De novo Identyfikacja aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu z danymi profilowania rybosomów
18 lutego 2022
Translacja rybosomów dekoduje trzy nukleotydy na kodon na peptydy. Ich ruch wzdłuż mRNA, wychwycony przez profilowanie rybosomów, wytwarza ślady wykazujące charakterystyczną okresowość trypletową. Protokół ten opisuje, w jaki sposób używać RiboCode do rozszyfrowania tej wyróżniającej się cechy na podstawie danych profilowania rybosomów w celu identyfikacji aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu na poziomie całego transkryptomu.
Interpretacja danych sekwencjonowania wygenerowanych w eksperymencie profilowania rybosomów ma kluczowe znaczenie dla ilościowego pomiaru aktywności translacyjnej rybosomów na mRNA oraz dla badania mechanizmów regulacji translacyjnej. W tym protokole opiszemy procedurę obliczeniową wykorzystującą dane profilowania rybosomów i RiboCode, narzędzie wiersza poleceń do dekodowania translacji mRNA w skali całego genomu i rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Metoda ta pozwala na poszukiwanie nowych peptydów powstających z regionów genomu poza opisanymi genami kodującymi białka i daje możliwość ilościowego określenia szybkości translacji mRNA.
Aby rozpocząć, otwórz okno terminala Linux i utwórz środowisko conda, wykonując polecenie. Przełącz się do utworzonego środowiska i zainstaluj RiboCode oraz zależności, wykonując polecenie. Aby pobrać pliki referencyjne genomu dla sekwencji referencyjnej, przejdź do witryny Ensembl, a następnie kliknij pobierz, a następnie pobierz FTP.
Kliknij opcję FASTA w kolumnie DNA FASTA i wybierz wiersz, w którym gatunkiem jest człowiek, pokazany w tabeli na stronie internetowej. Na stronie internetowej Ensembl skopiuj link, jak wspomniano w tekście, a następnie pobierz i rozpakuj pliki w terminalu, wykonując polecenie. Aby uzyskać adnotację do odwołania, kliknij prawym przyciskiem myszy GTF w kolumnie zestawy genów na ostatniej otwartej stronie internetowej.
Skopiuj link i pobierz go za pomocą polecenia. Aby uzyskać sekwencje rRNA, otwórz przeglądarkę genomu UCSC, a następnie kliknij narzędzia i wybierz przeglądarkę tabel z listy rozwijanej. Na stronie przeglądarki genomu UCSC określ ssak dla kladu, człowiek dla genomu, wszystkie tabele dla grupy, maskę R dla tabeli i genom dla regionu.
W przypadku filtru kliknij przycisk utwórz, aby przejść do nowej strony, a następnie ustaw klasę rep zgodnie z dopasowaniem rRNA. Kliknij przycisk Prześlij, a następnie ustaw format wyjściowy na sekwencję, a nazwę pliku wyjściowego jako HG38_rRNA. FA. Na koniec kliknij pobierz wyjście, a następnie wybierz pobierz sekwencję, aby pobrać sekwencję rRNA.
Aby uzyskać zestawy danych profilowania rybosomów z archiwum odczytu sekwencji, pobierz replikowane próbki grupy traktowanej si-eIFe i zmień ich nazwy, wykonując polecenie. Następnie pobierz replikowane próbki grupy kontrolnej i zmień ich nazwy, wykonując polecenie. Aby usunąć zanieczyszczenie rRNA, rozpocznij indeksowanie sekwencji referencyjnych rRNA, wykonując polecenie.
Po indeksowaniu wyrównaj odczyty do odwołania rRNA, aby wykluczyć odczyty pochodzące z rRNA, wykonując polecenie. Zacznij od utworzenia indeksu genomu, wykonując polecenie. Następnie wyrównaj czyste odczyty bez zanieczyszczenia rRNA do utworzonego odniesienia, wykonując polecenie, a następnie posortuj i zindeksuj pliki wyrównania, wykonując polecenie.
Przygotuj adnotacje transkrypcji, wykonując polecenie. Wybierz fragmenty chronione rybosomem o określonych długościach i zidentyfikuj ich położenie w miejscu P, wykonując polecenie. Edytuj pliki konfiguracyjne dla każdej próbki i scal je.
Następnie uruchom RiboCode, wykonując polecenie. Rozkład częstotliwości długości odczytów wykazał, że większość fragmentów chronionych rybosomem odpowiada 25 do 35 nukleotydom. Lokalizacje miejsc P dla różnych długości fragmentów chronionych rybosomem zostały określone poprzez zbadanie odległości od ich pięciu pierwszych końców do opisanych kodonów start i stop.
Wyniki mapowania pokazują, że 10 394 geny kodują otwarte ramki odczytu z adnotacjami. Co więcej, geny 509 i 168 kodują otwarte ramki odczytu w górę i w dół, podczas gdy 939 genów koduje otwarte ramki odczytu w górę lub w dół, pokrywające się ze znanymi otwartymi ramkami odczytu z adnotacjami. Co więcej, 68 genów kodujących białka i 2 601 genów niekodujących koduje nowe, otwarte ramki odczytu.
Rozkład długości wykazał, że otwarte ramki odczytu w górę, w dół, w powieści i nakładające się na siebie otwarte ramki do czytania były krótsze niż otwarte ramki do czytania z adnotacjami. Względną liczbę fragmentów chronionych rybosomem obliczono dla każdej otwartej ramki odczytu, ujawniając, że gęstości rybosomów w górę otwartych ramek odczytu były znacznie wyższe w komórkach z niedoborem eIF3e niż w komórkach kontrolnych. Analiza metagenu wykazała, że masa rybosomów utknęła między kodonami 25 i 75 poniżej kodonu start, co sugeruje, że wydłużenie translacji może zostać zablokowane wcześnie w komórkach z niedoborem eIF3e.
Zbadano profile gęstości miejsc P dla otwartych ramek odczytu PSMA6 i dalszych otwartych ramek odczytu genu SENP3-EIF4A1, demonstrując wzorce okresowości i gęstości fragmentów chronionych rybosomem. Sprawdzanie lokalizacji odczytów wokół kodonów start i stop znanych regionów kodujących białka jest niezbędne do oceny właściwości okresowych odczytów dla każdej długości. RiboCode, wraz z innym narzędziem wiersza poleceń, RiboMiner może również przeprowadzać kontrolę jakości i wiele analiz, takich jak kwantyfikacja i wizualizacja zajętości rybosomów w przewidywanych otwartych ramkach odczytu.
To narzędzie obliczeniowe zapewnia wysoce przepustowy sposób identyfikacji niekanonicznych zdarzeń translacji za pomocą danych profilowania rybosomów w określonych kontekstach fizjologicznych oraz sposobu, w jaki translacja moduluje się w odpowiedzi na bodziec.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje obliczeniową interpretację danych z profilowania rybosomów w celu lepszego zrozumienia regulacji translacji mRNA. Dzięki zastosowaniu programu RiboCode badacze mogą identyfikować aktywnie translacyjne otwarte ramki odczytu (ORF) w skali całego genomu, co pozwala na odkrycie informacji na temat peptydów niekanonicznych oraz dynamiki ich translacji.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Regulacja translacji
- Ekspresja genów
- Biologia obliczeniowa
Wprowadzenie
- Profilowanie rybosomów pozwala na ilościową ocenę aktywności rybosomalnej na mRNA.
- Zrozumienie dynamiki translacji dostarcza kluczowych informacji na temat regulacji genów.
- Celem badania jest wykorzystanie metody RiboCode do analizy translacji w obrębie całego genomu.
Zastosowane metody
- Eksperymenty z profilowaniem rybosomów w celu zgromadzenia danych sekwencyjnych.
- Wykorzystanie narzędzia RiboCode do dekodowania translacji mRNA.
- Analiza fragmentów chronionych przez rybosomy oraz pozycji witryny P w celu zbadania dynamiki translacji.
Główne wyniki
- Identyfikacja 10 394 genów z adnotowanymi ORF oraz różnorodnych nowych zdarzeń translacyjnych.
- Zwiększona gęstość rybosomów w upstream ORF w komórkach z niedoborem eIF3e w porównaniu z kontrolą.
- Zahamowana elongacja translacji zaobserwowana w określonych genach, wyróżniona przez profile gęstości w miejscu P.
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje skuteczność narzędzia RiboCode w analizie danych z profilowania rybosomów w celu odkrywania nowych zdarzeń translacyjnych.
- Zwraca uwagę na znaczenie modulacji translacyjnej w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Profilowanie rybosomów umożliwia detekcję aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu w całym genomie, co wspiera walidację celów poprzez ujawnianie zdarzeń translacyjnych zależnych od kontekstu. RiboCode zapewnia skalowalny przepływ pracy obliczeniowej w celu identyfikacji nowych peptydów i ilościowego określenia zajętości rybosomów, co pomaga w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego na wczesnym etapie odkrywania. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących kandydatów poprzez powiązanie aktywności translacyjnej z bodźcami fizjologicznymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wykrywanie aktywnie tłumaczonych ORF w określonych kontekstach fizjologicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez identyfikację funkcjonalnych zdarzeń translacyjnych poza adnotowanymi regionami kodującymi.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do celu terapeutycznego poprzez powiązanie zmian gęstości rybosomów z perturbacjami genetycznymi, takimi jak niedobór eIF3e.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych analiz przesiewowych poprzez mapowanie gęstości fragmentów chronionych przez rybosomy w obrębie ORF.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testu poprzez kwantyfikację względnej liczby fragmentów chronionych przez rybosomy na ORF.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez ujawnienie wzorców periodyczności i profili gęstości w obrębie P-site, które świadczą o aktywnej translacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na dopasowanie do systemów istotnych dla przebiegu choroby poprzez identyfikację modulacji translacji w odpowiedzi na bodźce.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki wizualizacji zajętości rybosomów.
- Wartość naukowa: Pomaga w podejmowaniu decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka, wskazując na zahamowaną elongację translacji jako mechanizm regulacyjny.
Integracja potoku i przepływu pracy
RiboCode integruje się z procesem odkrywania leków, od wczesnej walidacji punktów uchwytu po identyfikację wiodących związków, dostarczając odczyty translacji w skali całego genomu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez identyfikację nowych zdarzeń translacyjnych w regionach niekodujących.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz dzięki kwantyfikacji i wizualizacji zajętości rybosomów na przewidywanych ORF.
- Analityka: Umożliwia pomiary ilościowe zmiennych zależnych, takich jak gęstość rybosomów i periodyczność miejsca P, w celu analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez powiązanie dynamiki translacji z bodźcami fizjologicznymi, takimi jak niedobór eIF3e.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma obliczeniowa do analizy danych z profilowania rybosomów w wielu kontekstach eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki detekcji aktywnie translacyjnych ORF oraz kwantyfikacji tempa translacji.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki usprawnionemu procesowi przetwarzania danych od surowych danych do zinterpretowanych plików wyjściowych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w walidacji celu.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o dowody translacyjne w kontekstach istotnych dla choroby.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biologii obliczeniowej oraz interpretacji danych z profilowania rybosomów.
- Zależne od dostępu do referencyjnych plików genomu, baz adnotacji oraz zasobów sekwencji rRNA.
- Wymaga standaryzacji plików konfiguracyjnych oraz parametrów wyboru długości odczytów pomiędzy zespołami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania potoku analitycznego przy zastosowaniu go w różnych systemach modelowych lub warunkach stymulacji.
- Ograniczenie praktyczne: Efektywna identyfikacja translacyjnych ORF pozostaje wyzwaniem ze względu na zniekształcone i niejednoznaczne sygnały w danych z profilowania rybosomów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:01
Environment Setup and RiboCode Installation
1:23
Data Preparation
3:35
Removing Ribosomal RNA Contamination
3:59
Aligning the Clean Reads to the Genome
4:25
Size Selection of Ribosome Protected Fragments, Identification of P-Sites, and De novo Annotate Translating Open Reading Frames
4:59
Results: Identification of the Novel Open Reding Frames (ORFs) with the Application of RiboCode
7:20
Conclusion
