Kwantyfikacja subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej
February 7th, 2022
Zmodyfikowana procedura po utrwaleniu zwiększa kontrast cząsteczek glikogenu w tkance. W tym artykule przedstawiono protokół krok po kroku opisujący, jak obchodzić się z tkanką, przeprowadzać obrazowanie i stosować metody stereologiczne w celu uzyskania bezstronnych i ilościowych danych na temat specyficznej dla typu włókien subkomórkowej dystrybucji glikogenu w mięśniach szkieletowych.
Pomiar zawartości glikogenu w pojedynczych komórkach i organizacjach subkomórkowych jest ważny, ponieważ w większości typów komórek pojedyncze komórki inaczej przystosowują się do zmieniających się warunków fizjologicznych i chorób. Tak więc główną zaletą tej techniki jest bardzo wysoka rozdzielczość w transmisyjnym mikroskopie elektronowym. Zwiększa to możliwość posiadania zlokalizowanych struktur subkomórkowych, a także w tej zawartości w tej technice ważne jest, aby barwienie glikogenem było wolne od przeciwciał.
Nie mamy więc żadnych konkretów, o które musimy się martwić. Aby uzyskać lepszy kontrast z glikogenem, wystarczy użyć żelazocyjanku potasu 1,5% zamiast żelazocyjanku potasu. Przygotować 1,6 mililitra pierwotnego roztworu utrwalającego, dodając 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu w dwumililitrowej probówce do mikrowirowania.
Przechowuj go w temperaturze pięciu stopni Celsjusza maksymalnie przez 14 dni. Odizolować małą próbkę z biopsji mięśnia lub całego mięśnia, który ma maksymalną średnicę jednego milimetra w dowolnym kierunku i jest dłuższy wzdłużnie niż w przekroju poprzecznym. Umieścić próbkę w probówce zawierającej zimny roztwór do utrwalania pierwotnego.
Przechowuj go w temperaturze pięciu stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie przemyć próbkę czterokrotnie w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu. Za pomocą pipet transferowych usunąć zużyty bufor z probówki, pozostawiając próbkę nietkniętą, a następnie dodać świeży bufor.
Po utrwaleniu próbki 1% tetratlenkiem osmu i 1,5% żelazocyjankiem potasu w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu przez 120 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wypłucz próbkę dwukrotnie w podwójnie destylowanej wodzie o temperaturze pokojowej. Odwodnić przez zanurzenie w stopniowanej serii etanolu w temperaturze pokojowej.
Naciekać próbkę mieszaninami tlenku propylenu i żywicy eposydowej w temperaturze pokojowej przy użyciu podanych proporcji objętościowych. Następnego dnia zanurz próbki w 100% świeżej żywicy epossydowej w foremkach i polimeryzuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Zamontuj blok próbki na uchwycie ultramikrotomu.
Przytnij blok na powierzchni żyletką, aby osiągnąć poziom tkanki. Zamontuj nóż diamentowy przed próbką i wyrównaj powierzchnię próbki równolegle do noża. Za pomocą noża diamentowego należy wykonać półcienki przekrój o grubości jednego mikrometra, aby sprawdzić orientację próbki.
Wybarwić półcienki wycinek błękitem toluidynowym do obserwacji za pomocą mikroskopii świetlnej. Następnie przytnij blok jeszcze bardziej, aby zmniejszyć obszar zainteresowania, aby uzyskać odpowiednie ultracienkie sekcje. Wycinaj ultracienkie odcinki o grubości od 60 do 70 nanometrów za pomocą drugiego noża diamentowego.
Zbierz od jednej do dwóch sekcji na jednej całej miedzianej siatce za pomocą idealnej pętli. W celu kontrastowania sekcji, zanurz kratki w roztworze octanu uranylu na 20 minut i umyj kratki w wodzie podwójnie destylowanej, a następnie zanurz kratki w cytrynianie ołowiu na 15 minut i ponownie umyj kratki w wodzie podwójnie destylowanej. Włącz komputer transmisyjnego mikroskopu elektronowego i oprogramowanie do nagrywania obrazu, rejestruj obrazy cyfrowe za pomocą cyfrowej kamery CCD z powolnym skanowaniem i powiązanego oprogramowania do obrazowania.
Po włożeniu siatki z wieloma sekcjami do etapu mikroskopu, należy początkowo przesiać siatkę w małym powiększeniu, aby wybrać odcinki najlepszej jakości i określić kierunek włókien mięśniowych. Następnie ustaw ostrość, obraz w powiększeniu powyżej 30 000 z wiązką wyśrodkowaną na światłowodzie peryferyjnym w przekroju i zapisz obrazy z jednosekundowym czasem naświetlania przy pożądanym powiększeniu. Upewnij się, że obrazy są rozmieszczone na całej długości i szerokości włókna w losowej kolejności systematycznej bota, aby uzyskać bezstronne wyniki i powtarzaj obrazowanie, aż zobrazowanych zostanie od sześciu do 10 włókien.
Zaimportuj obrazy do obrazu J, klikając plik, a następnie otwórz. Ustaw skalę globalną, aby dopasować ją do oryginalnego rozmiaru obrazu, klikając Analizuj, a następnie ustaw skalę. Aby powiększyć w 100%kliknij obraz, przejdź do powiększenia i kliknij w.
Zmierz grubość jednego dysku Z na obraz przestrzeni miofibrylarnej za pomocą narzędzia linii prostej z menu narzędzi i oblicz średnią grubość dysku Z każdego z sześciu do 10 włókien. Użyj narzędzia do linii segmentowej, aby zmierzyć długość najbardziej zewnętrznej miofibryli widocznej tuż pod obszarem podsarkolemmalnym. Aby wstawić siatkę, kliknij Analizuj, wybierz narzędzia, a następnie wybierz siatkę.
Teraz ustaw pole na punkt na 32 400 nanometrów kwadratowych. Policz liczbę trafień w ramach dostępnej długości na 12 obrazach podsarkolemmalnych, na których krzyż uderza w glikogen podsarkolemmalny. Wstaw siatkę, klikając Analizuj, a następnie wybierz narzędzia, a następnie siatkę i ustaw obszar na punkt na 160 000 nanometrów kwadratowych.
Policz liczbę trafień na 12. obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w przestrzeń wewnątrzmiofibrylarną. Następnie ponownie, aby wstawić siatkę, kliknij analizę, wybierz narzędzia, a następnie wybierz siatkę. Teraz ustaw obszar na punkt na 3 600 nanometrów kwadratowych.
Policz liczbę trafień na 12. obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w glikogen wewnątrzmiofibrylarny. Wstaw siatkę, klikając Analizuj, a następnie wybierz narzędzia, a następnie siatkę i ustaw obszar na punkt na 32 400 nanometrów kwadratowych. Policz liczbę trafień na 12. obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w glikogen międzymiofibrylarny.
Korzystając z siatki o powierzchni 32 400 nanometrów kwadratowych, aby losowo wybrać cząsteczki glikogenu, zacznij od lewego górnego kwadratu i w razie potrzeby przesuń w lewo. Za pomocą narzędzia do linii prostej zmierz średnicę pięciu losowo wybranych cząstek glikogenu z każdej puli dla każdego z 12 obrazów, aby uzyskać średnio 60 cząstek na pulę na włókno. Rysunek ten przedstawia normalne wartości trzech pul glikogenu.
Można zaobserwować, że wartości glikogenu międzymiofibrylarnego są rozmieszczone blisko normy, podczas gdy zarówno glikogen wewnątrzmiofibrylarny, jak i podsarkolemmalny wykazują skośny rozkład, w którym włókna czasami mają nadmierną ilość glikogenu. Spośród wszystkich etapów bardzo ważne jest stosowanie żelazocyjanku potasu. Analizę glikogenu można połączyć z analizą mitochondrium i kropelek lipidów, co może poprawić nasze zrozumienie, w jaki sposób inne kluczowe składniki metaboliczne korelują ze zdrowiem glikogenu i mięśni.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zmodyfikowaną procedurę post-fiksacji, która poprawia kontrast cząstek glikogenu w tkance. Protokół szczegółowo opisuje procedurę postępowania z tkanką, techniki obrazowania i metody stereologiczne do ilościowej oceny rozmieszczenia glikogenu w mięśniach szkieletowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Histologia
Tło
- Pomiar zawartości glikogenu jest kluczowy dla zrozumienia reakcji komórkowych na zmiany fizjologiczne.
- Pojedyncze komórki wykazują różnorodne adaptacje do warunków i chorób.
- Wysokorozdzielcze obrazowanie jest niezbędne do obserwacji struktur subkomórkowych.
- Technika unika problemów związanych ze specyficznością, stosując barwienie glikogenu bez użycia przeciwciał.
Cel badania
- Poprawić kontrast cząstek glikogenu w próbkach tkankowych.
- Przedstawić szczegółowy protokół dotyczący obrazowania i analizy.
- Uzyskać obiektywne dane dotyczące rozmieszczenia glikogenu w mięśniach szkieletowych.
Stosowane metody
- Zmodyfikowana procedura post-fiksacji z użyciem ferrocyjanku potasu.
- Przygotowanie roztworu utrwalającego z glutaraldehydem i buforem kakodylany sodu.
- Mikroskopia elektronowa transmisyjna dla wysokorozdzielczego obrazowania.
- Metody stereologiczne do ilościowej analizy.
Główne wyniki
- Uzyskano zwiększony kontrast cząstek glikogenu.
- Protokół umożliwia precyzyjne obrazowanie struktur subkomórkowych.
- Wykazano obiektywne ilościowe ocena rozmieszczenia glikogenu.
- Technika ma zastosowanie do różnych typów tkanek.
Wnioski
- Zmodyfikowana procedura znacznie poprawia wizualizacje glikogenu.
- Przedstawia niezawodną metodę badania glikogenu w mięśniach szkieletowych.
- Ułatwia lepsze zrozumienie adaptacji komórkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This TEM-based glycogen quantification method enables high-resolution subcellular analysis critical for de-risking metabolic target hypotheses in skeletal muscle. By resolving glycogen distribution across distinct subcellular compartments, it provides mechanistic insights that improve predictive confidence in preclinical models of metabolic disease. The approach supports early discovery workflows requiring subcellular phenotyping and biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glycogen storage patterns to clarify metabolic pathway involvement in disease models.
- Operational Value: Provides subcellular resolution to distinguish artifactual from biologically relevant glycogen accumulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ultrastructural data (volume fraction, particle diameter) for assay standardization across subcellular glycogen pools.
- Operational Value: Supports development of reproducible, antibody-free staining protocols compatible with high-throughput EM imaging.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links subcellular glycogen distribution to mitochondrial and lipid droplet morphology for integrated metabolic phenotyping.
- Operational Value: Enables cross-comparison of glycogen dynamics in disease-relevant skeletal muscle models prior to preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where subcellular metabolic phenotyping informs target validation and lead identification decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing non-uniform glycogen storage that challenges homogeneous assumptions in metabolic modeling.
- Screening: Delivers quantitative glycogen readouts (volume fraction, particle size) enabling comparison across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs stereological grid-based counting to generate unbiased, statistically robust estimates of glycogen distribution.
- Translational Research: Connects glycogen ultrastructure to organelle morphology, supporting biomarker alignment in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized TEM workflow for subcellular glycogen quantification applicable across multiple skeletal muscle studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving glycogen heterogeneity at the subcellular level.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and stereological analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing subcellular metabolic context that complements bulk biochemical assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on subcellular glycogen phenotypes in disease models.
Implementation Considerations
- Expertise in TEM sample preparation, ultramicrotomy, and stereological analysis is required.
- Access to transmission electron microscopy with digital imaging capabilities and image analysis software (e.g., ImageJ) is essential.
- Standardization across teams requires adherence to fixed staining concentrations (e.g., potassium ferrocyanide 1.5%) and grid-based counting parameters.
- Adaptation to other muscle fiber types or tissue systems may require optimization of sectioning and staining protocols.
- Methodological limitations include sampling bias if fiber orientation or section distribution is not randomized, as noted in the protocol.
