Dostarczanie leków na bazie pompy osmotycznej do badań remielinizacji in vivo nad ośrodkowym układem nerwowym

Demielinizacja ma miejsce w wielu chorobach ośrodkowego układu nerwowego. Niezawodna technika dostarczania leków in vivo jest niezbędna do remielinizacji testów leków. Protokół ten opisuje metodę opartą na pompie osmotycznej, która umożliwia długotrwałe dostarczanie leku bezpośrednio do miąższu mózgu i poprawia biodostępność leku, z szerokim zastosowaniem w badaniach nad remielinizacją.

Pompa osmotyczna ma ogromną wartość dla badań nad regeneracją mieliny, szczególnie w przypadku leków o krótkim okresie półtrwania, słabej przepuszczalności bariery krew-mózg i różnych obwodowych skutkach ubocznych. Pompa osmotyczna może ominąć barierę krew-mózg i dostarczać leki bezpośrednio do ciała modzelowatego, co skutecznie poprawia biodostępność leków, szczególnie w przypadku niektórych leków o krótkim okresie półtrwania. Na początek zabezpiecz głowę znieczulonej myszy w aparacie stereotaktycznym za pomocą listwy zębatej i nauszników.

Przykryj ciało zwierzęcia z wyjątkiem pola operacyjnego. Za pomocą skalpela wykonaj centymetrowe nacięcie pośrodkowe skóry od podstawy szyi do między oczami, aby odsłonić czaszkę. Za pomocą bawełnianego wacika zawierającego 30% nadtlenku wodoru delikatnie przetrzyj powierzchnię czaszki, aby uwidocznić struktury czaszki.

Dostosuj wysokość listwy zębatej i listwy usznej, aby umieścić punkt lambda i punkt bregma na tej samej wysokości. Delikatnie umieść końcówkę igły strzykawkowej o pojemności 10 mikrolitrów i rozmiarze 33 w punkcie bregma i zresetuj współrzędne X, Y i Z do zera. Przesunąć strzykawkę w miejsce wstrzyknięcia.

Powoli wywiercić mały otwór w czaszce w miejscu wstrzyknięcia, nie penetrując opony twardej, za pomocą igły strzykawkowej o rozmiarze 26 i 0,45 milimetra. Powoli włóż mikrolitrową igłę strzykawki do tkanki mózgowej przez otwór, aż do osiągnięcia określonej głębokości. Wstrzyknąć 1,5 mikrolitra 1% lizolecytyny z prędkością 0,5 mikrolitra na minutę.

Odczekaj pięć minut przed wyciągnięciem strzykawki i zszyj skórę szwami chirurgicznymi 5-0. Umieść mysz, która przeszła operację, samą w klatce i codziennie monitoruj mysz po operacji. Przymocuj trzy przekładki do regulacji głębokości do igły kaniuli infuzyjnej mózgu za pomocą kleju tkankowego, aby uzyskać głębokość wstrzyknięcia 1,5 milimetra, która jest zbliżona do modzelowatego.

Napełnij pompę osmotyczną, podłączając igłę strzykawki z opakowaniem pompy do jednomililitrowej strzykawki i odessać lek. Trzymaj pompę w pozycji pionowej. Włożyć strzykawkę do otworu w górnej części pompy i powoli wstrzykiwać lek, nie tworząc pęcherzyków powietrza.

Powoli wyciągnąć strzykawkę, gdy płyn wypływa z otworu. Za pomocą nożyczek lub szczypiec zdejmij biały kołnierz z regulatora przepływu. Włóż regulator przepływu do pompy.

Aby ustalić, czy w pompie osmotycznej znajdują się pęcherzyki, należy zważyć pompę osmotyczną oddzielnie, przed i po napełnieniu. Przytnij cewnik do wymaganej długości w zależności od wielkości zwierzęcia. Podłącz cewnik do kaniuli infuzyjnej mózgu.

Napełnij cewnik lekami za pomocą strzykawki bez wprowadzania powietrza. Podłącz cewnik do moderatora przepływu tak, aby zakrywał około czterech milimetrów odsłoniętego moderatora przepływu. Zanurz napełnione pompy w sterylnym 0,9% soli fizjologicznej lub PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej cztery do sześciu godzin.

Wolę przedłużyć z dnia na dzień po wdrożeniu. Ponownie zabezpiecz myszy na aparacie stereotaktycznym. Otwórz wcześniej zszyte nacięcie chirurgiczne i rozszerz nacięcie aż do łopatek.

Oddziel skórę od podskórnej tkanki łącznej przy łopatce, używając szczypiec hemostatycznych lub pęsety, aby otworzyć ubytek i umieścić pompę osmotyczną w jamie. Za pomocą bawełnianego wacika delikatnie przetrzyj i odsłoń otwór w szpilce na powierzchni czaszki powstały podczas ustalania modelu demielinizacji. Włóż kaniulę do infuzji mózgu przez otwór prostopadle i przymocuj ją do czaszki za pomocą kleju tkankowego.

Zdejmij zdejmowaną zakładkę nad kaniulą infuzyjną mózgu za pomocą nożyczek. Zszyj nacięcie lub przymocuj je klejem tkankowym. Po operacji umieść zwierzę samo w klatce.

Po wykonaniu implementacji barwienie DAPI ujawniło, że otwór w tkance mózgowej leży tuż nad istotą białą, co wskazuje na udane wdrożenie kaniuli infuzyjnej mózgu pompy osmotycznej. Eksperyment hybrydyzacji in situ przeprowadzono z dojrzałym markerem oligodendrocytów, sondą MAG użyto do znakowania nowo zróżnicowanych oligodendrocytów. Wyniki wykazały, że leczenie UM206 dało więcej komórek MAG dodatnich w regionie demielinizowanym niż w grupie kontrolnej.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa regionu zdemielinizowanego wykazała, że liczba zmielinizowanych aksonów była zwiększona w grupie leczonej UM206 w porównaniu z grupą kontrolną, co sugeruje, że UM206 indukował wyższy poziom remielinizacji. Przygotowując pompę osmotyczną należy uważać, aby nie wprowadzić do systemu żadnych pęcherzyków.