Ilościowa technika frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy

Nasz nowy protokół pomaga rozróżnić i określić ilościowo trzy statusy pierścieni probówki, takie jak stabilne mikrotubule, labilne mikrotubule i wolne kanaliki w tkankach zwierzęcych. Technika ta składa się z prostych kroków i może ocenić stabilność strukturalną rurki, której nie można wykryć za pomocą kwantyfikacji rurki po modyfikacji translacyjnej. Metoda ta ma zasadnicze znaczenie dla badań i rozwoju sposobów leczenia chorób, w których stabilność mikrotubul ma kluczowe znaczenie, takich jak choroba Alzheimera i nowotwory.

Rozpocznij procedurę od przygotowania odzieży laboratoryjnej do wypreparowania tkanek. Napełnij pudełko pokruszonym lodem i umieść na nim dwie szalki Petriego. Napełnij jedno naczynie lodowatym roztworem buforowym fosforanu lub PBS w celu przejściowego umycia i przechowywania wypreparowanych tkanek.

Połóż bibułę filtracyjną zwilżoną PBS na drugim naczyniu. Następnie zważ 1,5-mililitrowe mikroprobówki wypełnione PBS do przechowywania wypreparowanych tkanek. Po pobraniu tkanek od myszy poddanej eutanazji, przenieś je do probówek i ponownie zważ każdą mikroprobówkę.

Przenieść tkanki do szklanego homogenizatora z lodowatym buforem stabilizującym mikrotubule lub pożywką MSB+ i natychmiast homogenizować tkankę za pomocą schłodzonego homogenizatora. Teraz przenieś homogenat tkankowy do dwumililitrowej mikroprobówki za pomocą pipety Pasteura i odwiruj przy 2 400 G przez trzy minuty w dwóch stopniach Celsjusza. Przenieś supernatant do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra, aby usunąć zanieczyszczenia.

Wiruj supernatant lub frakcję S1 w nowej mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra. Natychmiast odpipetować 200 mikrolitrów frakcji S1 do mikroprobówki wirującej i odwirować przy 100 000 G za pomocą rotora TLA-55 przez 20 minut w temperaturze dwóch stopni Celsjusza. Po drugim odwirowaniu oddzielić supernatant S2 od osadu P2.

Natychmiast przenieś całą ilość frakcji S2 do mikroprobówki wirującej i za pomocą wirnika TLA-120.2 wiruj ją z prędkością 500 000 G przez 60 minut w temperaturze dwóch stopni Celsjusza. Po trzecim odwirowaniu oddzielić supernatant S3 od osadu P3. Rozpuść całą frakcję S3 w 200 mikrolitrach 2X dodecylosiarczanu sodu lub buforu próbki SDS.

Wymieszać pozostałe frakcje S1 z równą objętością buforu do próbek 2X SDS w celu użycia jako krzywa standardowa do western blot. Następnie dodaj 400 mikrolitrów buforu próbki SDS do probówek frakcji P2 i P3. Następnie krótko poddaj sonikacji roztworu, aby rozpuścić osad przed przeniesieniem próbek do nowych 1,5-mililitrowych mikroprobówek i umieszczeniem ich w zamrażalniku.

Gotuj wszystkie próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Mikrotubule we frakcji P2 stanowiły 34,86% całkowitej alfa-tubuliny w mózgu myszy, podczas gdy te we frakcjach P3 i S3 stanowiły odpowiednio 56,13% i 9,01%. Procent tubuliny beta-3 we frakcjach P2, P3 i S3 nie różnił się istotnie od zawartości alfa-tubuliny.

Frakcja S2 wykazywała ograniczone przechodzenie tubuliny przez 300-kilodaltonową ultrafiltracyjną kolumnę wirową, podczas gdy frakcja S3 pozwalała na całkowite przejście kompleksów tubulinowych. Separacja chromatograficzna doprowadziła do 100-kilodaltonowej elucji tubuliny S3. W każdej frakcji odzyskano równe proporcje alfa- i beta-tubuliny.

Frakcje P2 były istotnie wzbogacone w acetylowaną alfa-tubulinę, natomiast tyrozynowana alfa-tubulina dominowała we frakcji P3. Zamrożenie mózgu przed homogenizacją spowodowało zmniejszenie stężenia alfa-tubuliny we frakcjach P2. Jednak alfa-tubulina zwiększyła się we frakcji P3.

Zamrażanie obniżyło również poziom acetylacji i zwiększyło poziom tyrozyny alfa-tubuliny we frakcji P2. Leczenie nokodazolem zmniejszało stężenie alfa-tubuliny we frakcji P2. W przeciwieństwie do zamrażania, nokodazol nie wpływał na potranslacyjne modyfikacje tubuliny P2.

Tkanka mózgowa wykazywała istotnie wyższe stężenie tubuliny P2, podczas gdy tubuliny P3 były skoncentrowane w tkance proliferacyjnej. Western blot wykazał, że tubulina P2 specyficznie występująca w układzie nerwowym pochodzi ze stabilnych mikrotubul, a tubulina P3 pochodzi z labilnych mikrotubul. Stabilność mikrotubul jest bardzo dynamiczna.

Ważne jest, aby wypełnić ten protokół szybko, bez przerw, w środowisku o niskiej temperaturze. Należy również upewnić się, że tkanki i frakcje nie zostały zamrożone do momentu rozpuszczenia w buforze próbki SDS. Oczekuje się, że połączenie prezentacji immunologicznej przy użyciu każdej frakcji z proteomiką pozwoli zidentyfikować czynniki zaangażowane w dynamikę mikrotubul.

Za pomocą tej metody ujawniliśmy, jak normalne jest tau w mikrotubulach. Może być również wykorzystany do badania, w jaki sposób staje się nieprawidłowy w starzejących się mózgach w celu zidentyfikowania nowych celów leków w demencji.