Name: Wizualizacja zmian w obwodzie neuron-glej za pomocą techniki obrazowania wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Poznaj technikę obrazowania wapnia Fura-2 AM do monitorowania sygnałów wapniowych w żywych komórkach siatkówki kurczaka. Metoda pozwala rozróżnić odpowiedzi neuronów i komórek glejowych na stymulację chlorkiem potasu i ATP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Granty, sponsorzy i źródła finansowania: MH jest laureatem stypendium doktoranckiego CNPq. HRF jest stypendystą stażu podoktorskiego wspieranego przez CNPq (grant HRF nr 152071/2020-2). RAMR jest wspierany przez CNPq i FAPERJ (numery grantów E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 i 312157/2016-9 oraz INCT-INNT (National Institute for Translational Neuroscience).

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Federalnego w Rio de Janeiro, zgodnie z "Zasadami Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi" (NIH, Bethesda, USA); numer zezwolenia IBCCF-035 dla zapłodnionych jaj kurzych White Leghorn.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór Krebsa: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 6 mM glukozy, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mOsm).</li>
	<li>Przygotuj bufor soli fizjologicznej (roztwór wolny od Ca2+ i Mg2+ - CMF): 76,55 g/L NaCl, 3,05 g/L KCl, 1,65 g/L Na2HPO4, 0,610 g/L KH2PO4, 21,95 g/L glukozy i 7,90 g/L NaHCO3.</li>
	<li>Przygotować roztwór inkubacyjny (z Fura-2 w roztworze Krebsa:) 5 μM estru fura-2-acetoksymetylowego (Fura-2), 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) wolnej od kwasów tłuszczowych i 0,02% Poloxameru 407.</li>
	<li>W przypadku populacji mieszanej lub hodowli glejowej należy przygotować DMEM/F12 z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i 40 mg/l gentamycyny jako pożywką.</li>
	<li>Do hodowli wzbogaconej neuronami należy przygotować DMEM/F12 z 1% FCS, suplementem do hodowli komórek neuronalnych, 40 mg/L i gentamycyną jako pożywką.</li>
</ol>
2. Sekcja siatkówki i przygotowanie hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Otwórz jajo 8-dniowego zarodka pisklęcia (E8), w którym znajduje się komórka powietrzna.</li>
	<li>Wyjmij zawartość jaja na szalkę Petriego i przystąp do eutanazji zarodka poprzez ścięcie głowy za pomocą pęsety.</li>
	<li>Przynieś głowę na czystą szalkę Petriego i wlej trochę roztworu wolnego od wapnia i magnezu (CMF), aby ją umyć.</li>
	<li>Zdejmij oczy, uważając, aby ich przy tym nie uszkodzić. 
	UWAGA: Staraj się unikać przecinania lub rozdrabniania warstw oka przed usunięciem go z jamy oka.</li>
	<li>Przyłóż oczy do czystej szalki Petriego zawierającej CMF.</li>
	<li>Rozpocznij sekcję oka od zdjęcia soczewki.</li>
	<li>Wykonaj 3 lub 4 podłużne nacięcia w oku, zaczynając od otworu pozostawionego przez soczewkę. Wykonuj cięcia, ciągnąc za pęsetę, trzymając twardówkę oka w przeciwnych kierunkach.</li>
	<li>Ostrożnie usuń przezroczysty korpus ciała szklistego, upewniając się, że siatkówka nie jest z nim związana.</li>
	<li>Odłącz siatkówkę od pigmentowanego nabłonka i usuń pozostałą tkankę.</li>
	<li>Pokrój przezroczystą siatkówkę na małe kawałki.</li>
	<li>Przenieś siatkówkę do innego biorcy i krótko odwiruj (~1,800 x g przez 1 minutę) w celu usunięcia CMF.</li>
	<li>Enzymatycznie dysocjować siatkówkę za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny, inkubując ją w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, dodając 1 ml pożywki zawierającej 10% FCS.</li>
	<li>Przemyj siatkówkę 2 lub 3 razy pożywką. Mycie składa się z cykli dodawania pożywki i usuwania jej przez odwirowanie (~1 800 x g przez 1 min).</li>
	<li>Dodać 2 ml kompletnej pożywki na siatkówkę i delikatnie mechanicznie rozdzielić siatkówkę, pipetując ją w górę i w dół. 
	UWAGA: Tutaj badacze mogą wybrać, jaki rodzaj kultury zostanie przygotowany. Aby uzyskać wzbogaconą hodowlę neuronów, użyj DMEM-F12 + suplement neuronalny + 1% FCS + antybiotyki. W przypadku populacji mieszanej lub oczyszczonego gleju należy stosować DMEM-F12 + 10% FCS + antybiotyki.</li>
	<li>Policz komórki i rozcieńcz je do pożądanej gęstości. 
	UWAGA: Idealnie powinna to być kultura o niskiej gęstości z ~ 2 x 106 komórkami lub mniej.</li>
	<li>Dodać 50 μl zawiesiny komórek do każdego szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Leczenie szkiełek nakrywkowych
	<ol>
		<li>Szkiełka nakrywkowe inkubować przez co najmniej 1 godzinę (najlepiej przez noc) w 1 ml 10-50 μg/ml poli-L-lizyny w wysterylizowanej oczyszczonej wodzie o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usuń roztwór poli-L-lizyny i umyj szkiełka nakrywkowe wysterylizowaną oczyszczoną wodą 2-3 razy.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia w szafce bezpieczeństwa z włączonymi światłami UV. W tym momencie należy je przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
		<li>Etap opcjonalny: W przypadku kultur wzbogaconych w neurony dodać 50 μl lamininy o stężeniu 10-20 ng/ml w PBS lub pożywce do każdego szkiełka nakrywkowego przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Po inkubacji usunąć nadmiar roztworu lamininy i szkiełko nakrywkowe jest gotowe do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 aż do momentu, gdy przyczepią się do szkła. Powinno to zająć około 1-2 godzin.</li>
	<li>Dodać 1 ml kompletnej pożywki do każdej studzienki i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do dnia eksperymentu. W razie potrzeby zmieniaj podłoże co 2-3 dni.</li>
</ol>
3. Wczytywanie komórek za pomocą Fura-2 AM
<ol>
	<li>Rozpuścić rozpuszczenie w fiolce 50 μg leku Fura-2 AM w 50 μl DMSO.</li>
	<li>Aby przygotować działający roztwór Fura-2 AM, dodać 3 μl 10% Poloxameru 407, 7,5 μL Fura-2 AM w DMSO i roztworze Krebsa q.s.p. do 1,5 ml.</li>
	<li>Sonikować mieszaninę przez 7 minut w łaźni wodnej.</li>
	<li>Przemyć szkiełko nakrywkowe kulturą komórkową 3x roztworem Krebsa przed inkubacją w Fura-2.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.</li>
	<li>Po inkubacji umyj go ponownie 3x i przenieś do innego pojemnika zawierającego Krebsa i chronionego przed światłem. 
	UWAGA: Działający roztwór Fura-2 AM pozostaje stabilny przez 24 godziny, jeśli jest chroniony przed światłem.</li>
</ol>
4. Obrazowanie komórek wapniowych
<ol>
	<li>Przed każdym uruchomieniem dodaj silikon do wspornika szkiełka nakrywkowego i komory, aby uniknąć wycieku podczas eksperymentu.</li>
	<li>Umyj spód szkiełka nakrywkowego wodą destylowaną, aby uniknąć krystalizacji soli na soczewce mikroskopu.</li>
	<li>Połóż szkiełko nakrywkowe na podporze, delikatnie dociskając brzegi.</li>
	<li>Przymocuj podporę i komorę do mikroskopu i rozpocznij perfuzję komórek roztworem Krebsa. 
	UWAGA: Perfuzja komórek podczas eksperymentów obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach jest kalibrowana do szybkości przepływu 0,5 ml / min, a pełna wymiana roztworu platformy zajmuje 8-10 s.</li>
	<li>Spójrz na komórki i wybierz odpowiednie pole widzenia.</li>
	<li>Ręcznie wybierz ciała komórek na podstawie ich odrębnej morfologii.</li>
	<li>Przed zastosowaniem jakiegokolwiek bodźca poczekaj na stabilizację linii bazowej. Każdy bodziec powinien trwać około 30 sekund. 
	UWAGA: Przygotuj wszystkie roztwory bezpośrednio przed każdym eksperymentem.</li>
	<li>Ocenić zmiany w [Ca2 + ]i, określając ilościowo stosunek fluorescencji emitowanej przy 510 nm po naprzemiennym wzbudzeniu (750 milisekund) przy 340 i 380 nm.</li>
	<li>Przetwarzanie uzyskanych wartości za pomocą oprogramowania do analizy fluorescencji.</li>
	<li>Wyraź wyniki eksperymentu w tabeli, w której każdy wiersz reprezentuje pojedynczą komórkę, a każdy wiersz punkt czasu.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Za pomocą arkusza kalkulacyjnego narysuj zmienność wartości współczynnika fluorescencji Fura-2 dla pojedynczych komórek osobno lub wszystkich z nich w tym samym czasie.</li>
	<li>Aby określić ilościowo liczbę komórek reaktywnych na określony bodziec, należy ustalić wartość graniczną 30% wzrostu wyjściowego poziomu wapnia</li>
</ol>

<ol><li>Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+in+intact+lymphocytes%3A+cytoplasmic+free+calcium+monitored+with+a+new%2C+intracellularly+trapped+fluorescent+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator.</a> Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Islam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling%3A+From+Basic+to+Bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling: From Basic to Bedside.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).</li>
<li>De Melo Reis, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+cell+phenotypes+differentiating+from+mice+retinal+neurospheres+using+single+cell+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).</li>
<li>Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+itself+promotes+the+developmental+switch+of+neuronal+GABAergic+responses+from+excitation+to+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition.</a> Cell. 105 (4), 521-532 (2001).</li>
<li>Schitine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampakine+CX546+increases+proliferation+and+neuronal+differentiation+in+subventricular+zone+stem%2Fprogenitor+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis%3A+a+role+for+hemopressin%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59(2014).</li>
<li>Ribeiro-Resende, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+lacking+GD3+synthase+display+morphological+abnormalities+in+the+sciatic+nerve+and+neuronal+disturbances+during+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration.</a> PLoS One. 9 (10), 108919(2014).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+type+1+cannabinoid+receptor+%28CB1R%29+promotes+neurogenesis+in+murine+subventricular+zone+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures.</a> PLoS One. 8 (5), 63529(2013).</li>
<li>Kubrusly, R. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-glial+cannabinoid+receptors+modulate+signaling+in+the+embryonic+avian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina.</a> Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).</li>
<li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).</li>
<li>Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X7+Receptors+Amplify+CNS+Damage+in+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li>
<li>Faroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signaling+mediated+by+P2X7+receptors+controls+myelination+in+sciatic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves.</a> Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).</li>
<li>Freitas, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+Induce+Cell+Death+and+Promote+P2X7+Receptor+Signaling+in+Retinal+Glial+Progenitors+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture.</a> Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).</li>
<li>Freitas, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-Induced+Calcium+Shifts+in+Chick+Retinal+Glial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells.</a> PLoS One. 11 (4), 0153677(2016).</li>
<li>Yang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+receptors+for+glutamate+and+GABA+in+retinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons.</a> Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).</li>
<li>Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+coupling+of+NMDA+receptor+with+ip3+production+in+cultured+cells+of+the+avian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina.</a> Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).</li>
<li>López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+amino+acid-induced+phosphoinositide+hydrolysis+in+M%C3%BCller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia.</a> Glia. 9 (2), 127-135 (1993).</li>
<li>Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+dopamine+research+in+retina+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods of dopamine research in retina cells.</a> Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).</li>
<li>Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, Á, de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+P2X7+Receptor%3A+Involvement+in+Neuronal+Physiology+and+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).</li>
<li>Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+P2X7+Receptors+Revisited%3A+Do+They+Really+Exist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).</li>
<li>Schitine, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+plasticity+of+GAT-3+in+avian+M%C3%BCller+cells+is+regulated+by+neurons+via+a+glutamatergic+input%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input.</a> Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).</li>
<li>Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+potentiates+the+release+of+GABA+mediated+by+NMDA+receptor+activation%3A+Involvement+of+A1+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors.</a> Neuroscience. 281, 208-215 (2014).</li>
<li>Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X7+receptor+large+pore+signaling+in+avian+M%C3%BCller+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).</li>
<li>Passos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Serotonergic+System+by+Kainate+in+the+Avian+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).</li>
<li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina%3A+neurotransmitters+and+trophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li>
<li>Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmitter+Release+from+Astrocytes%3A+Functional+Developmental%2C+and+Pathological+Implications+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience.+9%2C+499%22%5BJournal%5D)">Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Użyliśmy tkanki siatkówki, aby pokazać, że odpowiedzi wapniowe, w których pośredniczy KCl lub ATP, są wyraźnie podzielone odpowiednio na odpowiedzi neuronalne i glejowe (ryc. 1). Chociaż niektóre dane w literaturze sugerują, że receptory P2X7 ulegają ekspresji w neuronach, które regulują aktywność neuronalną i uwalnianie neuroprzekaźników synaptycznych20, inni autorzy kwestionują istnienie neuronalnych receptorów P2X7. Rzeczywiście, obecne wyniki potwierdzają ideę, że...

Ze względu na uniwersalne właściwości wapnia jako drugiego posłańca, jon ten bierze udział w ogromnej liczbie działań sygnalizacyjnych: transkrypcji genów, narodzin i śmierci, proliferacji, migracji i różnicowania, transmisji synaptycznej i plastyczności. W związku z tym metoda zdolna do śledzenia dynamiki aktywacji wapnia z dokładnością i zwinnością zapewniłaby sposób na obserwację unikalnych reakcji przestrzenno-czasowych. Taką metodą jest technika obrazowania wapnia komórkowego, która koreluje dane funkcjonalne dotyczące przesunięć wapnia z określonymi fenotypami komórek w oparciu o ich odrębne odpowiedzi.
Ca2+ sondy zostały po raz pierwszy opracowane w latach 80-tych, z późniejszymi ulepszeniami pozwalającymi na wykorzystanie tych cząsteczek w testach na żywych komórkach1. Jako wskaźnik chemiczny Fura-2 jest uważany za standard dla pomiarów ilościowych [Ca2+]i. Ester acetoksymetylowy (AM) tego wskaźnika (tj. Fura-2 AM) łatwo przenika przez błonę komórkową i może osiągnąć stężenia wewnątrzkomórkowe 20-krotnie większe niż rozcieńczenie inkubacyjne (np. [5 μM]o/[100 μM]i). Kolejną zaletą Fura-2 jest to, że ma dobrą odporność na fotowybielanie; Tak więc obrazowanie tego wskaźnika przez dłuższy czas nie wpłynie znacząco na jego zdolności fluorescencyjne. Wreszcie, Fura-2 jest wrażliwa na szeroki zakres poziomów wapnia, od ~100 nM do ~100 μM, i ma Kd ~145 nM, co jest porównywalne z spoczynkową [Ca2+]i2. Później opracowano obrazowanie wapnia w komórkach przy użyciu lepszych mikroskopów fluorescencyjnych i metod obliczeniowych, a także sond ratiometrycznych, na które nie ma wpływu obciążenie barwnikiem.
Każda komórka wyraża różne urządzenia wapniowe (pompy, transportery, receptory i kanały), które przyczyniają się do końcowej odpowiedzi jako szczególna sygnatura. Ważną wskazówką jest znalezienie selektywnych odpowiedzi różnych typów komórek skorelowanych z ich ekspresją fenotypową. W związku z tym istnieją co najmniej dwa różne receptory, które działają poprzez przesunięcia wapnia: receptory jonotropowe, które przenikają Ca2 + w trybie szybkim i powolne receptory metabotropowe sprzężone ze szlakami sygnałowymi i zapasy wewnątrzkomórkowe, które uwalniają Ca2 + aktywowane przez drugie przekaźniki, takie jak trifosforan inozytolu i cykliczna ADP-ryboza3.
Na przykład, komórki progenitorowe wyrażają gniazdo w niedojrzałej siatkówce i wykazują receptoryGABA A zdepolaryzowane przez GABA (lub muscymol)4. Dzieje się tak z powodu gradientu elektrochemicznego Cl- z wysokimi wewnątrzkomórkowymi poziomami Cl−; w miarę rozwoju tkanki transportery KCC2 przełączają się z pobudzenia na progenitorach na hamowanie na dojrzałych neuronach GABAergicznych5. Z drugiej strony, komórki macierzyste, które wyrażają sox-2 w niedojrzałej strefie podkomorowej (SVZ) gryzoni po urodzeniu, wykazują również metabotropowe receptory H1 aktywowane przez histaminę, zwiększając Ca2+ w powolny sposób6. Drugi receptor metabotropowy z rodziny receptorów aktywowanych proteazą-1 (PAR-1), aktywowany przez trombinę i w dół do G (q / 11) i fosfolipazy C (PLC), powoduje powolne przesunięcia Ca2 + w oligodendrocytach (które wyrażają O4 i PLP) generowanych z multipotencjalnych nerwowych komórek macierzystych SVZ7.
Ogólnie, neurony wyrażają zależne od napięcia kanały wapniowe, jak również główne receptory neuroprzekaźników przepuszczalne dla Ca2+, takie jak receptory glutaminergiczne (AMPA, NMDA, kainian) oraz obwodowe i ośrodkowe receptory nikotynowe. Chlorek potasu jest zwykle stosowany jako środek depolaryzujący do aktywacji neuronów obwodowych, takich jak neurony zwoju korzenia grzbietowego8 lub neurony centralne, jak ze strefy podkomorowej9 lub retina10. Z drugiej strony, ATP jest uznawany za główny przekaźnik glejowy (oprócz D-seryny), który aktywuje selektywne przepuszczalne dla Ca2+ składniki P2X, takie jak P2X7 i P2X4. Oba receptory prezentują równoważne prądy Ca2+, podobne do tych wykazywanych przez receptory NMDA uznane za największe prądy Ca2+ aktywowane przez nadajniki11. Receptory P2X7 są silnie eksprymowane na mikrogleju, ale w mniejszej gęstości na astrocytach i oligodendrocytach, odgrywając rolę w uwalnianiu cytokin prozapalnych12. Receptory P2X7 ulegają również ekspresji na komórkach Schwanna13 i gleju Müllera w siatkówce14,15.
Siatkówka znana jest z tego, że pokazuje prawie wszystkie przekaźniki widoczne w mózgu. Na przykład oś pionowa (fotoreceptory, komórki dwubiegunowe i zwojowe siatkówki) jest głównie glutaminergiczne, z przepuszczalnymi dla wapnia receptorami AMPA lub kainianowymi ulegającymi ekspresji w komórkach OFF-bipolarnych i mgluR6 ulegającym ekspresji w komórkach ON-bipolarnych16. Co ciekawe, wszystkie trzy receptory znajdują się również w gleju Müllera, które są sprzężone ze szlakami trifosforanu wapnia i inozytolu17,18. Pozioma oś hamująca, wytwarzana przez komórki poziome i amakrynowe, wydziela nie tylko GABA, ale także dopaminę, acetylocholinę i inne klasyczne neuroprzekaźniki. Komórki amakrynowe są głównymi typami komórek występujących w hodowlach siatkówki ptaków, wykazującymi kilka typów kanałów obsługiwanych przez wapń, takich jak kanały glutaminergiczne, purynergiczne, nikotynowe i zależne od napięcia. Z tego powodu jest to doskonały model do oceny różnych właściwości przesunięć wapnia między neuronami i glejem.
Dlatego połączenie różnych receptorów i kanałów sumowanych do selektywnych markerów fenotypowych podczas rozwoju z wyraźnymi wzorcami odpowiedzi agonistycznych pozwala na unikalne sygnatury w pniu, prekursorze, neuronie, astrocytach, oligodendrocytach i mikrogleju, które działają poprzez selektywne urządzenia sygnalizacyjne.

<table><tbody><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 15 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>111550</td><td>Obsługa komórek</td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy 510 nm</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Suplement</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP cyfrowy kamera</td><td>Roper Scientific, Trenton, NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Neon</td><td>1466</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ F-12</td><td>Gibco</td><td>12400-24</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>Suplement</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Axiovert 200; Sondy molekularne Carl Zeiss</td><td>B 40-080</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td></td><td>F1221</td><td>Ratiometryczny wskaźnik Ca2+</td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Calbiochem</td><td>1405-41-0</td><td>antybiotyki</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Aparat DG-4</td><td>Sutter Instrument, Novato, CA</td><td>DG-4PLUS/OF30</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>Pomoc adhezja komórek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Metafluor</td><td>Universal Imaging Corp. West Chester, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Vetec</td><td>129</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Isofar</td><td>310</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Vetec</td><td>306</td><td></td></tr><tr><td>Platforma PH3</td><td>Warner Intruments, Hamden, CT</td><td>64-0286</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sondy molekularne</td><td>P6866</td><td>niejonowy, powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Wspomaga adhezję komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0,25%</td> <td>Gibco</td><td>25200056</td><td>enzymu dysocjacji</td></tr></tbody></table>

wizualizacja zmian w obwodzie neuron-glej za pomocą techniki obrazowania wapnia

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Tutaj opisujemy selektywne modele in vitro obwodów opartych na gleju (astrocyty, oligodendrocyty i mikroglej) i/lub neuronach z tkanek obwodowych (zwoje korzenia grzbietowego) i centralnych (kora, strefa podkomorowa, organoid), które są dynamicznie badane pod kątem przesunięć wapnia. Modelem wybranym do zilustrowania wyników jest siatkówka, prosta tkanka ze złożonymi interakcjami komórkowymi. Wapń jest uniwersalnym przekaźnikiem zaangażowanym w większość ważnych ról komórkowych. Wyjaśniamy krok po kroku, w jaki sposób można przygotować i ocenić komórki neuronalno-glejowe siatkówki w hodowli, przewidując zmiany wapnia. W tym modelu różnicujemy neurony z gleju na podstawie ich selektywnej odpowiedzi na KCl i ATP. Receptory i kanały przepuszczalne dla wapnia ulegają selektywnej ekspresji w różnych przedziałach. Do analizy odpowiedzi wapnia używamy ratiometrycznych matryc fluorescencyjnych, takich jak Fura-2. Sonda ta określa ilościowo stężenie wolnego Ca2+ w oparciu o formy wolne od Ca2+ i związane z Ca2+, prezentując dwa różne piki, oparte na intensywności fluorescencji postrzeganej na dwóch długościach fal.

W niniejszej pracy wykorzystano hodowlę komórek siatkówki z zarodków kurcząt z 8. dnia embrionalnego, aby zbadać sposób przekazywania sygnałów przez neurony i glej w formie zmian poziomu wapnia. Hodowle przygotowano zgodnie z opisem15,19 jako mieszane hodowle neuronów i gleju (przy gęstości ≥ 1 x 106 komórek/szalkę) na etapie 7 dni in vitro (Rycina 1A). Alternatywnie przygotowano wzbogacone hodowle neuronów o niskiej gęsto...

Obrazowanie wapnia w komórkach jest wszechstronną metodologią do badania dynamicznej sygnalizacji pojedynczych komórek, na mieszanych populacjach w kulturze, a nawet na przebudzonych zwierzętach, w oparciu o ekspresję przepuszczalnych dla wapnia kanałów/receptorów, które dają unikalne sygnatury funkcjonalne.

Wizualizacja zmian w obwodzie neuron-glej za pomocą techniki obrazowania wapnia

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie zmian stężenia wapnia cytozolowego w żywych komórkach w celu różnicowania odpowiedzi neuronalnych lub glejowych na podstawie bodźców chlorku potasu lub ATP. Wapń jest ważnym drugim przekaźnikiem zaangażowanym w kilka procesów komórkowych, w tym neuroprzekaźnictwo, plastyczność i apoptozę. Pojawienie się wysoce selektywnego fluorescencyjnego barwnika wapniowego, takiego jak Fura-2 AM, w połączeniu z rozwojem lepszych mikroskopów fluorescencyjnych i metod obliczeniowych, dostarczyło danych optycznych o wysokiej rozdzielczości o wysokim stopniu rozdzielczości przestrzennej i czasowej do obrazowania sygnalizacji wapniowej na żywych komórkach i organizmach.Protokół ten można dostosować do wzbogaconych neuronów, oczyszczonych glejów lub kultur populacji mieszanej. Śledzi, które typy komórek reagowały na określone bodźce w oparciu o różnicową odpowiedź na chlorek potasu i ATP. Chlorek potasu zmienia potencjał błonowy komórki.A to otwiera kanały wapniowe bramkowane napięciem, wyrażane głównie przez neurony. Z drugiej strony ATP aktywuje duży kanał częściowy P2X7, obecny głównie w komórkach glejowych. Łącząc bodźce chlorku potasu i ATP z innymi lekami, można zobaczyć, który przedział układu nerwowego na nie reaguje, na podstawie wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia.Do tej procedury potrzebne będą narzędzia chirurgiczne lub pęseta. Używaj komory bezpieczeństwa biologicznego i stosuj najlepsze praktyki, aby uniknąć zanieczyszczenia. Aby rozpocząć hodowlę siatkówki kurczaka, ostrożnie otwórz zapłodnione jajo przy dnie, gdzie znajduje się komórka powietrzna.Wyjąć zawartość na szalkę Petriego i przystąpić do dawstwa zarodków poprzez dekapitację za pomocą pęsety. Po wyjęciu głowy przenieś ją na czystą szalkę Petriego i dodaj do niej trochę roztworu wolnego od wapnia i magnezu. Następnie usuń oczy, uważając, aby ich nie uszkodzić.Skierować oko na inną szalkę Petriego zawierającą roztwór CMF. Za pomocą pęsety zacznij preparować oko, zdejmując soczewkę. Następnie, zaczynając od otworu pozostawionego przez soczewkę, wykonaj trzy lub cztery podłużne nacięcia w oku.Ostrożnie usunąć przezroczysty korpus szklisty. Upewnij się, że siatkówka nie jest z nim związana. Następnie delikatnie odłącz siatkówkę od nabłonka barwnikowego.Usuń pozostałą tkankę nabłonkową. Gdy siatkówka będzie całkowicie czysta, pokrój ją na małe kawałki. Pobranie całej tkanki siatkówki za pomocą automatycznej pipety.Krótko odwirować siatkówkę, aby usunąć cały CMF. Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny. I inkubować tkankę w temperaturze 37 C przez 10 minut.Zatrzymaj reakcję trypsyny, dodając 1 ml pożywki zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej. Odwiruj siatkówkę, aby usunąć całą trypsynę. Umyj komórki dwa lub trzy razy pożywką zawierającą 10% FCS.Następnie dodaj 2 ml pożywki na siatkówkę i delikatnie mechanicznie ją rozłącz. Rozcieńczyć komórki, aby móc je prawidłowo policzyć za pomocą hemocytometru. Użyj szkiełek nakrywkowych o średnicy 15 mm zabezpieczonych poli-L-lizyną i lamininą, aby poprawić przyczepność komórek.Odpipetować 50 l rozcieńczonych komórek na każde szkiełko nakrywkowe. Inkubować komórki w temperaturze 37 C w atmosferze 5% CO2. I schłodź je, aby przymocować szkło.Powinno to zająć około jednej do dwóch godzin. Dodać 1 ml pożywki i umieścić ją z powrotem w inkubatorze do dnia eksperymentu. W razie potrzeby zmieniaj połowę podłoża co dwa do trzech dni.Rozpuścić 50 g fiolkę Fura-2 AM w 50 l DMSO. Roztwór Krebsa jest dobrym rozwiązaniem do przenoszenia komórek podczas eksperymentu, ponieważ nie zakłóca pomiaru fluorescencji. Przed rozpoczęciem podgrzej roztwór do 37 stopni.Dodać Poloxamer 407. Dodaj Fura-2 AM i DMSO. Sonikuj go przez siedem minut w łaźni wodnej.Przygotuj płytkę 6-dołkową, dodając roztwór Krebsa do trzech studzienek i działający roztwór Fura-2 do drugiej. Umyj szkiełko nakrywkowe zawierające komórki trzy razy przed dodaniem do Fura-2. Inkubować komórki w temperaturze 37 C i 5% atmosferze CO2 przez 30 minut w ciemnym inkubatorze.Po inkubacji umyj go ponownie trzy razy. Przenieś go do innego odbiorcy zawierającego Krebsa i chroń go przed światłem. Możliwe jest ponowne wykorzystanie przygotowanego preparatu Fura-2 do inkubacji większej liczby szkiełek nakrywkowych z komórkami.Dodaj silikon do wspornika szkiełka nakrywkowego i komory przed każdym uruchomieniem, aby uniknąć wycieku roztworu. Wyjmij szkiełko nakrywkowe z roztworu Krebsa i ostrożnie umyj dno wodą destylowaną, aby uniknąć krystalizacji soli na soczewce mikroskopu. Połóż szkiełko nakrywkowe na podporze, ostrożnie dociskając krawędzie.Przymocuj wspornik szkiełka nakrywkowego i komorę do mikroskopu i rozpocznij perfuzję komórek roztworem Krebsa. Zaznacz odpowiednie komórki i wybierz dobre pole. Ręcznie określ obszary zainteresowania, wybierając ciała komórek na podstawie ich odrębnej morfologii.Zmiany stężenia wapnia oceniano poprzez ilościowe określenie stosunku fluorescencji emitowanej przy 510 nm po naprzemiennym wzbudzeniu przy 340 i 380 nm. Po dodaniu chlorku potasu można zobaczyć wiele świecących komórek i wzrost odpowiedzi fluorescencyjnej na wykresie. Chlorek potasu otwiera bramkowane napięciem kanały wapniowe, obecne głównie w neuronach.Każda pojedyncza linia na wykresie reprezentuje unikatowy obszar zainteresowania. W związku z tym możliwe jest śledzenie reakcji poszczególnych komórek podczas eksperymentu. Bodźce ATP otwierają receptor P2X7, zasadniczo wyrażany przez komórki glejowe.Jest to wzbogacona kultura neuronów. Dlatego jest tu niewiele komórek glejowych. To jest powód, dla którego tak niewiele komórek reaguje na bodźce ATP.Uzyskane wartości zostały przetworzone za pomocą oprogramowania Metafluor. Wyniki eksperymentu są wyrażane w tabeli programu Excel, gdzie każdy wiersz reprezentuje pojedynczą komórkę, a każdy wiersz punkt czasu. Za pomocą oprogramowania Excel można wykreślić zmiany wapnia w poszczególnych komórkach osobno lub wszystkich z nich na tym samym wykresie.Aby określić ilościowo ilość komórek reagujących na dowolny bodziec, ustal wartość graniczną na 30%zwiększając wyjściowy poziom wapnia. Tutaj używamy komórek siatkówki w hodowli od embrionalnych piskląt w 8 dniu, aby zbadać, w jaki sposób neurony i glej sygnalizują pod względem zmian wapnia, po otrzymaniu 50 mm bodźców chlorku potasu i 1 mm ATP. W każdym eksperymencie około 100 komórek było chętnie analizowanych.Rycina A przedstawia mieszaną kulturę zawierającą zarówno neurony, jak i glej, która była utrzymywana przez tydzień. Kiedy określimy ilościowo odpowiedzi, można zauważyć, że około połowa analizowanych komórek odpowiada na chlorek potasu, a druga połowa na ATP. Rysunek B odnosi się do kultury wzbogaconej o neurony.Był inkubowany tylko przez trzy dni, dlatego większość komórek glejowych jeszcze się nie zróżnicowała. W tym przypadku 89% komórek odpowiada na chlorek potasu, co wzmacnia występowanie neuronów. Rycina C przedstawia oczyszczoną kulturę glejową.Komórki te utrzymywano przez 10 dni ze zmianami pożywki co trzy dni. Po tym czasie większość neuronów obumiera, pozostawiając tylko glej. Rzeczywiście, ta kultura była aktywowana wyłącznie przez ATP.Metodologia ta jest szeroko stosowana ze względu na uniwersalne właściwości wapnia jako drugiego przekaźnika. Analizę fenotypową można wzbogacić, uzupełniając tę metodologię o immunochemię utrwalonych komórek po obrazowaniu wapnia. Protokół ten można również dostosować do innych mieszanych systemów komórkowych wykazujących ekspresję innych kanałów wapniowych.Ważną wskazówką jest znalezienie selektywnych odpowiedzi różnych typów komórek skorelowanych z ich ekspresją fenotypową.

visualizing-shifts-on-neuron-glia-circuit-with-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.

Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

Opisano metodę wprowadzania barwników wskaźnikowych wapnia do komórek strefy podkomorowej (SVZ) w celu rejestracji aktywności wapniowej. Potnatalna SVZ zawiera gęsto upakowane komórki, w tym komórki progenitorowe neuronów oraz neuroblasty. Zamiast ładowania metodą kąpielową, barwnik wstrzykiwano pod ciśnieniem bezpośrednio do tkanki, co pozwoliło na lepszą dyfuzję barwnika.

Przygotowanie ostrych skrawków strefy podkomorowej do obrazowania wapnia

W niniejszym protokole aktualizujemy opis ostatnich postępów w obrazowaniu sygnałów Ca2+ w neuronach znakowanych GFP w skrawkach tkanki mózgowej z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+.

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Źródło: Bancroft, E. A., et al. Kwantyfikacja spontanicznych strumieni ca2+{ i ich dalsze efekty w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy. J. Vis. Exp. (2020) {{TAG_ 46}}Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy. Wykorzystując wektor wirusowy do ekspresji wskaźnika wapnia, neurony są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym w celu śledzenia zmian intensywności fluorescencji podczas spontanicznej i...

Wizualizacja napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy

Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.

Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Protezy siatkówki mają zdolność generowania percepcji wzrokowej. Aby przyspieszyć rozwój nowych protez, potrzebne są metody ex vivo do testowania urządzeń przed implantacją. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki poddanych stymulacji elektrycznej.

Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach

Poznaj technikę obrazowania wapnia Fura-2 AM do monitorowania sygnałów wapniowych w żywych komórkach siatkówki kurczaka. Metoda pozwala rozróżnić odpowiedzi neuronów i komórek glejowych na stymulację chlorkiem potasu i ATP.

Wizualizacja zmian w obwodzie neuron-glej za pomocą techniki obrazowania wapnia

Przeglądaj więcej filmów