Name: Ilościowa technika frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj ilościową technikę frakcjonowania mikrotubul w tkankach myszy, umożliwiającą oddzielenie stabilnych i labilnych mikrotubul oraz wolnej tubuliny. Ta metoda pozwala ocenić stabilność strukturalną mikrotubul, co jest kluczowe dla badań nad chorobami takimi jak Alzheimer i nowotwory.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez JST, ustanowienie stypendiów uniwersyteckich w celu tworzenia innowacji w dziedzinie nauki, technologii (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) JSPS KAKENHI (22H02946 for TM), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas zatytułowane "Brain Protein Aging and Dementia Control" od MEXT (TM; 26117004) oraz przez Uehara Research Fellowship od Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

1. Metoda frakcjonowania MT
UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Doshisha. Wykorzystano tu myszy C57BL/6J obojga płci w wieku 3-4 miesięcy. W tym protokole wypreparowane tkanki, np. mózg, wątroba czy grasica, były natychmiast homogenizowane w lodowatym buforze stabilizującym mikrotubule (MSB), który zawierał Taxol (stabilizator MT) w stężeniu, które zapobiegało nie tylko depolimeryzacji, ale także repolimeryzacji MT. Homogenat został podzielony na trzy frakcje w dwuetapowym procesie ultrawirowania (Rysunek 1). Wszystkie etapy tego protokołu zostały zakończone bez przerwy w środowisku o niskiej temperaturze, a tkanki i frakcje nie zostały zamrożone, dopóki nie zostaną rozpuszczone w buforze próbki dodecylosiarczanu sodu (SDS).
<ol>
	<li>Przygotowanie MSB i mikroprobówek
	<ol>
		<li>Aby przygotować MSB, należy wymieszać następujące odczynniki: 0,1 M kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES), pH 6,8 (zneutralizowany przez KOH), 10% glicerolu, 0,1 mM DTT, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, 0,5% Triton X-100, inhibitory fosfatazy (1 mM NaF, 1 mM β-glicerofosforan, 1 mM Na3VO4, 0,5 μM kwas okadaikowy), 1x koktajl inhibitorów proteazy, i inhibitory proteazy (0,1 mM PMSF, 0,1 mM DIFP, 1 μg/ml pepstatyny, 1 μg/ml leki przeciwbólowe, 10 μg/ml aprotyniny, 10 μg/ml leupeptyny, 50 μg/ml TLCK) (patrz Tabela materiałów) i oznaczane jako MSB(-).</li>
		<li>Tuż przed rosekcją tkanek dodać 10 μM taksolu i 2 mM GTP (patrz tabela materiałów) do MSB(-). Ten bufor jest oznaczony jako MSB(+). Przygotuj bufor w dniu użycia i przechowuj go na lodzie.</li>
		<li>Przygotować mikroprobówki do pobrania próbek. Pusta mikroprobówka o pojemności 2,0 ml do przechowywania w homogenacie; pusta mikroprobówka o pojemności 1,5 ml do przechowywania lizatu supernatantu1 (S1), próbki osadu2 (P2) i próbki osadu3 (P3); 1,5 ml mikroprobówki z 1 ml lodowato zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do przechowywania wypreparowanych tkanek; 1,5 ml mikroprobówki z 200 μl buforu do próbek SDS (0,16 M Tris pH 6,8; 20% glicerolu; 2% 2-merkaptoetanolu; 4% SDS) do przechowywania próbki S1 i supernatantu3 (S3); i mikroprobówka wirówkowa do wirówek TLA55 i TLA120.2 (patrz tabela materiałów). Oznacz wszystkie probówki i umieść je na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizacja tkanek myszy
	<ol>
		<li>Przygotuj schłodzony stół do wypreparowania tkanek. Najpierw napełnij pudełko pokruszonym lodem i umieść dwie szalki Petriego na lodzie, jedną wewnętrzną stroną do góry, a drugą zewnętrzną stroną. Napełnij lodowaty PBS w jednym naczyniu do przejściowego mycia i przechowywania wypreparowanych tkanek. Połóż bibułę filtracyjną zwilżoną PBS na innym odwróconym naczyniu.</li>
		<li>Aby złożyć mysz w ofierze, wykonaj zwichnięcie szyjki macicy w głębokim znieczuleniu mieszanym środkiem znieczulającym butorfanol, midazolam i medetomidynę. Następnie natychmiast wypreparuj tkanki, np. mózg, wątrobę lub grasicę, i umyj je lodowatym PBS na szalce Petriego. 
		UWAGA: Tą metodą można analizować każdy rodzaj tkanki miękkiej. Jednak wielkość tkanki jest ograniczona przez zalecany zakres objętości zastosowanego homogenizatora. Na przykład, jeśli stosuje się homogenizator o objętości 2 ml, zaleca się 50-100 mg tkanki.</li>
		<li>Po zważeniu 1,5 ml mikroprobówek wypełnionych PBS do przechowywania wypreparowanych tkanek, wytnij i przechowuj tkanki wewnątrz mikroprobówek, a następnie ponownie zważ każdą mikroprobówkę. Mokrą masę każdej tkanki można obliczyć, odejmując wagę rurki przed i po dodaniu tkanki.</li>
		<li>Natychmiast homogenizować tkankę w lodowatym MSB(+) za pomocą schłodzonego homogenizatora (patrz tabela materiałów). Objętość MSB(+) była 19 razy (μl) mokra masa tkanki (mg). Przeprowadzić homogenizację za pomocą 20 pociągnięć, aż znikną kawałki tkanki. 
		UWAGA: Na przykład 1,900 μL MSB(+) stosuje się na 100 mg tkanki. Ponieważ objętość MSB(+), która ma być dodana, musi być dostosowana do każdej mokrej masy analizowanych fragmentów tkanki, konieczne jest dokładne zważenie każdego kawałka tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirowanie homogenatów tkanek myszy
	<ol>
		<li>Przenieść cały homogenat do mikroprobówki o pojemności 2 ml za pomocą pipety Pasteura i odwirować przy 2 400 × g przez 3 minuty w temperaturze 2 °C w celu usunięcia zanieczyszczeń poprzez wytrącanie.</li>
		<li>Przenieść cały supernatant (frakcję S1) do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i odwirować. Następnie podamulować 200 μl frakcji S1 do mikroprobówki wirującej i odwirować przy 100 000 × g przy użyciu rotora TLA-55 przez 20 minut w temperaturze 2 °C, aby otrzymać białka o stosunkowo dużej masie cząsteczkowej jako osad (frakcja P2). 
		UWAGA: Objętość próbki poddanej etapom ultrawirowania wpływa na promień wirowania i wydajność wytrącania cząsteczek. Po wykonaniu tego kroku należy utrzymać objętość próbki na poziomie 200 μl lub mniej, aby zapobiec niedokładnemu frakcjonowaniu.</li>
		<li>Następnie odwirować cały otrzymany supernatant (frakcja S2) w ilości 500 000 × g za pomocą rotora TLA-120.2 przez 60 minut w temperaturze 2 °C w celu oddzielenia nierozpuszczalnych kompleksów białkowych w osadzie (frakcja P3) od rozpuszczalnych białek w supernatancie (frakcja S3).</li>
		<li>Dodać 400 μl 1x buforu do próbek SDS (0,08 M Tris pH 6,8; 10% glicerolu; 1% 2-merkaptoetanolu; 2% SDS) do probówek frakcji P2 i P3 i krótko poddać sonikacji w celu rozpuszczenia osadu. Przenieś te próbki frakcji do pustej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Rozpuścić całkowitą frakcję S3 w 200 μl 2x buforu do próbek SDS.</li>
		<li>Wymieszać pozostałe frakcje S1 z równą objętością 2x buforu próbki SDS w celu użycia jako krzywa standardowa do Western blot.</li>
		<li>Gotować wszystkie te próbki w temperaturze 100 °C przez 3 minuty. Po schłodzeniu próbek do temperatury pokojowej należy je przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie ilościowe białek w każdej frakcji
	<ol>
		<li>Określ ilościowo białka we frakcjach P2, P3 i S3 za pomocą Western blot. Po pierwsze, użyj 10% elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE), aby oddzielić białka od odpowiednio rozcieńczonych frakcji P2, P3 i S3 oraz seryjnie rozcieńczoną próbkę S1 od dowolnej osoby jako krzywej standardowej. Następnie należy elektrobatycznie umieścić próbki na membranach z polifluorku winylidenu (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Stosunek rozcieńczenia każdej frakcji zależy od stężenia obiektywnego białka i reaktywności przeciwciała. (np. α-tubulina, TUBB3, β-tub i tubulina tyrozynowana w tkance mózgowej: S3 = 1/400, P3 = 1/2,000, P2 = 1/2 000, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000; acetylowana tubulina w tkance mózgowej: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8 000, S1 = 1/100 000, 1/40 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/4 000; α-tubulina w wątrobie: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2,000; α-tubulina w grasicy: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 rozcieńczenie stężenia w tkankach).</li>
		<li>Zatkaj membranę 5% odtłuszczonym mlekiem w soli fizjologicznej buforowanej Tris (50 mM Tris-HCl pH 7,6; 152 mM NaCl) 0,1% Tween 20 (TBS-T) przez ponad 30 minut.</li>
		<li>Zanurzyć membranę w TBS-T zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe (patrz Tabela Materiałów) na ponad 2 godziny. Następnie myj membranę TBS-T przez 3 minuty (3 razy).</li>
		<li>Znakować przeciwciało pierwszorzędowe za pomocą przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP (patrz tabela materiałów) w TBS-T przez ponad 1 godzinę. Następnie myj membranę TBS-T przez 3 minuty (3 razy).</li>
		<li>Opracować membrany za pomocą odczynnika Enhanced Chemiluminescence. Następnie przeanalizuj interesujące Cię pasma za pomocą luminescencyjnego analizatora obrazu (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Określ ilościowo intensywność pasm białkowych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów) i utwórz krzywą wzorcową, wykreślając jednostki rozcieńczenia rozcieńczonych próbek S1 użytych do krzywej wzorcowej wzdłuż osi X i intensywności pasma wzdłuż osi Y.</li>
		<li>Odczytać stężenie (jednostkę) białka odpowiadające rozcieńczonym próbkom frakcji. Pomnóż odczytane stężenie przez współczynnik rozcieńczenia próbki, aby otrzymać jednostkę białka w każdej frakcji. Podziel zmierzoną jednostkę każdej frakcji przez całkowitą jednostkę białka (P2 + P3 + S3), aby uzyskać procent.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocena właściwości tubuliny w każdej frakcji
UWAGA: Ta metoda biochemiczna dostarcza trzy grupy kompleksów tubulinowych zdefiniowanych przez właściwości sedymentacyjne. W tym przypadku status kompleksów tubulinowych otrzymanych w tych frakcjach określono na podstawie wielkości kompleksu i tubuliny-PTM. Wszystkie kroki opisane w niniejszym protokole należy wykonać bez przerwy w środowisku o niskiej temperaturze, ale nie należy zamrażać próbek frakcji, dopóki nie zostaną rozpuszczone w buforze próbek SDS.
<ol>
	<li>Test pułapki filtracyjnej
	<ol>
		<li>Przefiltrować frakcje S2 i S3 (po 500 μl każda) za pomocą ultrafiltracyjnej kolumny wirowej o mocy 300 kDa (patrz tabela materiałów). Przeprowadzić odwirowanie 14 000 × g w temperaturze 2 °C, aż cały supernatant zostanie przefiltrowany, eluowane białka zostaną zebrane do probówek odbiorczych, a uwięzione białka pozostaną na filtrze w probówkach zbiornikowych.</li>
		<li>Przenieść całe filtraty (około 500 μl) w probówkach odbiorczych do nowych mikroprobówek o pojemności 1,5 ml i rozpuścić je w 500 μl 2x buforu do próbek SDS.</li>
		<li>Rozpuszczono pozostałości na filtrze probówek zbiornikowych w 1 000 μl 1x buforu próbki SDS, pipetując i przenosząc próbki do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Gotować próbki w temperaturze 100 °C przez 3 minuty. Po schłodzeniu próbek do temperatury pokojowej należy je przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przeanalizować ilości tubuliny metodą Western blot z DM1A (przeciwciało anty-α-tubuliny, patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia wykluczania wielkości
	<ol>
		<li>Przygotować bufor nośnikowy (0,1 M MES, pH 6,8; 10% glicerol; 1 mMMgSO4; 1 mM EGTA; 0,1 mM DTT) uzupełniony inhibitorami proteazy i fosfatazy w stężeniu 1:10, jak opisano w kroku 1.1.1. Następnie przefiltruj roztwór i przechowuj go w chłodnym otoczeniu.</li>
		<li>Przygotować kolumnę do chromatografii z filtracją żelową wyposażoną w system preparatywnej chromatografii cieczowej w komorze chromatograficznej (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przed wstrzyknięciem próbek do kolumny należy przelać 180 ml buforu nośnego w celu przepłukania kolumny. Natężenie przepływu wynosi 1 ml/min przez 3 godziny.</li>
		<li>Wstrzyknąć dostępną w handlu oczyszczoną tubulinę wieprzową (patrz tabela materiałów) jako kontrolę lub frakcję S3 z mózgów myszy (po 500 μl każdy) do kolumny.</li>
		<li>Elucja z natężeniem przepływu 1,0 ml/min z buforem nośnikowym. Zbieraj frakcje 1,5 ml przez 120 minut. Monitorować eluowane białka przez absorbancję przy 280 nm. Utrzymuj maksymalne ciśnienie poniżej 0,3 MPa.</li>
		<li>Po wirowaniu zebranych frakcji wymieszaj 50 μl z 50 μl 2x buforu SDS w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml. Gotować wszystkie próbki w temperaturze 100 °C przez 3 minuty. Po schłodzeniu próbek do temperatury pokojowej należy je przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Analizuj ilości tubuliny metodą Western blot z DM1A, przeciwciałem anty-α-tubuliną i KMX-1, przeciwciałem anty-β-tubuliny (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li>
<li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly%2C+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li>
<li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+properties+of+neuronal+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li>
<li>Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubule+ends+are+required+for+growth+cone+turning+to+avoid+an+inhibitory+guidance+cue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue.</a> Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).</li>
<li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+neuronal+microtubule+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Building the neuronal microtubule cytoskeleton.</a> Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).</li>
<li>Leo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+fidgetin+restrains+axonal+growth+by+severing+labile+domains+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules.</a> Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).</li>
<li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%3A+molecular+components%2C+readout+mechanisms%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).</li>
<li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207(2017).</li>
<li>Baas, P. W., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+microtubules+in+the+axon+consist+of+domains+that+differ+in+both+composition+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability.</a> Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).</li>
<li>Cartelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+alterations+occur+early+in+experimental+parkinsonism+and+the+microtubule+stabilizer+epothilone+D+is+neuroprotective%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective.</a> Scientific Reports. 3, 1837(2013).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-binding+drugs+offset+tau+sequestration+by+stabilizing+microtubules+and+reversing+fast+axonal+transport+deficits+in+a+tauopathy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+alpha-tubulin+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease.</a> Translational Neurodegeneration. 4, 9(2015).</li>
<li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+improves+tau-induced+neuronal+dysfunction+of+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes.</a> Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).</li>
<li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+microtubule+assembly+competent+tubulin+synthesis+leads+to+accumulation+of+phosphorylated+tau+in+neuronal+cell+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).</li>
<li>Vielkind, U., Swierenga, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+fixation+procedure+for+immunofluorescent+detection+of+different+cytoskeletal+components+within+the+same+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell.</a> Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).</li>
<li>Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+microtubules+of+the+axon%3A+quantitative+analysis+of+tyrosinated+and+acetylated+tubulin+along+individual+axonal+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules.</a> Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).</li>
<li>Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+is+enriched+on+dynamic+microtubules+in+the+distal+region+of+growing+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons.</a> Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).</li>
<li>Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+tubulin+synthesis+in+hepatocytes+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts.</a> Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).</li>
<li>Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+destruction+of+stable+microtubules+and+axons+by+inhibitors+of+protein+serine%2Fthreonine+phosphatases+in+cultured+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons.</a> Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).</li>
<li>Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+destruction+induces+tau+liberation+and+its+subsequent+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).</li>
<li>Hagita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fractionation+of+tissue+microtubules+with+distinct+biochemical+properties+reflecting+their+stability+and+lability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).</li>
<li>Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+tubulins+are+not+alike%3A+Heterodimer+dissociation+differs+among+different+biological+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).</li>
<li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taxol-dependent+procedure+for+the+isolation+of+microtubules+and+microtubule-associated+proteins+%28MAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).</li>
<li>Bartolo, M. E., Carter, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+microtubule+stabilization+on+the+freezing+tolerance+of+mesophyll+cells+of+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach.</a> Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).</li>
<li>Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPT+mutations%2C+tauopathy%2C+and+mechanisms+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).</li>
<li>Fourel, G., Boscheron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+mutations+in+neurodevelopmental+disorders+as+a+tool+to+decipher+microtubule+function%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function.</a> FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).</li>
<li>Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+in+Alzheimer%27s+presenile+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia.</a> The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).</li>
<li>Yoshida, H., Ihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+in+paired+helical+filaments+is+functionally+distinct+from+fetal+tau%3A+assembly+incompetence+of+paired+helical+filament-tau%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau.</a> Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).</li>
<li>Cash, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+reduction+in+Alzheimer%27s+disease+and+aging+is+independent+of+tau+filament+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation.</a> The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).</li>
<li>Hempen, B., Brion, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+acetylated+alpha-tubulin+immunoreactivity+in+neurofibrillary+tangle-bearing+neurons+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).</li>
<li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalanced+expression+of+tau+and+tubulin+induces+neuronal+dysfunction+in+C.+elegans+models+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 415(2018).</li>
<li>Boiarska, Z., Passarella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-targeting+agents+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Microtubule-targeting agents and neurodegeneration.</a> Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.

Najważniejszym zadaniem przy badaniu stanu tubuliny w tkance z organizmów żywych jest zapobieganie przypadkowej polimeryzacji MT lub depolimeryzacji podczas przygotowania. Na stabilność MT w próbkach mają wpływ takie czynniki, jak stężenie taksolu w MSB, proporcja ilości tkanki do buforu oraz temperatura podczas procesu od usunięcia tkanki do homogenizacji i odwirowania. W związku z tym warunki zostały zoptymalizowane na każdym etapie protokołu analizy tkanki myszy z 20-krotną objętością homogenatu. Wyższe stężenie takso...

Mikrotubule (MT) to wydłużone struktury rurkowe składające się z protofilamentów składających się z podjednostek heterodimeru α/β-tubuliny. Odgrywają one istotną rolę w różnych procesach komórkowych, takich jak podział komórek, ruchliwość, utrzymanie kształtu i transport wewnątrzkomórkowy, co czyni je integralnymi składnikami cytoszkieletu eukariotycznego1. Ujemny koniec MT, w którym odsłonięta jest podjednostka α-tubuliny, jest stosunkowo stabilny, podczas gdy koniec dodatni, w którym odsłonięta jest podjednostka β-tubuliny, ulega dynamicznej depolimeryzacji i polimeryzacji2. Ten ciągły cykl dodawania i dysocjacji dimerów tubuliny na końcu dodatnim, określany jako niestabilność dynamiczna, powoduje powtarzający się proces ratowania i katastrofy3. MT wykazują domeny ogniskowe z lokalnymi zmianami niestabilności dynamicznej, w tym domeny stabilne i labilne4.
Precyzyjna kontrola dynamicznej niestabilności MT jest kluczowa dla wielu funkcji komórkowych, szczególnie w neuronach charakteryzujących się skomplikowanymi morfologiami. Zdolność adaptacji i trwałość MT odgrywają istotną rolę w rozwoju i prawidłowym funkcjonowaniu komórek nerwowych5,6,7. Stwierdzono, że dynamiczna niestabilność MT jest związana z różnymi modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM) tubuliny, takimi jak acetylacja, fosforylacja, palmitoilacja, detyrozynacja, delta 2, utlenianie poliglutaminy i poliglicylacja. Dodatkowo, wiązanie białek związanych z mikrotubulami (MAP) służy jako mechanizm regulacyjny8. PTM, z wyłączeniem acetylacji, występują głównie w regionie karboksylowo-końcowym tubuliny znajdującym się na zewnętrznej powierzchni MT. Modyfikacje te tworzą różne warunki powierzchniowe na MT, wpływając na ich interakcję z MAP i ostatecznie decydując o stabilności MT9. Obecność karboksylowo-końcowej reszty tyrozyny w α-tubulinie wskazuje na dynamiczne MT, które są szybko zastępowane przez pulę wolnych tubuliny. I odwrotnie, detyrozynacja końca karboksylowego i acetylacja Lys40 oznaczają stabilne MT o zmniejszonej niestabilności dynamicznej9,10.
PTM tubuliny były szeroko stosowane w eksperymentach w celu oceny dynamiki i stabilności MTs5,7,11,12,13,14,15. Na przykład w badaniach nad hodowlami komórkowymi tubuliny można podzielić na dwie pule: pulę wolnych tubulin i pulę MT. Osiąga się to poprzez uwolnienie wolnej tubuliny przez przepuszczalność komórek przed utrwaleniem pozostałych MTs15,16,17,18,19. Metody biochemiczne polegają na zastosowaniu chemicznych stabilizatorów MT, które chronią MT przed katastrofą, umożliwiając oddzielenie MT i wolnej tubuliny poprzez wirowanie20,21,22. Jednak procedury te nie rozróżniają stabilnych i mniej stabilnych (labilnych) MT, co uniemożliwia ilościowe określenie MT lub rozpuszczalnej tubuliny w tkankach takich jak mózg. W związku z tym ocena stabilności MT w organizmach w warunkach fizjologicznych i patologicznych okazała się wyzwaniem. Aby rozwiązać ten eksperymentalny problem, opracowaliśmy nowatorską technikę precyzyjnego oddzielania MT i wolnej tubuliny w tkance myszy23.
Ta unikalna metoda frakcjonowania MT obejmuje homogenizację tkanek w warunkach, które utrzymują status tubuliny w tkankach i dwuetapowe wirowanie w celu oddzielenia stabilnych MT, labilnych MT i wolnej tubuliny. Ta prosta procedura może być zastosowana do szerokich badań, w tym badań podstawowych nad MT i MAP w organizmach żywych, fizjologicznych i patologicznych analiz zdrowia i chorób związanych ze stabilnością MT oraz opracowywania leków i innych środków terapeutycznych ukierunkowanych na MT.

<table><tbody><tr><td>POJEMNIK NA 1,5 ML TUBKA 500</td><td>Beckman Coulter</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>1A2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9028</td> 1<td>:5,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02442-44</td><td></td></tr><tr><td>300 kDa ultrafiltracyjna kolumna wirowa</td><td>Aproscience</td><td>PT-1013</td><td></td></tr><tr><td>6-11B1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:5,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>&#196; KTAprime plus</td><td>Cytiva</td><td>11001313</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-146</td><td>1:5,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>przeciwbólowe</td><td>Peptide Institute Inc.</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>aprotynina</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03346-84</td><td></td></tr><tr><td>Chemi-Lumi One L</td><td>Nacalai Tesque</td><td>07880-54</td><td></td></tr><tr><td>Butelkowy system filtrów próżniowych Corning</td><td></td><td>430758</td><td>0,22&micro; m 33,2 cm&sup2; Membrana nitrocelulozowa</td></tr><tr><td>DIFP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55-91-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HOMOGENIZATOR CYFROWY HK-1</td><td>AS ONE</td><td>1-2050-11</td><td></td></tr><tr><td>DM1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>Rozcieńczenie 1:5,000</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14128-46</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Nacalai Tesque</td><td>37346-05</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTrans W 3,3 metra Roll</td><td>Pall Corporation</td><td>BSP0161</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17018-25</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17450-61</td><td></td></tr><tr><td>MIKROWIRÓWKA CHŁODNICZA O DUŻEJ PRĘDKOŚCI Kitman</td><td>TOMY</td><td>KITMAN-24</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>kolumna Cytiva</td><td>28-9893-35</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie miernika obrazu&nbsp;</td><td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImmunoStar LD&nbsp;</td><td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>292-69903</td><td></td></tr><tr><td>KMX-1</td><td>Milipore</td><td>MAB3408</td><td>rozcieńczenie 1:5,000</td></tr><tr><td>Analizator obrazu luminescencyjnego LAS-4000</td><td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Peptide Institute Inc.</td><td>43449-62</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21003-75</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Nacalai Tesque</td><td>32013-92</td><td></td></tr><tr><td>NaF Nacalai</td><td>Tesque</td><td>31420-82</td><td></td></tr><tr><td>kwas okadaikowy</td><td>LC Laboratories</td><td>O-2220&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>OPTIMA MAX-XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>pepstatin</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26436-52</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Nacalai Tesque</td><td>27327-81</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe z poliwęglanu do TLA120.2</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy (cOmplete&#8482;, bez EDTA)</td> <td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczona tubulina&nbsp;</td><td>Cytoszkielet</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>QSONICA Q55</td><td>QSonica</td><td>Q55</td><td></td></tr><tr><td>Taxol</td><td>LC Laboratories</td><td>P-9600</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>357656</td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>366725</td><td></td></tr><tr><td>TLCK</td><td>Nacalai Tesque</td><td>34219-94</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-45</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa technika frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy

Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

Mikrotubule, złożone z dimerów α/β-tubuliny, są kluczowym składnikiem cytoszkieletu w komórkach eukariotycznych. Te rurkowate polimery wykazują dynamiczną niestabilność, ponieważ podjednostki heterodimeru tubuliny ulegają powtarzalnej polimeryzacji i depolimeryzacji. Precyzyjna kontrola stabilności i dynamiki mikrotubul, osiągnięta dzięki modyfikacjom potranslacyjnym tubuliny i białkom związanym z mikrotubulami, jest niezbędna dla różnych funkcji komórkowych. Dysfunkcje mikrotubul są silnie związane z patogenezą, w tym z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Trwające badania koncentrują się na środkach terapeutycznych ukierunkowanych na mikrotubule, które modulują stabilność, oferując potencjalne opcje leczenia tych chorób i nowotworów. W związku z tym zrozumienie stanu dynamicznego mikrotubul ma kluczowe znaczenie dla oceny postępu choroby i efektów terapeutycznych.
Tradycyjnie, dynamika mikrotubul była oceniana in vitro lub w hodowanych komórkach poprzez wstępne frakcjonowanie lub test immunologiczny, przy użyciu przeciwciał ukierunkowanych na potranslacyjne modyfikacje tubuliny. Jednak dokładna analiza stanu tubuliny w tkankach za pomocą takich procedur stanowi wyzwanie. W tym badaniu opracowaliśmy prostą i innowacyjną metodę frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy.
Procedura polegała na homogenizacji wypreparowanych tkanek myszy w buforze stabilizującym mikrotubule w stosunku objętościowym 19:1. Homogenaty poddano następnie frakcjonowaniu w dwuetapowym procesie ultrawirowania po wstępnym powolnym wirowaniu (2 400 × g) w celu usunięcia zanieczyszczeń. Pierwszy etap ultrawirowania (100 000 × g) wytrącił stabilne mikrotubule, podczas gdy otrzymany supernatant poddano drugiemu etapowi ultrawirowania (500 000 × g) w celu frakcjonowania labilnych mikrotubul i rozpuszczalnych dimerów tubuliny. Metodą tą określono proporcje tubuliny stanowiącej stabilne lub labilne mikrotubule w mózgu myszy. Ponadto zaobserwowano wyraźne różnice w stabilności mikrotubul w tkankach, które korelowały ze zdolnością proliferacyjną komórek składowych. Odkrycia te podkreślają znaczący potencjał tej nowatorskiej metody do analizy stabilności mikrotubul w stanach fizjologicznych i patologicznych.

Ilościowe oznaczenie tubuliny w frakcjach P2, P3 i S3 z mózgu myszy metodą frakcjonowania MT 
Tubulinę w tkance mysiej rozdzielono na frakcje P2, P3 i S3 za pomocą metody frakcjonowania MT i oznaczono ilościowo metodą Western blotting (Rysunek 1A). Osad MT, który pozostał w frakcji P2 po ultrawirowaniu przy 100,000 × g przez 20 min, stanowił 34,86% ± 1,68% całkowitej zawartości tubuliny w mózgu myszy. Nadosad (S2) poddano dalszemu wirowaniu przy 500,000 × g</...

Mikrotubule, które są polimerami tubuliny, odgrywają kluczową rolę jako składnik cytoszkieletu w komórkach eukariotycznych i są znane ze swojej dynamicznej niestabilności. W badaniu tym opracowano metodę frakcjonowania mikrotubul w celu rozdzielenia ich na stabilne mikrotubule, labilne mikrotubule i wolną tubulinę w celu oceny stabilności mikrotubul w różnych tkankach myszy.

Ilościowa technika frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit ...

Nasz nowy protokół pomaga rozróżnić i określić ilościowo trzy statusy pierścieni probówki, takie jak stabilne mikrotubule, labilne mikrotubule i wolne kanaliki w tkankach zwierzęcych. Technika ta składa się z prostych kroków i może ocenić stabilność strukturalną rurki, której nie można wykryć za pomocą kwantyfikacji rurki po modyfikacji translacyjnej. Metoda ta ma zasadnicze znaczenie dla badań i rozwoju sposobów leczenia chorób, w których stabilność mikrotubul ma kluczowe znaczenie, takich jak choroba Alzheimera i nowotwory.Rozpocznij procedurę od przygotowania odzieży laboratoryjnej do wypreparowania tkanek. Napełnij pudełko pokruszonym lodem i umieść na nim dwie szalki Petriego. Napełnij jedno naczynie lodowatym roztworem buforowym fosforanu lub PBS w celu przejściowego umycia i przechowywania wypreparowanych tkanek.Połóż bibułę filtracyjną zwilżoną PBS na drugim naczyniu. Następnie zważ 1,5-mililitrowe mikroprobówki wypełnione PBS do przechowywania wypreparowanych tkanek. Po pobraniu tkanek od myszy poddanej eutanazji, przenieś je do probówek i ponownie zważ każdą mikroprobówkę.Przenieść tkanki do szklanego homogenizatora z lodowatym buforem stabilizującym mikrotubule lub pożywką MSB+ i natychmiast homogenizować tkankę za pomocą schłodzonego homogenizatora. Teraz przenieś homogenat tkankowy do dwumililitrowej mikroprobówki za pomocą pipety Pasteura i odwiruj przy 2 400 G przez trzy minuty w dwóch stopniach Celsjusza. Przenieś supernatant do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra, aby usunąć zanieczyszczenia.Wiruj supernatant lub frakcję S1 w nowej mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra. Natychmiast odpipetować 200 mikrolitrów frakcji S1 do mikroprobówki wirującej i odwirować przy 100 000 G za pomocą rotora TLA-55 przez 20 minut w temperaturze dwóch stopni Celsjusza. Po drugim odwirowaniu oddzielić supernatant S2 od osadu P2.Natychmiast przenieś całą ilość frakcji S2 do mikroprobówki wirującej i za pomocą wirnika TLA-120.2 wiruj ją z prędkością 500 000 G przez 60 minut w temperaturze dwóch stopni Celsjusza. Po trzecim odwirowaniu oddzielić supernatant S3 od osadu P3. Rozpuść całą frakcję S3 w 200 mikrolitrach 2X dodecylosiarczanu sodu lub buforu próbki SDS.Wymieszać pozostałe frakcje S1 z równą objętością buforu do próbek 2X SDS w celu użycia jako krzywa standardowa do western blot. Następnie dodaj 400 mikrolitrów buforu próbki SDS do probówek frakcji P2 i P3. Następnie krótko poddaj sonikacji roztworu, aby rozpuścić osad przed przeniesieniem próbek do nowych 1,5-mililitrowych mikroprobówek i umieszczeniem ich w zamrażalniku.Gotuj wszystkie próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Mikrotubule we frakcji P2 stanowiły 34,86% całkowitej alfa-tubuliny w mózgu myszy, podczas gdy te we frakcjach P3 i S3 stanowiły odpowiednio 56,13% i 9,01%. Procent tubuliny beta-3 we frakcjach P2, P3 i S3 nie różnił się istotnie od zawartości alfa-tubuliny.Frakcja S2 wykazywała ograniczone przechodzenie tubuliny przez 300-kilodaltonową ultrafiltracyjną kolumnę wirową, podczas gdy frakcja S3 pozwalała na całkowite przejście kompleksów tubulinowych. Separacja chromatograficzna doprowadziła do 100-kilodaltonowej elucji tubuliny S3. W każdej frakcji odzyskano równe proporcje alfa- i beta-tubuliny.Frakcje P2 były istotnie wzbogacone w acetylowaną alfa-tubulinę, natomiast tyrozynowana alfa-tubulina dominowała we frakcji P3. Zamrożenie mózgu przed homogenizacją spowodowało zmniejszenie stężenia alfa-tubuliny we frakcjach P2. Jednak alfa-tubulina zwiększyła się we frakcji P3.Zamrażanie obniżyło również poziom acetylacji i zwiększyło poziom tyrozyny alfa-tubuliny we frakcji P2. Leczenie nokodazolem zmniejszało stężenie alfa-tubuliny we frakcji P2. W przeciwieństwie do zamrażania, nokodazol nie wpływał na potranslacyjne modyfikacje tubuliny P2.Tkanka mózgowa wykazywała istotnie wyższe stężenie tubuliny P2, podczas gdy tubuliny P3 były skoncentrowane w tkance proliferacyjnej. Western blot wykazał, że tubulina P2 specyficznie występująca w układzie nerwowym pochodzi ze stabilnych mikrotubul, a tubulina P3 pochodzi z labilnych mikrotubul. Stabilność mikrotubul jest bardzo dynamiczna.Ważne jest, aby wypełnić ten protokół szybko, bez przerw, w środowisku o niskiej temperaturze. Należy również upewnić się, że tkanki i frakcje nie zostały zamrożone do momentu rozpuszczenia w buforze próbki SDS. Oczekuje się, że połączenie prezentacji immunologicznej przy użyciu każdej frakcji z proteomiką pozwoli zidentyfikować czynniki zaangażowane w dynamikę mikrotubul.Za pomocą tej metody ujawniliśmy, jak normalne jest tau w mikrotubulach. Może być również wykorzystany do badania, w jaki sposób staje się nieprawidłowy w starzejących się mózgach w celu zidentyfikowania nowych celów leków w demencji.

quantitative-microtubule-fractionation-technique-to-separate-stable

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

W tej metodzie prezentujemy procedury biochemiczne do szybkiej i efektywnej izolacji pośrednich białek filamentowych (IF) z wielu tkanek myszy. Izolowane IFs mogą być wykorzystywane do badania zmian w modyfikacjach potranslacyjnych za pomocą spektrometrii mas i innych testów biochemicznych.

Izolacja pośrednich białek filamentowych z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem się

Metody immunoznakowania do analizy różnych populacji mikrotubul w rozwijającym się mózgu danio pręgowanego są tutaj opisane, które mają szerokie zastosowanie do innych tkanek. Pierwszy protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę znakowania immunologicznego stabilnych i dynamicznych mikrotubul. Drugi protokół zapewnia metodę obrazowania i ilościowego oznaczania powstających mikrotubul.

Zastosowanie znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Ten protokół opisuje oczyszczanie tubuliny z małych/średnich źródeł, takich jak hodowane komórki lub pojedyncze mózgi myszy, przy użyciu cykli polimeryzacji i depolimeryzacji. Oczyszczona tubulina jest wzbogacona w określone izotypy lub ma specyficzne modyfikacje potranslacyjne i może być stosowana w testach rekonstytucji in vitro do badania dynamiki i interakcji mikrotubul.

Oczyszczanie tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i izotypami z ograniczonych źródeł przez cykle polimeryzacji-depolimeryzacji

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Przedstawione tutaj są metody przygotowania aktywnych nematyków z mikrotubul i silników kinezynowych, w tym przygotowanie i budowa białek oraz wykorzystanie studni do aktywnego uwięzienia nematycznego.

Formowanie, ograniczanie i obserwacja aktywnych nematyk opartych na mikrotubulach

Ten protokół opisuje technikę wysokowydajnej izolacji tubuliny z mózgu świni, zoptymalizowaną pod kątem oprzyrządowania na małą skalę. Procedury izolacji są uzupełnione procedurami oznaczania aktywności polimeryzacji tubuliny in vitro przy użyciu testów kosedymentacyjnych i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Optymalizacja wydajności tubuliny z tkanki mózgowej świni

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji endogennej tubuliny z komórek ssaków, które mogą nie mieć lub zawierać specyficzne enzymy modyfikujące mikrotubule, w celu uzyskania mikrotubul wzbogaconych o określoną modyfikację. Następnie opisujemy, w jaki sposób wyekstrahowane mikrotubule można ozdobić oczyszczonymi białkami wiążącymi mikrotubule w celu przygotowania siatek do mikroskopii krioelektronowej.

Ekstrakcja zmodyfikowanych mikrotubul z komórek ssaków w celu badania kompleksów mikrotubula-białko za pomocą mikroskopii krioelektronowej

Ten protokół szczegółowo opisuje projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Synteza technik mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania obliczeniowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

Poznaj ilościową technikę frakcjonowania mikrotubul w tkankach myszy, umożliwiającą oddzielenie stabilnych i labilnych mikrotubul oraz wolnej tubuliny. Ta metoda pozwala ocenić stabilność strukturalną mikrotubul, co jest kluczowe dla badań nad chorobami takimi jak Alzheimer i nowotwory.

Ilościowa technika frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowa technika frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy

Przeglądaj więcej filmów