrialnej β utleniania. Warto zauważyć, że w porównaniu z konwencjonalnymi metodami respirometrii wymagane są tylko niewielkie ilości próbek. Zastosowany tutaj protokół izolacji został zmodyfikowany w stosunku do metody opublikowanej w innym miejscu18.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A5285</td><td>Stan magazynowy przy -20 &deg; Przeciwciało C</td></tr><tr><td>AKT</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>C67E7</td><td>Królik (gatunek gospodarza)</td></tr> <tr><td>anty-koza HRP</td><td>Sigma</td><td>401504</td><td>Królik (gatunek gospodarza)</td></tr> <tr><td>anty-mysia</td> sygnalizacja <td>komórkowa</td> HRP <td># 7076</td><td>Koń (gatunek gospodarza)</td></tr> <tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Stado przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>anty-królicza</td><td>sygnalizacja komórkowa</td> HRP <td># 7074</td><td>Koza (gatunek gospodarza)</td></tr> <tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td>Zapas w RT</td></tr><tr><td>Bactin przeciwciało</td><td>Sigma</td><td>MBS4-48085</td><td>Koza (gatunek gospodarza)</td></tr><tr><td>Bio-Rad Zestaw do oznaczania białek Bio-Rad II</td><td>Bio-Rad</td><td>5000002</td><td>Zawiera 5x odczynnik Bradford i BSA o znanym stężeniu dla krzywej wzorcowej</td></tr><tr><td>BSA, frakcja V, Calbiochem bez kwasów tłuszczowych</td><td></td><td>126575</td><td>zapas w 4 stopniach; Rurka CC</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>Fioletowa pokrywka</td></tr><tr><td>Przeciwciało Calnexin</td><td>ThermoFisher</td><td>MA3-027</td><td>Mysz (gatunek gospodarza)</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Zapas w RT</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BDH</td><td>280254D</td><td>Stan w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td>Stan magazynowy w RT</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Stan magazynowy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>gentleMACS Dysocjator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Homogenizator</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Zapas w RT</td></tr><tr><td>Przeciwciało HSP70</td><td>Proteintech</td><td>10995-1-AP</td><td>Królik (gatunek gospodarza)</td></tr><tr><td>Przeciwciało LDH-A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC27230</td><td>Koza (gatunek gospodarza)</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>ChemCruz</td><td>sc-255260A</td><td>Magazyn w RT</td></tr><tr><td>Kwas jabłkowy</td><td>Sigma</td><td>P1645</td><td>Zapas w RT</td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy</td><td>BMG LABTECH GmbH</td><td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td><td>Zapas w RT</td></tr><tr><td>Milli-Q woda</td><td>System Millipore</td><td>F7HA17757A</td><td>Ultraczysta woda</td></tr><tr><td>Przeciwciało mtTFA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC23588</td><td>Koza (gatunek gospodarza)</td></tr> <tr><td>Na+/K+-ATPaza i alfa; 1 przeciwciało</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-14755</td><td>Mysz (gatunek gospodarza)</td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Stado przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Palmitoilo-L-karnityna</td><td>Sigma</td><td>P1645</td><td>Zapas przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>PBS tabletki</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>1x zapas w RT</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>ChemCruz</td><td>sc-203211</td><td>Zapas w RT</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma</td><td>60377</td><td>Zapas w RT</td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy</td><td>Sigma</td><td>107360</td><td>Zapas w 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>Stan magazynowy przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Analizator strumienia mitochondrialnego Seahorse XF24</td><td>Agilent Technologies</td><td>420179</td><td>Model XFe24</td></tr><tr><td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td><td>Agilent Technologies</td><td>102342-100</td><td>Zestaw zawiera wkłady, mikropłytki i roztwór kalibru</td></tr><tr><td>Bursztynian</td><td>Sigma</td><td>S7626</td><td>Zapas w RT</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>Zapas przeciwciała RT</td></tr><tr><td>TIMM23</td><td>Abcam</td><td>ab230253</td><td>Królik (gatunek żywiciela)</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T7394</td><td>Stado przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało TOMM20</td><td>Abcam</td><td>ab56783</td><td>Mysz (gatunek gospodarza)</td></tr><tr><td>Przeciwciało VDAC</td><td>Abcam</td><td>ab15895</td><td>Królik (gatunek gospodarza)</td></tr></tbody></table>

izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Większość energii komórki jest uzyskiwana poprzez degradację glukozy, kwasów tłuszczowych i aminokwasów różnymi szlakami, które zbiegają się w mitochondrialnym systemie fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS), który jest regulowany w odpowiedzi na zapotrzebowanie komórki. Cząsteczka lipidu Koenzym Q (CoQ) jest niezbędna w tym procesie, przenosząc elektrony do kompleksu III w łańcuchu transportu elektronów (ETC) poprzez ciągłe cykle utleniania/redukcji. Stan mitochondriów i ostatecznie zdrowie komórek można ocenić, mierząc zużycie tlenu przez ETC za pomocą testów respirometrycznych. Badania te są zwykle wykonywane w ustalonych lub pierwotnych liniach komórkowych, które były hodowane przez kilka dni. W obu przypadkach uzyskane parametry oddychania mogły odbiegać od normalnych warunków fizjologicznych w danym narządzie lub tkance.
Dodatkowo, wewnętrzne cechy hodowanych pojedynczych włókien izolowanych z mięśni szkieletowych utrudniają tego typu analizę. W pracy przedstawiono zaktualizowany i szczegółowy protokół analizy oddychania w świeżo wyizolowanych mitochondriach z mięśni szkieletowych myszy. Dostarczamy również rozwiązania potencjalnych problemów, które mogą pojawić się na każdym etapie procesu. Przedstawiona tutaj metoda może być zastosowana do porównania wskaźników zużycia tlenu w różnych transgenicznych modelach myszy i zbadania odpowiedzi mitochondriów na leczenie farmakologiczne lub inne czynniki, takie jak starzenie się lub płeć. Jest to realna metoda odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące bioenergetyki mitochondrialnej, metabolizmu i regulacji.

Protokół przedstawiony w niniejszej pracy umożliwia analizę oddychania mitochondrialnego in vivo poprzez izolację mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy. Schemat metody przedstawiono na Rysunku 1. Po wycięciu mięśni szkieletowych z kończyn tylnych (Rysunek 2), tkanki są homogenizowane, a mitochondria oczyszczane w warunkach izotonicznych poprzez seryjne wirowanie. Czystość poszczególnych frakcji otrzymanych w procesie izolacji można analizować metod...

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

To słowo opisuje analizę oddychania w przetwarzaniu mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy. Protokół ten znacznie skraca czas oczyszczania i umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu próbek. Mitochondria zwierząt dowolnej płci mogą być okaleczane przy użyciu tego protokołu, co umożliwia badanie oddychania w wielu różnych warunkach eksperymentalnych.Ta metoda jest odpowiednia dla wszystkich obszarów badawczych, w których funkcja mitochondriów jest istotna, w tym starzenia się, testowania leków, raka lub rozwoju. Można go nawet dostosować do innych tkanek i organizmów. Upewnij się, że wszystkie materiały są zimne, umieszczając wszystko na lodzie podczas zabiegu, aby chronić mitochondria przed uszkodzeniem.Umieść trzy 50-mililitrowe zlewki na próbkę na lodzie i dodaj 10 mililitrów PBS do zlewki pierwszej, 10 mililitrów 10-milimolowej zlewki EDTA PBS do zlewki drugiej i cztery mililitry IB1 do zlewki trzeciej. Spryskaj prawą tylną kończynę myszy poddanej eutanazji 70% etanolem, aby zapobiec zrzucaniu sierści i przyklej kończynę do korkowej deski preparcyjnej, a następnie przyklej taśmą lewą kończynę przednią. Wykonaj nacięcie sterylnym jednorazowym skalpelem przez skórę od kolana do palca u nogi.Chwyć skórę ząbkowanymi kleszczami na wysokości kostki i przetnij ją cienkimi nożyczkami wokół kostki. Odsuń skórę od leżących pod nią mięśni za pomocą pęsety z cienką końcówką w jednej ręce, a drugą podciągnij ją kleszczami zębatymi. Wypreparuj wszystkie mięśnie szkieletowe od kostki do kolana i usuń całą tkankę łączną nad mięśniem piszczelowym przednim za pomocą cienkiej pęsety i nożyczek.Znajdź cztery dystalne ścięgna mięśnia prostownika długiego palca i przekrój je blisko ich przyczepów w palcach. Zlokalizuj dystalne ścięgno piszczelowe przednie i przetnij je blisko jego przyczepu poniżej kostki. Pociągnij ścięgna piszczelowe przednie i prostownikowe długie palca powyżej kostki, aby uwolnić luźne końce.Chwyć luźne końce ścięgien i odsuń mięśnie od reszty mięśni w kościach, podciągając je do góry. Przetnij ścięgna proksymalne tych mięśni jak najbliżej rzepki. Odwróć mysz do góry nogami, aby kontynuować ekstrakcję mięśnia brzuchatego łydki i płaszczkowatego.Chwyć kieszeń utworzoną między bicepsem, kością udową i mięśniem brzuchatym łydki i oddziel te mięśnie za pomocą cienkich nożyczek, aby uwidocznić ścięgno mięśnia brzuchatego łydki. Chwyć i ostrożnie przetnij dystalne ścięgno Achillesa drobnymi nożyczkami. Przetnij ścięgno mięsnego brzuchatego łydki, uwalniając je wraz z leżącym pod nim płaszczkowatym.Ostrożnie wypreparuj pozostałe mięśnie i ponownie przypnij mysz do pozycji wyjściowej, aby wyciąć mięsień czworogłowy. Wyrzuć tkankę tłuszczową, a następnie włóż cienką pęsetę między mięsień czworogłowy uda a kość udową, aby oddzielić mięsień od kości. Chwyć dystalne ścięgna mięśnia czworogłowego uda i przetnij ścięgno jak najbliżej rzepki.Podciągnij mięsień czworogłowy uda do góry i uwolnij go cienkimi nożyczkami w miejscu bliższego wkłucia. Powtórz to samo dla lewej kończyny tylnej. Opłucz wszystkie mięśnie w zlewce pierwszej, następnie drugiej, a następnie w zlewce trzeciej.Na koniec zmiel wszystkie mięśnie w zlewce trzeciej ostrymi nożyczkami na lodzie. Przenieś zawiesinę do rurki C, szczelnie ją zamknij i przymocuj do góry nogami na tulei homogenizatora. Podziel homogenat na dwie 2-mililitrowe, wstępnie schłodzone mikroprobówki wirówkowe i wiruj przez 10 minut.Następnie przenieść supernatant do nowych, wstępnie schłodzonych probówek i odwirować przez kolejne 10 minut. Połącz osad w 500 mikrolitrach IB2 Przenieś supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 2 mililitrów i oznacz ją jako supernatant numer dwa lub SN2. Ponownie zawiesić końcowy osad mitochondrialny w 200 mikrolitrach buforu zawiesiny.Szybko odłóż 10 mikrolitrów do ilościowego oznaczania białka i natychmiast dodaj 10 mikrolitrów 10% FFA BSA do pozostałej zawiesiny mitochondrialnej, aby zapobiec uszkodzeniu. Odwirować stężoną zawiesinę mitochondrialną o temperaturze 10 500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad mitochondrialny w 100 mikrolitrach pożywki do oznaczania sprzęgającego 1X z BSA, pożywki do oznaczania przepływu elektronów 1X z BSA lub pożywki do utleniania 1X beta z BSA, w zależności od protokołu, który ma być wykonany.Rozcieńczyć tę skoncentrowaną próbkę mitochondrialną do 0,2 mikrograma na mikrolitr przy użyciu odpowiedniego podłoża do oznaczania. Wysiewaj 50 mikrolitrów zawiesiny na studzienkę na wstępnie schłodzonej 24-dołkowej mikropłytce na lodzie. Do studzienek korekcyjnych w tle dodać tylko odpowiednie podłoże do oznaczania.Pozostałą zawiesinę mitochondrialną należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu oznaczenia czystości fragmentacji. Obracać mikropłytkę we wstępnie schłodzonej wirówce preparatywnej przez 20 minut. W międzyczasie podgrzej pozostałą pożywkę testową do 37 stopni Celsjusza.Po odwirowaniu pozostaw mikropłytkę na stole na pięć minut, aby uzyskać równowagę. Powoli i ostrożnie dodawać 450 mikrolitrów ciepłej pożywki testowej na studzienkę, aby uniknąć oderwania mitochondriów. Umieść mikropłytkę natychmiast w przyrządzie do pomiaru zużycia tlenu bez pokrywki i uruchom program pomiarowy.Upewnij się, że pierwszym krokiem jest 10-minutowa inkubacja, aby mikropłytka mogła się rozgrzać. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij wkład i mikropłytkę, wyłącz przyrząd i rozpocznij analizę. Ogólne profile białkowe z różnych frakcji uzyskanych przez seryjne wirowanie wykazały odrębne populacje białek w izolowanych frakcjach.Obecność całej zawartości mitochondriów jest widoczna w silnych sygnałach dla markerów zewnętrznej i wewnętrznej błony mitochondrialnej oraz białek związanych z nukleoidami. Frakcja N reprezentuje jądra i niezakłócony materiał. Większość markerów retikulum endoplazmatycznego, błony plazmatycznej lub cytoplazmy we frakcjach SN1 lub SN2 podkreśla wysoką czystość uzyskaną podczas izolacji.Wzrost zużycia tlenu zaobserwowano po dodaniu ADP w testach sprzęgania i utleniania beta. Po dodaniu cyjanku karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazonu zużycie tlenu osiągnęło najwyższy poziom. Niski współczynnik kontroli oddechowej zapewnia integralność izolowanych mitochondriów.W teście przepływu elektronów zbadano aktywność kompleksów łańcucha transportu elektronów pojedynczo lub w połączeniu poprzez wstrzyknięcie określonych substratów i inhibitorów. Izolujące mitochondria są niezwykle wrażliwe. Dlatego wszystkie kroki po łagodzeniu skutków tkanek muszą być wykonywane starannie i ostrożnie, aby zachować ich żywotność.Testy eksperymentalne mogą być uzupełnione deterministyczną analizą sematyką kluczowych cząsteczek mitochondriów lub badaniem składania kompleksów respirometrycznych przy użyciu elektroforezy w monoforezie w natywnym żelu poliakryloamidowym na niebiesko.

isolation-mitochondria-from-mouse-skeletal-muscle-for-respirometric

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Mitochondria są kluczowymi organellami metabolicznymi, które wykazują wysoki poziom plastyczności fenotypowej w mięśniach szkieletowych. Import białek z cytozolu jest krytycznym szlakiem biogenezy organelli, niezbędnym do ekspansji retikulum i utrzymania funkcji mitochondriów.  Dlatego import białka służy jako barometr zdrowia komórek.

Pomiar zdolności importowej białek z mitochondriów mięśni szkieletowych

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Metoda enzymatycznej dysocjacji, znakowania powierzchniowego i oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej progenitorów fibro/adipogennych i miogennych z mięśni szkieletowych myszy.

Oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych

Przedstawiona tutaj metoda obejmuje precyzyjne uszkadzanie żywych zarodków rybek danio (*zebrafish*) za pomocą wysokenergetycznych impulsów laserowych oraz późniejszą analizę tych obrażeń i ich regeneracji w czasie. Pokazujemy również, w jaki sposób można śledzić pojedyncze lub grupy genetycznie znakowanych komórek mięśni szkieletowych podczas i po uszkodzeniu indukowanym światłem laserowym.

Laserowe uszkodzenie szkieletowej muskulatury embrionów danio-ostrolepnego

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Naucz się izolować mitochondria z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych. Ta metoda skraca czas oczyszczania i umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu próbek do badań metabolizmu.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Przeglądaj więcej filmów