Ilościowa technika frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy
17 listopada 2023
Mikrotubule, które są polimerami tubuliny, odgrywają kluczową rolę jako składnik cytoszkieletu w komórkach eukariotycznych i są znane ze swojej dynamicznej niestabilności. W badaniu tym opracowano metodę frakcjonowania mikrotubul w celu rozdzielenia ich na stabilne mikrotubule, labilne mikrotubule i wolną tubulinę w celu oceny stabilności mikrotubul w różnych tkankach myszy.
Nasz nowy protokół pomaga rozróżnić i określić ilościowo trzy statusy pierścieni probówki, takie jak stabilne mikrotubule, labilne mikrotubule i wolne kanaliki w tkankach zwierzęcych. Technika ta składa się z prostych kroków i może ocenić stabilność strukturalną rurki, której nie można wykryć za pomocą kwantyfikacji rurki po modyfikacji translacyjnej. Metoda ta ma zasadnicze znaczenie dla badań i rozwoju sposobów leczenia chorób, w których stabilność mikrotubul ma kluczowe znaczenie, takich jak choroba Alzheimera i nowotwory.
Rozpocznij procedurę od przygotowania odzieży laboratoryjnej do wypreparowania tkanek. Napełnij pudełko pokruszonym lodem i umieść na nim dwie szalki Petriego. Napełnij jedno naczynie lodowatym roztworem buforowym fosforanu lub PBS w celu przejściowego umycia i przechowywania wypreparowanych tkanek.
Połóż bibułę filtracyjną zwilżoną PBS na drugim naczyniu. Następnie zważ 1,5-mililitrowe mikroprobówki wypełnione PBS do przechowywania wypreparowanych tkanek. Po pobraniu tkanek od myszy poddanej eutanazji, przenieś je do probówek i ponownie zważ każdą mikroprobówkę.
Przenieść tkanki do szklanego homogenizatora z lodowatym buforem stabilizującym mikrotubule lub pożywką MSB+ i natychmiast homogenizować tkankę za pomocą schłodzonego homogenizatora. Teraz przenieś homogenat tkankowy do dwumililitrowej mikroprobówki za pomocą pipety Pasteura i odwiruj przy 2 400 G przez trzy minuty w dwóch stopniach Celsjusza. Przenieś supernatant do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra, aby usunąć zanieczyszczenia.
Wiruj supernatant lub frakcję S1 w nowej mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra. Natychmiast odpipetować 200 mikrolitrów frakcji S1 do mikroprobówki wirującej i odwirować przy 100 000 G za pomocą rotora TLA-55 przez 20 minut w temperaturze dwóch stopni Celsjusza. Po drugim odwirowaniu oddzielić supernatant S2 od osadu P2.
Natychmiast przenieś całą ilość frakcji S2 do mikroprobówki wirującej i za pomocą wirnika TLA-120.2 wiruj ją z prędkością 500 000 G przez 60 minut w temperaturze dwóch stopni Celsjusza. Po trzecim odwirowaniu oddzielić supernatant S3 od osadu P3. Rozpuść całą frakcję S3 w 200 mikrolitrach 2X dodecylosiarczanu sodu lub buforu próbki SDS.
Wymieszać pozostałe frakcje S1 z równą objętością buforu do próbek 2X SDS w celu użycia jako krzywa standardowa do western blot. Następnie dodaj 400 mikrolitrów buforu próbki SDS do probówek frakcji P2 i P3. Następnie krótko poddaj sonikacji roztworu, aby rozpuścić osad przed przeniesieniem próbek do nowych 1,5-mililitrowych mikroprobówek i umieszczeniem ich w zamrażalniku.
Gotuj wszystkie próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Mikrotubule we frakcji P2 stanowiły 34,86% całkowitej alfa-tubuliny w mózgu myszy, podczas gdy te we frakcjach P3 i S3 stanowiły odpowiednio 56,13% i 9,01%. Procent tubuliny beta-3 we frakcjach P2, P3 i S3 nie różnił się istotnie od zawartości alfa-tubuliny.
Frakcja S2 wykazywała ograniczone przechodzenie tubuliny przez 300-kilodaltonową ultrafiltracyjną kolumnę wirową, podczas gdy frakcja S3 pozwalała na całkowite przejście kompleksów tubulinowych. Separacja chromatograficzna doprowadziła do 100-kilodaltonowej elucji tubuliny S3. W każdej frakcji odzyskano równe proporcje alfa- i beta-tubuliny.
Frakcje P2 były istotnie wzbogacone w acetylowaną alfa-tubulinę, natomiast tyrozynowana alfa-tubulina dominowała we frakcji P3. Zamrożenie mózgu przed homogenizacją spowodowało zmniejszenie stężenia alfa-tubuliny we frakcjach P2. Jednak alfa-tubulina zwiększyła się we frakcji P3.
Zamrażanie obniżyło również poziom acetylacji i zwiększyło poziom tyrozyny alfa-tubuliny we frakcji P2. Leczenie nokodazolem zmniejszało stężenie alfa-tubuliny we frakcji P2. W przeciwieństwie do zamrażania, nokodazol nie wpływał na potranslacyjne modyfikacje tubuliny P2.
Tkanka mózgowa wykazywała istotnie wyższe stężenie tubuliny P2, podczas gdy tubuliny P3 były skoncentrowane w tkance proliferacyjnej. Western blot wykazał, że tubulina P2 specyficznie występująca w układzie nerwowym pochodzi ze stabilnych mikrotubul, a tubulina P3 pochodzi z labilnych mikrotubul. Stabilność mikrotubul jest bardzo dynamiczna.
Ważne jest, aby wypełnić ten protokół szybko, bez przerw, w środowisku o niskiej temperaturze. Należy również upewnić się, że tkanki i frakcje nie zostały zamrożone do momentu rozpuszczenia w buforze próbki SDS. Oczekuje się, że połączenie prezentacji immunologicznej przy użyciu każdej frakcji z proteomiką pozwoli zidentyfikować czynniki zaangażowane w dynamikę mikrotubul.
Za pomocą tej metody ujawniliśmy, jak normalne jest tau w mikrotubulach. Może być również wykorzystany do badania, w jaki sposób staje się nieprawidłowy w starzejących się mózgach w celu zidentyfikowania nowych celów leków w demencji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowy protokół różnicowania i ilościowego oznaczania stabilnych mikrotubul, mikrotubul labilnych oraz wolnej tubuliny w tkankach zwierzęcych. Metoda ta ocenia stabilność strukturalną mikrotubul, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia takich schorzeń jak choroba Alzheimera oraz nowotwory.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Dynamika mikrotubul
Wstęp
- Mikrotubule są niezbędnymi elementami cytoszkieletu w komórkach eukariotycznych.
- Wykazują one niestabilność dynamiczną, co wpływa na funkcje komórkowe.
- Zrozumienie stabilności mikrotubul jest kluczowe dla rozwoju metod terapeutycznych.
- Choroby takie jak choroba Alzheimera oraz niektóre nowotwory są powiązane z dysfunkcją mikrotubul.
Cel badania
- Opracowanie metody frakcjonowania mikrotubul w tkankach myszy.
- Ocena stabilności różnych stanów mikrotubul.
- Pogłębienie zrozumienia chorób związanych z mikrotubulami.
Zastosowane metody
- Przygotowanie odzieży laboratoryjnej do sekcji tkanek.
- Stosowanie lodowatego roztworu buforu fosforanowego do manipulacji tkankami.
- Frakcjonowanie mikrotubul na tubulinę stabilną, labilną i wolną.
- Kwantyfikacja stabilności mikrotubul zgodnie z nowym protokołem.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie rozróżnia mikrotubule stabilne od labilnych.
- Kwantyfikacja dostarcza informacji na temat stabilności mikrotubul w różnych tkankach.
- Metoda jest prosta i powtarzalna w zastosowaniach laboratoryjnych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia dynamiki mikrotubul w kontekście chorób.
Wnioski
- Ten nowy protokół stanowi cenne narzędzie dla badaczy zajmujących się stabilnością mikrotubul.
- Posiada on potencjalne zastosowania w zrozumieniu i leczeniu chorób związanych z dysfunkcją mikrotubul.
- Dalsze badania mogą opierać się na tych wynikach w celu eksploracji dróg terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna ocena stabilności mikrotubul jest niezbędna do analizy mechanizmów terapeutycznych w chorobach neurodegeneracyjnych i nowotworach, w których dynamika cytoszkieletu wpływa na odpowiedź na leki. Ta technika frakcjonowania umożliwia bezpośrednią kwantyfikację pul stabilnej, labilnej i wolnej tubuliny w tkankach natywnych, zapewniając odczyt biochemiczny uzupełniający obrazowanie oraz testy specyficzne dla modyfikacji. Poprzez rozdzielenie funkcjonalnych stanów mikrotubul, metoda ta wspiera walidację celów i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w wczesnych programach odkrywania leków skoncentrowanych na czynnikach modulujących mikrotubule.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie przesunięć w populacjach mikrotubul stabilnych względem labilnych w odpowiedzi na zastosowanie związku.
- Wartość operacyjna: Dostarcza biochemiczny test oparty na tkance w celu walidacji związania z celem czynników stabilizujących lub destabilizujących mikrotubule.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez korelację biochemicznej stabilizacji mikrotubul z wynikami funkcjonalnymi w systemach istotnych dla danej choroby.
Przesiewanie i opracowanie analizy
- Gotowość analizy: Generuje ilościowe dane dotyczące frakcjonowania tubuliny, odpowiednie do wysokoprzepustowego przesiewu bibliotek związków celujących w dynamikę mikrotubul.
- Powtarzalność: Wykorzystuje standaryzowane etapy ultrawirowania w celu uzyskania spójnego rozdzielenia frakcji mikrotubul w różnych eksperymentach.
- Skalowalność: Kompatybilna z metodą western blotting oraz analizami proteomicznymi w celu identyfikacji regulatorów stabilności mikrotubul z frakcjonowanych pul tubuliny.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Wykrywa tkankowo specyficzne różnice w stabilności mikrotubul, które korelują z potencjałem proliferacyjnym, co umożliwia stratyfikację modeli przedklinicznych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy biochemiczne stany mikrotubul z sygnaturami modyfikacji potranslacyjnych (np. acetylacją w pulach stabilnych, tyrozynacją w pulach labilnych) w celu dopasowania biomarkerów.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go, dostarczając ilościowych parametrów stabilności, które pozwalają przewidzieć indeks terapeutyczny w programach ukierunkowanych na mikrotubule.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację wiodących związków, w którym stabilność mikrotubul służy jako biomarker farmakodynamiczny do potwierdzenia mechanizmu działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez pomiar zmian w stanach polimeryzacji mikrotubul indukowanych przez związki w lizatach tkanek natywnych.
- Przesiewy: Umożliwia standaryzację testu poprzez zdefiniowane progi sedymentacji (100 000 × g dla mikrotubul stabilnych, 500 000 × g dla mikrotubul labilnych), co zapewnia powtarzalność frakcjonowania.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty tubuliny za pomocą western blot frakcji P2 (stabilnej), P3 (labilnej) oraz S3 (wolnej tubuliny) w celu porównania efektów działania związków.
- Badania translacyjne: Łączy dane z frakcjonowania mikrotubul z tkankowo specyficznymi wzorcami ekspresji i profilami modyfikacji w celu walidacji przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalną platformę biochemiczną do oceny związków celujących w mikrotubule w wielu obszarach chorobowych i typach tkanek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez bezpośredni pomiar stanów polimeryzacji mikrotubul, zamiast polegać wyłącznie na modyfikacjach potranslacyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym parametrom wirowania oraz przetwarzaniu w kontrolowanej temperaturze w celu zachowania integralności mikrotubul.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zapewnienie ortogonalnej walidacji mechanizmu celowania w mikrotubule poza testami komórkowymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościową skuteczność stabilizacji w tkankach istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza w zakresie homogenizacji tkanek oraz technik ultrawirowania w celu zachowania stabilności mikrotubul podczas obróbki.
- Metoda zależy od dostępu do rotorów wysokiej prędkości (TLA-55 i TLA-120.2) zdolnych do osiągnięcia 100,000 × g oraz 500,000 × g w celu rozdzielenia frakcji.
- Konieczna jest standaryzacja czasu i temperatury frakcjonowania pomiędzy zespołami, aby zapewnić spójność wyników w różnych laboratoriach.
- Wymagana jest adaptacja składu buforu oraz parametrów wirowania przy stosowaniu metody w tkankach pozanerwowych o innej gęstości mikrotubul.
- Ograniczeniem jest konieczność natychmiastowej obróbki w celu zapobiegania artefaktowej depolimeryzacji mikrotubul podczas manipulacji próbkami.
