Wizualizacja zmian w obwodzie neuron-glej za pomocą techniki obrazowania wapnia

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie zmian stężenia wapnia cytozolowego w żywych komórkach w celu różnicowania odpowiedzi neuronalnych lub glejowych na podstawie bodźców chlorku potasu lub ATP. Wapń jest ważnym drugim przekaźnikiem zaangażowanym w kilka procesów komórkowych, w tym neuroprzekaźnictwo, plastyczność i apoptozę. Pojawienie się wysoce selektywnego fluorescencyjnego barwnika wapniowego, takiego jak Fura-2 AM, w połączeniu z rozwojem lepszych mikroskopów fluorescencyjnych i metod obliczeniowych, dostarczyło danych optycznych o wysokiej rozdzielczości o wysokim stopniu rozdzielczości przestrzennej i czasowej do obrazowania sygnalizacji wapniowej na żywych komórkach i organizmach.

Protokół ten można dostosować do wzbogaconych neuronów, oczyszczonych glejów lub kultur populacji mieszanej. Śledzi, które typy komórek reagowały na określone bodźce w oparciu o różnicową odpowiedź na chlorek potasu i ATP. Chlorek potasu zmienia potencjał błonowy komórki.

A to otwiera kanały wapniowe bramkowane napięciem, wyrażane głównie przez neurony. Z drugiej strony ATP aktywuje duży kanał częściowy P2X7, obecny głównie w komórkach glejowych. Łącząc bodźce chlorku potasu i ATP z innymi lekami, można zobaczyć, który przedział układu nerwowego na nie reaguje, na podstawie wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia.

Do tej procedury potrzebne będą narzędzia chirurgiczne lub pęseta. Używaj komory bezpieczeństwa biologicznego i stosuj najlepsze praktyki, aby uniknąć zanieczyszczenia. Aby rozpocząć hodowlę siatkówki kurczaka, ostrożnie otwórz zapłodnione jajo przy dnie, gdzie znajduje się komórka powietrzna.

Wyjąć zawartość na szalkę Petriego i przystąpić do dawstwa zarodków poprzez dekapitację za pomocą pęsety. Po wyjęciu głowy przenieś ją na czystą szalkę Petriego i dodaj do niej trochę roztworu wolnego od wapnia i magnezu. Następnie usuń oczy, uważając, aby ich nie uszkodzić.

Skierować oko na inną szalkę Petriego zawierającą roztwór CMF. Za pomocą pęsety zacznij preparować oko, zdejmując soczewkę. Następnie, zaczynając od otworu pozostawionego przez soczewkę, wykonaj trzy lub cztery podłużne nacięcia w oku.

Ostrożnie usunąć przezroczysty korpus szklisty. Upewnij się, że siatkówka nie jest z nim związana. Następnie delikatnie odłącz siatkówkę od nabłonka barwnikowego.

Usuń pozostałą tkankę nabłonkową. Gdy siatkówka będzie całkowicie czysta, pokrój ją na małe kawałki. Pobranie całej tkanki siatkówki za pomocą automatycznej pipety.

Krótko odwirować siatkówkę, aby usunąć cały CMF. Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny. I inkubować tkankę w temperaturze 37 C przez 10 minut.

Zatrzymaj reakcję trypsyny, dodając 1 ml pożywki zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej. Odwiruj siatkówkę, aby usunąć całą trypsynę. Umyj komórki dwa lub trzy razy pożywką zawierającą 10% FCS.

Następnie dodaj 2 ml pożywki na siatkówkę i delikatnie mechanicznie ją rozłącz. Rozcieńczyć komórki, aby móc je prawidłowo policzyć za pomocą hemocytometru. Użyj szkiełek nakrywkowych o średnicy 15 mm zabezpieczonych poli-L-lizyną i lamininą, aby poprawić przyczepność komórek.

Odpipetować 50 l rozcieńczonych komórek na każde szkiełko nakrywkowe. Inkubować komórki w temperaturze 37 C w atmosferze 5% CO2. I schłodź je, aby przymocować szkło.

Powinno to zająć około jednej do dwóch godzin. Dodać 1 ml pożywki i umieścić ją z powrotem w inkubatorze do dnia eksperymentu. W razie potrzeby zmieniaj połowę podłoża co dwa do trzech dni.

Rozpuścić 50 g fiolkę Fura-2 AM w 50 l DMSO. Roztwór Krebsa jest dobrym rozwiązaniem do przenoszenia komórek podczas eksperymentu, ponieważ nie zakłóca pomiaru fluorescencji. Przed rozpoczęciem podgrzej roztwór do 37 stopni.

Dodać Poloxamer 407. Dodaj Fura-2 AM i DMSO. Sonikuj go przez siedem minut w łaźni wodnej.

Przygotuj płytkę 6-dołkową, dodając roztwór Krebsa do trzech studzienek i działający roztwór Fura-2 do drugiej. Umyj szkiełko nakrywkowe zawierające komórki trzy razy przed dodaniem do Fura-2. Inkubować komórki w temperaturze 37 C i 5% atmosferze CO2 przez 30 minut w ciemnym inkubatorze.

Po inkubacji umyj go ponownie trzy razy. Przenieś go do innego odbiorcy zawierającego Krebsa i chroń go przed światłem. Możliwe jest ponowne wykorzystanie przygotowanego preparatu Fura-2 do inkubacji większej liczby szkiełek nakrywkowych z komórkami.

Dodaj silikon do wspornika szkiełka nakrywkowego i komory przed każdym uruchomieniem, aby uniknąć wycieku roztworu. Wyjmij szkiełko nakrywkowe z roztworu Krebsa i ostrożnie umyj dno wodą destylowaną, aby uniknąć krystalizacji soli na soczewce mikroskopu. Połóż szkiełko nakrywkowe na podporze, ostrożnie dociskając krawędzie.

Przymocuj wspornik szkiełka nakrywkowego i komorę do mikroskopu i rozpocznij perfuzję komórek roztworem Krebsa. Zaznacz odpowiednie komórki i wybierz dobre pole. Ręcznie określ obszary zainteresowania, wybierając ciała komórek na podstawie ich odrębnej morfologii.

Zmiany stężenia wapnia oceniano poprzez ilościowe określenie stosunku fluorescencji emitowanej przy 510 nm po naprzemiennym wzbudzeniu przy 340 i 380 nm. Po dodaniu chlorku potasu można zobaczyć wiele świecących komórek i wzrost odpowiedzi fluorescencyjnej na wykresie. Chlorek potasu otwiera bramkowane napięciem kanały wapniowe, obecne głównie w neuronach.

Każda pojedyncza linia na wykresie reprezentuje unikatowy obszar zainteresowania. W związku z tym możliwe jest śledzenie reakcji poszczególnych komórek podczas eksperymentu. Bodźce ATP otwierają receptor P2X7, zasadniczo wyrażany przez komórki glejowe.

Jest to wzbogacona kultura neuronów. Dlatego jest tu niewiele komórek glejowych. To jest powód, dla którego tak niewiele komórek reaguje na bodźce ATP.

Uzyskane wartości zostały przetworzone za pomocą oprogramowania Metafluor. Wyniki eksperymentu są wyrażane w tabeli programu Excel, gdzie każdy wiersz reprezentuje pojedynczą komórkę, a każdy wiersz punkt czasu. Za pomocą oprogramowania Excel można wykreślić zmiany wapnia w poszczególnych komórkach osobno lub wszystkich z nich na tym samym wykresie.

Aby określić ilościowo ilość komórek reagujących na dowolny bodziec, ustal wartość graniczną na 30%zwiększając wyjściowy poziom wapnia. Tutaj używamy komórek siatkówki w hodowli od embrionalnych piskląt w 8 dniu, aby zbadać, w jaki sposób neurony i glej sygnalizują pod względem zmian wapnia, po otrzymaniu 50 mm bodźców chlorku potasu i 1 mm ATP. W każdym eksperymencie około 100 komórek było chętnie analizowanych.

Rycina A przedstawia mieszaną kulturę zawierającą zarówno neurony, jak i glej, która była utrzymywana przez tydzień. Kiedy określimy ilościowo odpowiedzi, można zauważyć, że około połowa analizowanych komórek odpowiada na chlorek potasu, a druga połowa na ATP. Rysunek B odnosi się do kultury wzbogaconej o neurony.

Był inkubowany tylko przez trzy dni, dlatego większość komórek glejowych jeszcze się nie zróżnicowała. W tym przypadku 89% komórek odpowiada na chlorek potasu, co wzmacnia występowanie neuronów. Rycina C przedstawia oczyszczoną kulturę glejową.

Komórki te utrzymywano przez 10 dni ze zmianami pożywki co trzy dni. Po tym czasie większość neuronów obumiera, pozostawiając tylko glej. Rzeczywiście, ta kultura była aktywowana wyłącznie przez ATP.

Metodologia ta jest szeroko stosowana ze względu na uniwersalne właściwości wapnia jako drugiego przekaźnika. Analizę fenotypową można wzbogacić, uzupełniając tę metodologię o immunochemię utrwalonych komórek po obrazowaniu wapnia. Protokół ten można również dostosować do innych mieszanych systemów komórkowych wykazujących ekspresję innych kanałów wapniowych.

Ważną wskazówką jest znalezienie selektywnych odpowiedzi różnych typów komórek skorelowanych z ich ekspresją fenotypową.