Name: Kwantyfikacja subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika z wykorzystaniem ferrocyjanku potasu zapewnia bezprzeciwcielowe barwienie i niezależną analizę stereologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Szwedzki Komitet Olimpijski.

Obecny protokół z wykorzystaniem próbek mięśni szkieletowych pobranych z ludzkiej biopsji został zatwierdzony przez Regionalne Komisje ds. Etyki Badań Zdrowotnych dla Południowej Danii (S-20170198). Biopsje mięśni uzyskano przez nacięcie w skórze mięśnia obszernego bocznego za pomocą igły Bergström z odsysaniem po podaniu podskórnym znieczulenia miejscowego (1-3 ml lidokainy 2% na nacięcie). Jeśli wykorzystano izolowane całe mięśnie szczura, zwierzęta zostały uśmiercone przez zwichnięcie szyjki macicy przed uzyskaniem biopsji mięśni, zgodnie z wytycznymi komisji etycznej ds. zwierząt w Szpitalu Uniwersyteckim w Odense w Danii.
1. Fiksacja pierwotna, fiksacja po utrwaleniu, osadzanie, dzielenie na sekcje i kontrastowanie
<ol>
	<li>Przygotować 1,6 ml pierwotnego roztworu utrwalającego (2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,3)) w probówce do mikrowirowania o pojemności 2 ml. Przechowywać w temperaturze 5 °C maksymalnie 14 dni.</li>
	<li>Z biopsji mięśnia lub całego mięśnia wyizoluj małą próbkę, która ma maksymalną średnicę 1 mm w dowolnym kierunku i jest nieco dłuższa w kierunku włókien podłużnych niż w przekroju poprzecznym (w celach orientacyjnych).</li>
	<li>Umieścić próbkę w probówce zawierającej zimny roztwór do utrwalania pierwotnego. Przechowywać w temperaturze 5 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Przemyć próbkę czterokrotnie (15 minut między każdym myciem) w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,3). Za pomocą pipet transferowych usunąć zużyty bufor z probówki, pozostawiając próbkę nietkniętą, a następnie dodać świeży bufor. 
	UWAGA: Po ostatnim myciu próbka może być przechowywana w 0,1 M buforze kakodylanu sodu w temperaturze 5 °C przez kilka miesięcy11. W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Postfix z 1% tetratlenkiem osmu (OsO4) i 1,5% żelazocyjankiem potasu (K4Fe(CN)6) w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,3) przez 120 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Zastosowanie 1,5% żelazocyjanku potasu (K4Fe(CN)6) jest niezbędne dla uzyskania optymalnego kontrastu cząsteczek glikogenu11,12,13.</li>
	<li>Spłucz dwukrotnie w podwójnie destylowanej wodzie o temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Odwodnić przez zanurzenie w stopniowanej serii alkoholu (etanolu) w temperaturze pokojowej przy użyciu następujących stężeń: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) i 100% (10 min). 
	UWAGA: Na każdym etapie próbka jest zanurzana w etanolu, który jest następnie usuwany tylko częściowo, aby uniknąć wysuszenia próbki. Na koniec resztki etanolu są wyrzucane.</li>
	<li>Naciekać stopniowanymi mieszaninami tlenku propylenu i żywicy eposydowej w temperaturze pokojowej przy użyciu następujących proporcji objętościowych (tlenek propylenu/żywica eposydowa): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (przez noc). Następnego dnia zanurzyć próbki w 100% świeżej żywicy epossydowej w formach i polimeryzować w temperaturze 60 °C przez 48 godzin 
	UWAGA: Ta stopniowana metoda jest zgodna z poprzednimi protokołami11,12. W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Wytnij ultracienkie (60-70 nm) odcinki włókien zorientowanych wzdłużnie i zbierz je na jednootworowych siatkach miedzianych w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Zamontuj blok próbki na uchwycie ultramikrotomu.</li>
		<li>Przytnij blok na powierzchni żyletką, aby dotrzeć do poziomu tkanki.</li>
		<li>Zamontuj nóż diamentowy (ultracut 45) przed próbką i wyrównaj powierzchnię próbki równolegle do noża.</li>
		<li>Za pomocą noża diamentowego należy wykonać półcienki (1 μm) wycinek, aby sprawdzić orientację próbki. Wybarwić półcienki wycinek błękitem toluidynowym do obserwacji za pomocą mikroskopii świetlnej.</li>
		<li>Przytnij blok jeszcze bardziej, aby zmniejszyć obszar zainteresowania w celu uzyskania odpowiednich ultracienkich sekcji.</li>
		<li>Wycinaj ultracienkie (60-70 nm) odcinki za pomocą drugiego noża diamentowego (ultracut 45).</li>
		<li>Zbierz 1-2 sekcje na miedzianych siatkach z jednym otworem za pomocą Perfect Loop. 
		UWAGA: Siatka miedziana z jednym otworem ma pojedynczy otwór pośrodku z membraną nośną Formvar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skontrastuj skrawki octanem uranylu i cytrynianem ołowiu, zanurzając powyższe siatki w roztworze octanu uranylu (0,5% w wodzie podwójnie destylowanej) na 20 minut, a następnie w roztworze cytrynianu ołowiu (1% w wodzie podwójnie destylowanej) na 15 minut. Umyj kratki w wodzie podwójnie destylowanej między dwoma plamami i po nich. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
2. Obrazowanie
<ol>
	<li>Włącz transmisyjny mikroskop elektronowy (pracujący przy napięciu przyspieszającym 80 kV), komputer i oprogramowanie do rejestracji obrazu. Rejestruj obrazy cyfrowe za pomocą cyfrowej kamery CCD 2 k x 2 k z powolnym skanowaniem i powiązanego oprogramowania do obrazowania.</li>
	<li>Włóż siatkę z wieloma sekcjami do stolika mikroskopu.</li>
	<li>Przesiewaj siatkę początkowo w małym powiększeniu (np. x100), aby określić jakość przekrojów (tj. otworów w membranie nośnej, gruzu itp.) i wybrać sekcje najlepszej jakości. Przy małym powiększeniu określ kierunek włókien mięśniowych.</li>
	<li>Następnie zwiększ powiększenie z wiązką wyśrodkowaną na włóknie obwodowym w przekroju. Ustaw ostrość obrazu przy powiększeniu powyżej 30 k, aby zapewnić wystarczającą ilość drobnych szczegółów na obrazie, kierując się szybką transformacją Fouriera w czasie rzeczywistym, jeśli jest dostępna. Na koniec zapisz obrazy z czasem naświetlania 1 s przy żądanym powiększeniu.</li>
	<li>Uzyskaj łącznie 24 obrazy losowo wybranego włókna, tj. 12 obrazów przestrzeni miofibrylarnej i 12 obrazów przestrzeni podsarkolemmalnej, w powiększeniu od 10 k do 40 k. Upewnij się, że obrazy są rozmieszczone na całej długości i szerokości włókna w losowej, ale systematycznej kolejności, aby uzyskać bezstronne wyniki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
UWAGA: Optymalne powiększenie zależy od dostępnej rozdzielczości kamery i rozmiaru mikrofotografii. Celem jest osiągnięcie ostatecznej rozdzielczości, w której średnice cząstek glikogenu mogą być mierzone w krokach co 1 nm i obejmują całkowitą powierzchnię obszaru miofibrylarnego wynoszącą co najmniej 70μm2 oraz całkowitą długość włókna wynoszącą co najmniej 25 μm rozłożoną na 12 obrazów przestrzeni miofibrylarnej i 12 obrazów przestrzeni subsarkolemmalnej na włókno, odpowiednio. 24 obrazy na włókno najprawdopodobniej dadzą precyzję (współczynnik błędu) objętościowej zawartości różnych pul glikogenu od 0,1 do 0,2 w poszczególnych włóknach z mięśni szkieletowych ludzi, szczurów i myszy20,21,24 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Powtarzaj kroki 2.4 i 2.5, aż do zobrazowania łącznie 6-10 włókien. W razie potrzeby wytnij dodatkowe odcinki (oddalone od siebie o co najmniej 150 μm, aby uniknąć nakładania się już zobrazowanych włókien) i powtórz kroki 1,9-2,5.</li>
</ol>
3. Analizy obrazów
<ol>
	<li>Zaimportuj obrazy do ImageJ, klikając Plik > Otwórz.</li>
	<li>Ustaw skalę globalną, aby dopasować ją do oryginalnego rozmiaru obrazu, klikając Analizuj > Ustaw skalę.</li>
	<li>Powiększ o 100%, klikając Obraz > Powiększ ></li>.
	<li>Zmierz grubość jednego dysku Z na obraz przestrzeni miofibrylarnej (12 na włókno) za pomocą narzędzia Linia prosta z menu Narzędzia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D). Oblicz średnią grubość dysku Z każdego z 6-10 włókien.</li>
	<li>Zdefiniuj 2-3 włókna z najgrubszym średnim dyskiem Z jako włókna typu 1 i 2-3 włókna z najcieńszym średnim dyskiem Z jako włókna typu 2. Zignoruj pośrednie 2-4 włókna do dalszych analiz (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). 
	UWAGA: Poniższe kroki powtarza się dla każdego z 4-6 włókien z próbki. Frakcje objętościowe glikogenu są szacowane przez zliczanie punktów, jak opisano w innym miejscu25,26. Wielkość siatek dobierana jest w taki sposób, aby uzyskać zadowalająco wysoką precyzję oszacowań. Często uzyskuje się to poprzez osiągnięcie 250 trafień, co następnie dyktuje całkowitą liczbę potrzebnych punktów, a co za tym idzie, obszar na punkt.</li>
	<li>Użyj narzędzia Linia segmentowa, aby zmierzyć długość najbardziej zewnętrznej miofibryli widocznej tuż pod obszarem podsarkolemmalnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
	UWAGA: Długość ta służy do wyrażenia glikogenu podsarkolemmalnego na powierzchnię (tj. długość najbardziej zewnętrznej miofibrylu pomnożona przez grubość przekroju (60 nm); patrz krok 4.5). W związku z tym w analizie uwzględniany jest tylko obszar podsarkolemmalny, który jest reprezentowany przez tę długość.</li>
	<li>Wstaw siatkę, klikając Analyze > Tools > Grid i ustaw Obszar na punkt na 32 400 nm2. Policz liczbę trafień w dostępnej długości na 12 obrazach podsarkolemmalnych, gdzie krzyż uderza w glikogen podsarkolemmalny (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Trafienie definiuje się jako cząsteczkę glikogenu znajdującą się w prawym górnym rogu krzyża.</li>
	<li>Wstaw siatkę, klikając Analizuj > Narzędzia > Siatka i ustaw Obszar na punkt na 160 000 nm2. Policz liczbę trafień na 12 obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w przestrzeń wewnątrzmiofibrylarną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Wstaw siatkę, klikając Analizuj > Narzędzia > siatkę i ustaw Obszar na punkt na 3,600 nm2. Policz liczbę trafień na 12 obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w glikogen wewnątrzmiofibrylarny (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Wstaw siatkę, klikając Analyze > Tools > Grid i ustaw Obszar na punkt na 32 400 nm2. Policz liczbę trafień na 12 obrazach miofibrylarnych, gdzie krzyż uderza w glikogen międzymiofibrylarny (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Korzystając z narzędzia Linia prosta, zmierz średnicę pięciu losowo wybranych cząstek glikogenu z każdej puli dla każdego z 12 obrazów, aby uzyskać średnio 60 cząstek na pulę na włókno. 
	UWAGA: Średnia 60 cząstek w dużej mierze pokrywa zmienność w obrębie włókna (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F).</li>
</ol>
4. Obliczenia
<ol>
	<li>Oblicz ułamek powierzchni widocznej (A, A) przestrzeni wewnątrzmiofibrylarnej na przestrzeń miofibrylarną jako sumę wszystkich trafień podzieloną przez sumę wszystkich punktów z 12 obrazów (z kroku 3.8).</li>
	<li>Oblicz ułamek powierzchni pozornej glikogenu wewnątrzmiofibrylarnego na obszar miofibrylarny, glikogenu międzymiofibrylarnego na obszar miofibrylarny i glikogenu submiofibrylarnego na obszar obrazu jako sumę wszystkich trafień podzieloną przez sumę wszystkich punktów z 12 obrazów (z kroków 3.7, 3.9 i 3.10).</li>
	<li>Obliczyć ułamek objętościowy (VV) glikogenu wewnątrzmiofibrylarnego, międzymiofibrylarnego i podsarkolemmalnego, odpowiednio, jako ułamek powierzchni pozornej (AA) minus iloczyn gęstości powierzchniowej (SV) z grubością przekroju (t), gdzie gęstość powierzchniowa to gęstość liczbowa cząstek pomnożona przez średnią powierzchnię cząstek: 
	Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t 
	gdzie 
	Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H)) · (π · H2) 
	t = 0,06 μm 
	H = średnia średnica cząstek (μm) 
	UWAGA: Ułamek objętościowy jest mniejszy niż ułamek powierzchni widocznej ze względu na udział czapek od cząstek, których środek znajduje się poza slice25.</li>
	<li>Aby wyrazić glikogen wewnątrzmiofibrylarny na przestrzeń wewnątrzmiofibrylarną, podziel frakcję powierzchniową glikogenu wewnątrzmiofibrylarnego (krok 4.2) przez frakcję powierzchniową przestrzeni wewnątrzmiofibrylarnej (krok 4.1). Glikogen międzymiofibrylarny jest wyrażany na przestrzeń miofibrylarną, jak obliczono w poprzednim kroku (krok 4.3).</li>
	<li>Aby wyrazić glikogen podsarkolemmalny na powierzchnię włókna (VS) (najbardziej zewnętrzna miofibryl), należy przeliczyć udział objętościowy glikogenu na ilość bezwzględną, mnożąc przez objętość obrazu (iloczyn powierzchni i grubości przekroju) i dzieląc przez iloczyn średniej dostępnej długości (z kroku 3.6) przez grubość przekroju (t).</li>
	<li>Oszacuj całkowitą objętościową zawartość glikogenu, korzystając z wartości z kroków 4.1, 4.4 i 4.5, w następujący sposób: 
	Glikogen miofibrylarny = glikogen międzymiofibrylarny + (glikogen wewnątrzmiofibrylarny · ułamek powierzchni przestrzeni wewnątrzmiofibrylarnej) 
	Przyjmując średni promień włókna 40 μm27, stosunek objętości do powierzchni wynosi 20:1, więc całkowity glikogen wynosi: 
	Glikogen całkowity (VV) = glikogen miofibrylarny + (glikogen subsarkolemmalny (VS) / 20) 
	UWAGA: Stosunek objętości do powierzchni wynoszący 20:1 może się różnić w zależności od włókna w zależności od rzeczywistego rozmiaru włókna i rozmiaru obszaru podsarkolemmalnego. Nie jest to brane pod uwagę w niniejszym protokole.</li>
	<li>Na tej podstawie względny wkład każdej puli oblicza się jako frakcje całkowitego glikogenu: 
	Glikogen międzymiofibrylarny / Glikogen całkowity = Glikogen międzymiofibrylarny / Glikogen całkowity 
	Glikogen wewnątrzmiofibrylarny / Glikogen całkowity = (glikogen wewnątrzmiofibrylarny · ułamek powierzchni przestrzeni wewnątrzmiofibrylarnej) / Glikogen całkowity 
	Glikogen podsarkolemmalny / Glikogen całkowity = Glikogen podsarkolemmalny / 20 / Glikogen całkowity</li>
	<li>Dla każdej puli glikogenu oblicz współczynnik błędu (CE), który wyraża niepewność oszacowania glikogenu na poziomie włókien, na podstawie liczby obrazów (n), całkowitej liczby krzyżówek na każdym obrazie (x) oraz liczby krzyżówek uderzających w glikogen w odpowiedniej puli na każdym obrazie (y) w następujący sposób28: 
	CE = n-1 · ∑x2 · (∑x)-2 + ∑y2 · (∑y)-2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑y-1</li>
</ol>

<ol><li>Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+life+of+the+glycogen+granule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The dynamic life of the glycogen granule.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).</li>
<li>Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+glycogen+depletion+pattern+in+human+muscle+fibres+after+exercise+of+varying+intensity+and+at+varying+pedalling+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates.</a> Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).</li>
<li>James, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+both+aerobic+glycolysis+and+Na%2B-K%2B-ATPase+activity+in+skeletal+muscle+by+epinephrine+or+amylin%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Endocrinology+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).</li>
<li>Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+glycogenolysis+prolongs+action+potential+repriming+period+and+impairs+muscle+function+in+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle.</a> Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).</li>
<li>Green, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+important+is+endogenous+muscle+glycogen+to+fatigue+in+prolonged+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).</li>
<li>Fitts, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of muscle fatigue.</a> Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).</li>
<li>Wanson, J. C., Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+glycogen+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism.</a> Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).</li>
<li>Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+the+human+brachial+biceps+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Fiber types in the human brachial biceps muscle.</a> Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).</li>
<li>Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+glycogen.+Electron+microscopic+study+of+the+negative+stains+of+particulate+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li>
<li>Thiery, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+polysaccharides+on+thin+sections+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).</li>
<li>De Bruijn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen%2C+its+chemistry+and+morphologic+appearance+in+the+electron+microscope.+I.+A+modified+OsO4+fixative+which+selectively+contrasts+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructural+Research%22%5BJournal%5D)">Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen.</a> Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).</li>
<li>Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+accumulation+in+polymorphonuclear+leukocytes%2C+and+other+intracellular+alterations+that+occur+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation.</a> The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).</li>
<li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes+-+the+organelles+of+glycogen+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li>
<li>Gadisseux, J. F., Evrard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-neuronal+relationship+in+the+developing+central+nervous+system.+A+histochemical-electron+microscope+study+of+radial+glial+cell+particulate+glycogen+in+normal+and+reeler+mice+and+the+human+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus.</a> Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).</li>
<li>Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+periodic+acid-thiosemicarbazide-silver+proteinate+staining+for+ultrastructural+assessment+of+muscle+glycogen+utilization+during+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise.</a> Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).</li>
<li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+subcellular+glycogen+in+resting+human+muscle%3A+granule+size%2C+number%2C+and+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location.</a> Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).</li>
<li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+human+muscle+glycogen+granules+size+and+number+in+subcellular+locations+during+recovery+from+prolonged+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise.</a> Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).</li>
<li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Glycogenolysis+Modulates+Histone+Acetylation+in+Human+Non-Small+Cell+Lung+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).</li>
<li>Jensen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+subcellular+muscle+glycogen+utilisation+during+exercise+impacts+endurance+capacity+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men.</a> Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).</li>
<li>Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+effects+of+subcellular+glycogen+localization+on+tetanic+relaxation+time+and+endurance+in+mechanically+skinned+rat+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).</li>
<li>Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+glycogen+and+decreased+tetanic+Ca2%2B+in+fatigued+single+intact+mouse+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).</li>
<li>Mead, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+constraints+in+synchronous+muscle+limit+superfast+motor+control+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates.</a> eLife. 6, 29425(2017).</li>
<li>Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+subcellular+glycogen+distribution+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+handling%3A+effects+of+ischaemia%2C+reperfusion+and+ischaemic+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cellular+Motility%22%5BJournal%5D)">Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning.</a> Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).</li>
<li>Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+glycogen+utilization+in+exhaustive+exercise%3A+role+of+subcellular+localization+and+fibre+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type.</a> Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).</li>
<li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeibel%2C+ER+%22Stereological+Methods.+Vol.+2%3A+Theoretical+Foundations%22">Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations</a>. , Academic Press. London. (1980).</li>
<li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+new%2C+simple+and+efficient+stereological+methods+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).</li>
<li>Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaltin%2C+B+%22Handbook+of+Physiology.+Skeletal+Muscle%22">Handbook of Physiology. Skeletal Muscle</a>. 10, American Physiological Society. Bethesda, MD. 555-632 (1983).</li>
<li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+CV+%22Unbiased+Stereology.+Three-dimensional+Measurement+in+Microscopy%22">Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy</a>. , Bios Scientific Publishers. Oxford. (2005).</li>
<li>Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization-dependent+decrements+in+skeletal+muscle+glycogen+and+mitochondria+content+following+short-term+disuse+in+young+and+old+men%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Endocrinology+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).</li>
<li>Hokken, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization-+and+fibre+type-dependent+utilization+of+muscle+glycogen+during+heavy+resistance+exercise+in+elite+power+and+Olympic+weightlifters%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters.</a> Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561(2021).</li>
<li>Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+glycogen+storage+of+a+subcellular+hot+spot+in+human+skeletal+muscle+during+early+recovery+from+eccentric+contractions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions.</a> PLoS One. 10 (5), 0127808(2015).</li>
<li>Sjöström, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analyses+of+human+muscle+fiber+types%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Morphometric analyses of human muscle fiber types.</a> Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).</li>
<li>Gejl, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+depletion+of+glycogen+with+supramaximal+exercise+in+human+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).</li>
<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Krytycznym etapem metody jest zastosowanie zredukowanego osmu przez żelazocyjanek potasu po utrwaleniu. Selektywność tego zmodyfikowanego utrwalacza do wykrywania glikogenu nie może być w pełni wyjaśniona przez chemię, ale obejmuje również wyniki eksperymentalne wykazujące brak wykrycia takich cząstek w tkankach, o których wiadomo, że są wolne od glikogenu lub w przestrzeni zewnątrzkomórkowej11.
Parametrami krytycznymi są precyzja szacunków i zmienność światłowoda. Post...

Cząsteczki glikogenu składają się z rozgałęzionych polimerów glukozy i różnych powiązanych białek1 i stanowią ważne paliwo podczas wysokiego zapotrzebowania metabolicznego2. Chociaż nie są powszechnie rozpoznawane, cząsteczki glikogenu stanowią również paliwo lokalne, w którym niektóre procesy subkomórkowe preferencyjnie wykorzystują glikogen pomimo dostępności innych i bardziej długotrwałych paliw, takich jak glukoza w osoczu i kwasy tłuszczowe3,4.
Znaczenie przechowywania glikogenu jako subkomórkowego paliwa zlokalizowanego zostało omówione w kilku recenzjach5,6 głównie na podstawie jednych z najwcześniejszych dokumentów subkomórkowego rozkładu glikogenu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)7,8. W pierwszych badaniach stosowano różne protokoły w celu zwiększenia kontrastu glikogenu z technik barwienia histochemicznego do barwienia ujemnego i dodatniego9,10. Ważnym osiągnięciem metodologicznym był udoskonalony protokół po utrwaleniu z osmem o obniżonej zawartości żelazocyjanku potasu w klasie <sup="xref">11,12,13,14, co znacznie poprawiło kontrast cząsteczek glikogenu. Ten udoskonalony protokół nie został wykorzystany w niektórych pionierskich pracach nad wyczerpaniem glikogenu wywołanym wysiłkiem fizycznym15, ale został ponownie wprowadzony przez Grahama i współpracowników16,17.
Na podstawie dwuwymiarowych obrazów, subkomórkowy rozkład glikogenu jest najczęściej opisywany jako cząsteczki glikogenu znajdujące się w trzech pulach: subsarcolemmal (tuż pod błoną powierzchniową), międzymiofibrylarny (pomiędzy miofibrylami) lub intramiofibrylarny (wewnątrz miofibryli). Jednak cząsteczki glikogenu mogą być również opisane jako związane z, na przykład, retikulum sarkoplazmatycznym 7 lub nuclei18. Oprócz dystrybucji subkomórkowej, zaletą zawartości glikogenu szacowanej przez TEM jest również to, że kwantyfikacja może być prowadzona na poziomie pojedynczego włókna. Pozwala to na badanie zmienności między włóknami i analizy korelacyjne z typami włókien i składnikami komórkowymi, takimi jak mitochondria i kropelki lipidów.
Tutaj opisany jest protokół dla szacowanej przez TEM objętościowej objętości trzech powszechnych subkomórkowych pul glikogenu (subsarkolemmalnej, międzymiofibrylarnej i wewnątrzmiofibrylarnej) we włóknach mięśni szkieletowych. Metoda została zastosowana do mięśni szkieletowych ludzi19, rats20 i mice21; a także ptaki i ryby22; i kardiomiocyty od szczurów<klasa sup="xref">23.

<table><tbody><tr><td>Tlenek 1,2-propylenu</td><td>Merck</td><td>75-56-9</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do osadzania żywicy 812</td><td>Taab</td><td>T031</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego 25%</td><td>Merck</td><td>1.04239.0250</td><td></td></tr><tr><td>POZYCJA</td><td>Olympus</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>Leica EM AC20</td><td>Leica</td><td></td><td>Automatyczny system kontrastowy</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy OSIS Veleta</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu 4% roztwór</td><td>Polysciences</td><td>0972A</td><td></td></tr><tr><td>Philips CM 100 Transmission EM</td><td>Philips</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trójwodzian heksacyjanożelazianu (II) potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455989-245G</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kakodylatowy sodu 0,2 M ph 7,4</td><td>Ampliqon.com</td><td>AMPQ40989.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-mikrotom Leica UC7</td><td>Leica</td> Ultrostain cytrynian ołowiu 3%, stabilizowany roztwór Dihydrat octanu uranylu Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>16707235</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Polysciences</td><td>6159-44-0</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej można uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości stałych próbek zawierających pojedyncze włókna mięśniowe. Umożliwia to ilościowe określenie aspektów ultrastrukturalnych, takich jak frakcje objętościowe, stosunek powierzchni do objętości, morfometria i miejsca kontaktu fizycznego różnych struktur subkomórkowych. W latach siedemdziesiątych XX wieku opracowano protokół zwiększonego barwienia glikogenu w komórkach, który utorował drogę do szeregu badań nad subkomórkową lokalizacją glikogenu i wielkością cząstek glikogenu przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Podczas gdy większość analiz interpretuje glikogen tak, jakby był on jednorodnie rozmieszczony we włóknach mięśniowych, podając tylko jedną wartość (np. średnie stężenie), transmisyjna mikroskopia elektronowa ujawniła, że glikogen jest przechowywany jako dyskretne cząstki glikogenu znajdujące się w odrębnych przedziałach subkomórkowych. W tym miejscu opisano protokół krok po kroku od pobrania tkanki do ilościowego określenia frakcji objętościowej i średnicy cząstek glikogenu w odrębnych subkomórkowych przedziałach poszczególnych włókien mięśni szkieletowych. Uwzględniono rozważania na temat tego, jak 1) pobierać i barwić próbki tkanek, 2) przeprowadzać analizy obrazu i obsługę danych, 3) oceniać precyzję szacunków, 4) rozróżniać typy włókien mięśniowych oraz 5) pułapki i ograniczenia metodologiczne.

Stosując niniejszy protokół, cząsteczki glikogenu wykazują czarny kolor i są wyraźnie widoczne (Rysunek 1 oraz Rysunek 2). Normy zawartości glikogenu przedstawiono na Rysunku 3. Dane te opierają się na analizie łącznie 362 włókien pobranych od 41 zdrowych młodych mężczyzn w ramach różnych wcześniejszych badań19,24,29,<sup class="...

Zmodyfikowana procedura po utrwaleniu zwiększa kontrast cząsteczek glikogenu w tkance. W tym artykule przedstawiono protokół krok po kroku opisujący, jak obchodzić się z tkanką, przeprowadzać obrazowanie i stosować metody stereologiczne w celu uzyskania bezstronnych i ilościowych danych na temat specyficznej dla typu włókien subkomórkowej dystrybucji glikogenu w mięśniach szkieletowych.

Kwantyfikacja subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Pomiar zawartości glikogenu w pojedynczych komórkach i organizacjach subkomórkowych jest ważny, ponieważ w większości typów komórek pojedyncze komórki inaczej przystosowują się do zmieniających się warunków fizjologicznych i chorób. Tak więc główną zaletą tej techniki jest bardzo wysoka rozdzielczość w transmisyjnym mikroskopie elektronowym. Zwiększa to możliwość posiadania zlokalizowanych struktur subkomórkowych, a także w tej zawartości w tej technice ważne jest, aby barwienie glikogenem było wolne od przeciwciał.Nie mamy więc żadnych konkretów, o które musimy się martwić. Aby uzyskać lepszy kontrast z glikogenem, wystarczy użyć żelazocyjanku potasu 1,5% zamiast żelazocyjanku potasu. Przygotować 1,6 mililitra pierwotnego roztworu utrwalającego, dodając 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu w dwumililitrowej probówce do mikrowirowania.Przechowuj go w temperaturze pięciu stopni Celsjusza maksymalnie przez 14 dni. Odizolować małą próbkę z biopsji mięśnia lub całego mięśnia, który ma maksymalną średnicę jednego milimetra w dowolnym kierunku i jest dłuższy wzdłużnie niż w przekroju poprzecznym. Umieścić próbkę w probówce zawierającej zimny roztwór do utrwalania pierwotnego.Przechowuj go w temperaturze pięciu stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie przemyć próbkę czterokrotnie w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu. Za pomocą pipet transferowych usunąć zużyty bufor z probówki, pozostawiając próbkę nietkniętą, a następnie dodać świeży bufor.Po utrwaleniu próbki 1% tetratlenkiem osmu i 1,5% żelazocyjankiem potasu w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu przez 120 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wypłucz próbkę dwukrotnie w podwójnie destylowanej wodzie o temperaturze pokojowej. Odwodnić przez zanurzenie w stopniowanej serii etanolu w temperaturze pokojowej.Naciekać próbkę mieszaninami tlenku propylenu i żywicy eposydowej w temperaturze pokojowej przy użyciu podanych proporcji objętościowych. Następnego dnia zanurz próbki w 100% świeżej żywicy epossydowej w foremkach i polimeryzuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Zamontuj blok próbki na uchwycie ultramikrotomu.Przytnij blok na powierzchni żyletką, aby osiągnąć poziom tkanki. Zamontuj nóż diamentowy przed próbką i wyrównaj powierzchnię próbki równolegle do noża. Za pomocą noża diamentowego należy wykonać półcienki przekrój o grubości jednego mikrometra, aby sprawdzić orientację próbki.Wybarwić półcienki wycinek błękitem toluidynowym do obserwacji za pomocą mikroskopii świetlnej. Następnie przytnij blok jeszcze bardziej, aby zmniejszyć obszar zainteresowania, aby uzyskać odpowiednie ultracienkie sekcje. Wycinaj ultracienkie odcinki o grubości od 60 do 70 nanometrów za pomocą drugiego noża diamentowego.Zbierz od jednej do dwóch sekcji na jednej całej miedzianej siatce za pomocą idealnej pętli. W celu kontrastowania sekcji, zanurz kratki w roztworze octanu uranylu na 20 minut i umyj kratki w wodzie podwójnie destylowanej, a następnie zanurz kratki w cytrynianie ołowiu na 15 minut i ponownie umyj kratki w wodzie podwójnie destylowanej. Włącz komputer transmisyjnego mikroskopu elektronowego i oprogramowanie do nagrywania obrazu, rejestruj obrazy cyfrowe za pomocą cyfrowej kamery CCD z powolnym skanowaniem i powiązanego oprogramowania do obrazowania.Po włożeniu siatki z wieloma sekcjami do etapu mikroskopu, należy początkowo przesiać siatkę w małym powiększeniu, aby wybrać odcinki najlepszej jakości i określić kierunek włókien mięśniowych. Następnie ustaw ostrość, obraz w powiększeniu powyżej 30 000 z wiązką wyśrodkowaną na światłowodzie peryferyjnym w przekroju i zapisz obrazy z jednosekundowym czasem naświetlania przy pożądanym powiększeniu. Upewnij się, że obrazy są rozmieszczone na całej długości i szerokości włókna w losowej kolejności systematycznej bota, aby uzyskać bezstronne wyniki i powtarzaj obrazowanie, aż zobrazowanych zostanie od sześciu do 10 włókien.Zaimportuj obrazy do obrazu J, klikając plik, a następnie otwórz. Ustaw skalę globalną, aby dopasować ją do oryginalnego rozmiaru obrazu, klikając Analizuj, a następnie ustaw skalę. Aby powiększyć w 100%kliknij obraz, przejdź do powiększenia i kliknij w.Zmierz grubość jednego dysku Z na obraz przestrzeni miofibrylarnej za pomocą narzędzia linii prostej z menu narzędzi i oblicz średnią grubość dysku Z każdego z sześciu do 10 włókien. Użyj narzędzia do linii segmentowej, aby zmierzyć długość najbardziej zewnętrznej miofibryli widocznej tuż pod obszarem podsarkolemmalnym. Aby wstawić siatkę, kliknij Analizuj, wybierz narzędzia, a następnie wybierz siatkę.Teraz ustaw pole na punkt na 32 400 nanometrów kwadratowych. Policz liczbę trafień w ramach dostępnej długości na 12 obrazach podsarkolemmalnych, na których krzyż uderza w glikogen podsarkolemmalny. Wstaw siatkę, klikając Analizuj, a następnie wybierz narzędzia, a następnie siatkę i ustaw obszar na punkt na 160 000 nanometrów kwadratowych.Policz liczbę trafień na 12. obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w przestrzeń wewnątrzmiofibrylarną. Następnie ponownie, aby wstawić siatkę, kliknij analizę, wybierz narzędzia, a następnie wybierz siatkę. Teraz ustaw obszar na punkt na 3 600 nanometrów kwadratowych.Policz liczbę trafień na 12. obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w glikogen wewnątrzmiofibrylarny. Wstaw siatkę, klikając Analizuj, a następnie wybierz narzędzia, a następnie siatkę i ustaw obszar na punkt na 32 400 nanometrów kwadratowych. Policz liczbę trafień na 12. obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w glikogen międzymiofibrylarny.Korzystając z siatki o powierzchni 32 400 nanometrów kwadratowych, aby losowo wybrać cząsteczki glikogenu, zacznij od lewego górnego kwadratu i w razie potrzeby przesuń w lewo. Za pomocą narzędzia do linii prostej zmierz średnicę pięciu losowo wybranych cząstek glikogenu z każdej puli dla każdego z 12 obrazów, aby uzyskać średnio 60 cząstek na pulę na włókno. Rysunek ten przedstawia normalne wartości trzech pul glikogenu.Można zaobserwować, że wartości glikogenu międzymiofibrylarnego są rozmieszczone blisko normy, podczas gdy zarówno glikogen wewnątrzmiofibrylarny, jak i podsarkolemmalny wykazują skośny rozkład, w którym włókna czasami mają nadmierną ilość glikogenu. Spośród wszystkich etapów bardzo ważne jest stosowanie żelazocyjanku potasu. Analizę glikogenu można połączyć z analizą mitochondrium i kropelek lipidów, co może poprawić nasze zrozumienie, w jaki sposób inne kluczowe składniki metaboliczne korelują ze zdrowiem glikogenu i mięśni.

quantification-subcellular-glycogen-distribution-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie pokazujemy przygotowanie próbki ludzkiej tkanki mięśni szkieletowych i jej barwienie do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu wizualizacji i ilościowego określenia subkomórkowego rozkładu glikogenu.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa w celu ilościowego określenia dystrybucji glikogenu w ludzkich mięśniach szkieletowych

Opisujemy tutaj dokładną, powtarzalną i wygodną biochemiczną metodę miareczkowania glikogenu in vitro. Technika ta wykorzystuje zestaw do oznaczania glikogenu Abcam i opiera się na sukcesywnej hydrolizie glikogenu do glukozy i miareczkowaniu glukozy przez fluorescencję.

Miareczkowanie biochemiczne glikogenu in vitro

Barwienie Schiffa kwasem okresowym to technika, która wizualizuje zawartość polisacharydów w tkankach. W artykule przedstawiono protokół barwienia Schiffa kwasem okresowym przystosowany do stosowania na komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej oczyszczonych z ludzkiej krwi żylnej. Takie próbki są wzbogacone o limfocyty i inne białe krwinki układu odpornościowego.

Wykrywanie glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą barwienia Schiffa kwasem okresowym

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Techniki pomiaru aktywności kluczowych enzymów metabolizmu glikogenu są prezentowane przy użyciu prostego spektrofotometru działającego w zakresie widzialnym.

Metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego

Optymalne stężenie sacharozy zostało określone do ekstrakcji glikogenu wątrobowego za pomocą wirowania w gradicynie gęstości sacharozy. Korzystne okazało się dodanie 10-minutowego etapu wrzenia w celu zahamowania enzymów rozkładających glikogen.

Ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu

W obecnym protokole, technika elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE) jest używana do określenia rozkładu długości łańcucha (CLD) i średniej długości łańcucha (ACL) glikogenu.

Oznaczanie rozkładu długości łańcucha glukanowego glikogenu metodą elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE)

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Test tkań zwierzęcych wykorzystuje detekcję scyntylacji jądrowej do określenia aktywności enzymatycznej syntazy glikogenu poprzez pomiar włączenia radioaktywnie znakowanej glukozy do glikogenu.

Ocena radiochemiczna aktywności enzymu syntazy glikogenowej w tkankach zwierzęcych

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Poznaj metodę kwantyfikacji subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika z wykorzystaniem ferrocyjanku potasu zapewnia bezprzeciwcielowe barwienie i niezależną analizę stereologiczną.

Kwantyfikacja subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów