Name: Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Poznaj nieinwazyjne metody lokalizacji białek fotoreceptorowych w oku złożonym Drosophila przy użyciu eGFP. Techniki te pozwalają badać transport białek i degenerację siatkówki, dostarczając wiedzy o dziedzicznych chorobach prowadzących do ślepoty u ludzi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować naszym studentom badaczom za te wszystkie lata. W szczególności Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim i Laura Jaggy, których dane zostały wykorzystane w tym protokole jako reprezentatywne wyniki. Prezentowane tu badania naszej grupy zostały sfinansowane z grantów Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) dla Armina Hubera.

<ol><li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration.+9%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31(2014).</li>
<li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li>
<li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li>
<li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration%3A+lessons+from+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li>
<li>Bähner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li>
<li>Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li>
<li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).</li>
<li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li>
<li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li>
<li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+ph%C3%A9nom%C3%A9nes+de+pseudopupille+dans+l%27oeil+compose+de+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Kybernetik%22%5BJournal%5D)">Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li>
<li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li>
<li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li>
<li>Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2005).</li>
<li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li>
<li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li>
<li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925(2015).</li>
<li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li>
<li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070(2020).</li>
<li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578(2015).</li>
<li>Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2007).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li>
<li>Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li>
<li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4%2C5+bisphosphate+%28PIP2%29+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie białek fluorescencyjnych i prostota badań przesiewowych za pomocą obrazowania DPP i mikroskopii zanurzeniowej siatkówki w wodzie okazały się skuteczne w wielu grupach12. Strategie podobne do tych przedstawionych tutaj zostały wykorzystane w kilku genetycznych badaniach przesiewowych w celu wykrycia defektów w poziomach ekspresji rodopsyny, homeostazie, organizacji siatkówki lub integralności komórkowej za pomocą Rh1::eGFP 17,18,19,20,21.<sup class="x...

Poprzez dostarczanie i usuwanie białek z błony plazmatycznej, transport białek błonowych w neuronach kontroluje wyposażenie błony plazmatycznej w receptory oraz kanały jonowe i w konsekwencji reguluje funkcje neuronalne. Nieprawidłowości lub defekty w transporcie białek zazwyczaj wywierają szkodliwy wpływ na komórki i prowadzą do degeneracji neuronów. U ludzi może to powodować choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera i Parkinsona lub Retinitis pigmentosa1. Fotoreceptory w złożonym oku Drosophila melanogaster stały się modelem in vivo do badania transportu białek błonowych2. Wynika to nie tylko z wszechstronności genetycznej Drosophila, która umożliwia efektywne przesiewy genetyczne, ale także z faktu, że wszystkie kluczowe składniki absorbującej światło błony fotoreceptorów zostały szczegółowo scharakteryzowane, a do dyspozycji są wydajne techniki mikroskopowe, które można zastosować w oku muchy. Techniki te stanowią główny temat niniejszego artykułu.
W komórkach fotoreceptorowych Drosophila apikalna błona plazmatyczna tworzy gęsto upakowany stos mikrokosmków wzdłuż jednej strony komórki, nazywany rabdomerem. Rabdomery komórek fotoreceptorowych R1-6 są rozmieszczone w charakterystycznym wzorze trapezoidalnym, podczas gdy komórki fotoreceptorowe R7 i R8 tworzą pojedynczy rabdomer w centrum tego trapezu3. Transport białek błonowych jest niezbędny do regulowanej wymiany białek błony rabdomeralnej, takich jak rhodopsina oraz aktywowane światłem kanały jonowe TRP (transient receptor potential) i TRPL (TRP-like), aby zapewnić odpowiednią ilość tych białek fototransdukcyjnych w rabdomerze. Białka błonowe fotoreceptorów są syntetyzowane w retikulum endoplazmatycznym i transportowane via aparat Golgiego do rabdomeru. Po aktywacji rhodopsiny przez światło, cząsteczka rhodopsiny może zostać albo dezaktywowana przez absorpcję drugiego fotonu, albo usunięta z rabdomeru poprzez endocytozę zależną od klatryny. Zendocytowana rhodopsina ulega degradacji w lizosomie lub jest recyklowana z powrotem do rabdomeru4,5. Kanał jonowy TRPL jest również internalizowany po aktywacji kaskady fototransdukcyjnej i przechodzi zależną od światła translokację pomiędzy rabdomerem (gdzie znajduje się, gdy muchy są trzymane w ciemności) a wzbogaconym w ER przedziałem magazynowym w ciele komórki (do którego jest transportowany w ciągu kilku godzin po naświetleniu)6,7,8,9,10. W przeciwieństwie do zendocytowanej rhodopsiny, tylko niewielkie ilości TRPL są degradowane via szlak endolizosomalny, a większość jest zamiast tego magazynowana wewnątrzkomórkowo i recyklowana do rabdomeru podczas adaptacji do ciemności6. TRPL może zatem służyć do analizy wyzwalanego światłem transportu białek błony plazmatycznej. Komórki fotoreceptorowe Drosophila są również wykorzystywane do badania degeneracji neuronów. Degenerację komórek fotoreceptorowych często określa się poprzez ocenę struktury rabdomerów, które ulegają rozpadowi w wyniku procesów degeneracyjnych5.
W celu zbadania lokalizacji subkomórkowej TRPL i rodopsyny w komórkach fotoreceptorowych lub degeneracji komórek fotoreceptorowych zastosowano tutaj dwie metody mikroskopii fluorescencyjnej, które różnią się pod względem szybkości analizy i rozdzielczości. Bardzo szybką, nieinwazyjną metodą, którą można wykorzystać do przesiewów genetycznych, ale która charakteryzuje się ograniczoną rozdzielczością przestrzenną, jest detekcja fluorescencji w głębokiej pseud źrenicy (DPP). DPP jest zjawiskiem optycznym występującym w złożonych oczach stawonogów, którego geneza geometryczna została szczegółowo wyjaśniona przez Franceschini i Kirschfeld w 1971 roku11. Mówiąc krótko, na kilku płaszczyznach optycznych poniżej siatkówki można zaobserwować nałożone obrazy rabdomer z sąsiednich ommatidiów. Na płaszczyźnie ogniskowej przechodzącej przez środek krzywizny oka te nałożone projekcje tworzą obraz przypominający trapezowy układ rabdomer w pojedynczym ommatidium, lecz o wiele większy. Zjawisko to można zaobserwować również niezależnie od egzogennej ekspresji białek fluorescencyjnych (np. TRPL::eGFP8), które niemniej jednak ułatwiają detekcję DPP (Rysunek 1A-A'')12. Drugą nieinwazyjną metodą jest mikroskopia z immersją w wodzie, która polega na obrazowaniu białek znakowanych fluorescencyjnie po optycznym zneutralizowaniu aparatu dioptrycznego oczu za pomocą wody (Rysunek 1B-C'')12. Wykorzystując metodę immersji w wodzie, można ilościowo ocenić wzglelną ilość TRPL::eGFP w rabdomerach lub ciele komórki dla poszczególnych komórek fotoreceptorowych. Ponadto białka znakowane fluorescencyjnie, które nie ulegają translokacji, mogą być wykorzystane do oceny integralności rabdomer oraz do ilościowego określenia przebiegu potencjalnej degeneracji, zgodnie z opisem przedstawionym w niniejszej pracy.
Choć rejestracja DPP jest zdecydowanie najłatwiejszą i najszybszą z tych metod, rozdzielczość przestrzenna generowanych przez nią danych jest ograniczona. Ponadto istnieje wiele powodów, dla których DPP może nie występować, co nie zawsze jest możliwe do zidentyfikowania za pomocą samego obrazowania DPP. Ponieważ DPP stanowi sumę kilku ommatidiów, informacje o poszczególnych komórkach ulegają utracie. W związku z tym obrazowanie DPP o niskiej rozdzielczości pełni istotną funkcję w przesiewaniu dużych liczb much, jednak zazwyczaj powinno być uzupełnione zapisami o wyższej rozdzielczości wykonanymi za pomocą mikroskopii immersyjnej w wodzie. Mikrografie z immersji w wodzie pozwalają na interpretację stanu poszczególnych komórek, wad rozwojowych, morfologii oka, błędnej lokalizacji białek lub degeneracji siatkówki, a także na ilościową ocenę tych efektów. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje obie te techniki.
<img alt="Obrazowanie DPP za pomocą zestawów mikroskopowych: letalne zanurzenie w wodzie, nieletalne; eksperyment, wyniki fluorescencyjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd wariantów mikroskopii dla oka Drosophila przedstawionych w niniejszym protokole. Schematyczne przedstawienia i przykładowe mikrografie (A-A'') fluorescencyjnego obrazowania głębokiej pseudozrenicy (DPP), (B-B'') letalnej mikroskopii zanurzeniowej w wodzie dla fluorescencyjnych rabdomerów oraz (C-C'') nieletalnej mikroskopii kropli wody dla fluorescencyjnych rabdomerów. Pasek skali (A''): 100 µm. Paski skali (B''-C''): 10 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie referencji13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka anestezjologiczna CO2</td><td>Flystuff</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Lampa światła zimnego (KL 1500 LCD)</td><td>Zeiss</td> Fiji/ImageJ NIH Mikroskop fluorescencyjny z lampą <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> UV, kamerą, zestawem filtrów i oprogramowaniem (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 niebieski <td></td><td></td></tr><tr><td> edycja)</td>Świetlówka <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 &mikro; W cm-2, Ee590nm = 215 &mikro; W cm-2] oraz [760 luksów, Ee470nm = 173 &mikro; W cm-2, Ee590nm = 147 &mikro; W cm-2]</td><td>Pipeta laboratoryjna Osram</td><td>4050300518039</td><td></td></tr><tr><td>(20-200 &micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prowadnica obiektowa</td><td>Roth</td><td>0656.1</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (94 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (200 &mikro; L)</td><td>Labsolute</td><td>7695844</td><td></td></tr><tr><td>Plastelina (Blu-Tack)</td><td>Mikroskop stereoskopowy Bostik</td><td>30811745</td><td></td></tr><tr><td>(SMZ445)</td>Mikroskop stereoskopowy <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>z lampą UV, aparatem, zestawem filtrów i oprogramowaniem (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych drosophila przy użyciu białek znakowanych egfp

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Handel białkami błonowymi reguluje włączanie i usuwanie receptorów i kanałów jonowych do błony plazmatycznej. Proces ten ma fundamentalne znaczenie dla funkcji komórek i integralności komórek neuronów. Komórki fotoreceptorowe Drosophila stały się modelem do badania transportu białek błonowych. Oprócz rodopsyny, która po oświetleniu zostaje zinternalizowana z błony fotoreceptora i ulega degradacji, przejściowy kanał jonowy podobny do receptora (TRPL) u Drosophila wykazuje zależną od światła translokację między błoną fotoreceptora rabdomeralnego (gdzie znajduje się w ciemności) a ciałem komórki fotoreceptora (do którego jest transportowany po oświetleniu). Ten wewnątrzkomórkowy transport TRPL można badać w prosty i nieinwazyjny sposób poprzez ekspresję TRPL znakowanego eGFP w komórkach fotoreceptorów. Fluorescencję eGFP można następnie zaobserwować albo w głębokiej pseudoźrenicy, albo za pomocą mikroskopii zanurzeniowej w wodzie. Metody te umożliwiają wykrywanie fluorescencji w nienaruszonym oku i dlatego są przydatne w wysokoprzepustowych testach i genetycznych badaniach przesiewowych pod kątem mutantów Drosophila z wadami translokacji TRPL. Tutaj szczegółowo wyjaśniono przygotowanie much, techniki mikroskopowe, a także metody kwantyfikacji stosowane do badania tej wyzwalanej światłem translokacji TRPL. Metody te mogą być również stosowane w badaniach nad transportem innych białek fotoreceptorowych Drosophila, na przykład rodopsyny. Ponadto, dzięki zastosowaniu białek rabdomeralnych znakowanych eGFP, metody te mogą być stosowane do oceny degeneracji komórek fotoreceptorowych.

Wygenerowano transgeniczne muchy Drosophila wykazujące ekspresję białka fuzyjnego TRPL::eGFP pod kontrolą promotora rhodopsyny 1. U tych much TRPL::eGFP jest wyrażany w komórkach fotoreceptorowych R1-6 oka złożonego i wykazuje lokalizację zależną od oświetlenia. Gdy muchy są trzymane w ciemności, TRPL::eGFP jest wbudowany w zewnętrzne rhabdomery. Po kilkugodzinnym naświetlaniu TRPL przemieszcza się do ciała komórki, gdzie jest przechowywany w przedziale wzbogaconym w ER8,<sup c...

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

Białka fotoreceptorowe znakowane GFP, takie jak kanał jonowy TRPL GFP, pozwalają nam badać transport białek w neuronach przy użyciu technik nieinwazyjnych. Metoda ta może być również stosowana do monitorowania zwyrodnienia fotoreceptorów. W ten sposób molekularne podstawy chorób dziedzicznych prowadzących do ślepoty u ludzi można badać w oku Drosophila.Lokalizację komórkową białek znakowanych GFP można ocenić, obserwując fluorescencję w głębokiej pseudoźrenicy lub mikroskopię zanurzeniową w wodzie. Obie metody pozwalają na szybkie określenie lokalizacji białek wzrokowych i obserwację defektów strukturalnych rabdomore spowodowanych degeneracją komórek fotoreceptorowych. Aby uzyskać wysokiej jakości obrazy, najważniejszym aspektem jest orientacja oka muchy.Wykonując tę technikę, należy skupić się na ommatidiach położonych nieco w kierunku obrzeża oka. Ja będę demonstrować procedurę obrazowania DPP, natomiast dwie techniki wykorzystujące mikroskopię zanurzeniową w wodzie zademonstrują moja koleżanka, dr Krystina Wagner i Matthias Zeger, doktorant z naszej grupy. Aby rozpocząć obrazowanie głębokiej pseudoźrenicy (DPP), znieczulij muchy w wieku od jednego do trzech dni i umieść jedną z nich w środku obiektywu mikroskopu na boku, tak aby lewe lub prawe oko było skierowane dokładnie promieniście w stronę obiektywu.Zwiększ powiększenie, aby dopasować je do całego oka i wyśrodkuj centralną ommatidię oka. Jeśli to możliwe, zmniejsz głębię ostrości mikroskopu, ustawiając płytkie ustawienie przysłony z podwójną przysłoną. Następnie włącz lampę UV mikroskopu z maksymalną intensywnością.Następnie wybierz zestaw filtrów fluorescencyjnych mikroskopu zgodnie z białkiem fluorescencyjnym wyrażonym w oczach i ustaw ścieżkę światła w kierunku kamery zamontowanej w mikroskopie. Korzystając z funkcji obrazowania na żywo w oprogramowaniu, dostosuj jasność obrazu do ustawienia, które wykrywa tylko określone sygnały z oka, zwiększając czas ekspozycji i wartość wzmocnienia. Ponownie ustaw ostrość mikroskopu w oku, aby wygenerować nałożony obraz DPP.Następnie zrób zdjęcie fluorescencyjnego DPP. Aby przygotować muchę w śmiertelnej odmianie, przyklej kawałek plasteliny do szkiełka przedmiotowego, a drugi kawałek do środka szalki Petriego. Napełnij szalkę Petriego lodowatą wodą destylowaną i kilkoma płatkami lodu.Następnie umieść jedną znieczuloną lodem muchę pod mikroskopem stereoskopowym na szkiełku pokrytym plasteliną. Obróć muchę na plecy i przebij szpilkę owada przez środek klatki piersiowej. Zamocuj szpilkę poziomo na szkiełku pokrytym plasteliną i skieruj lewe lub prawe oko muchy w górę.Następnie ostrożnie zamocuj szkiełko przedmiotowe stroną wolną od plasteliny skierowaną w dół na szalce Petriego, zapobiegając obracaniu się głowicy muchy. Upewnij się, że oko muchy jest pokryte wodą. Alternatywnie, aby przygotować muchę w odmianie nieśmiertelnej, przenieś znieczuloną lodem muchę głową do przodu do końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i ostrożnie popchnij muchę w kierunku końcówki za pomocą sprężonego powietrza.Następnie za pomocą skalpela odcinamy końcówkę pipety tuż przed głowicą i za pomocą pęsety ostrożnie wepchnij muchę na kilka milimetrów w końcówkę pipety. Ponownie odetnij końcówkę pipety i popchnij muchę z powrotem w kierunku końcówki za pomocą sprężonego powietrza, tak aby tylko główka muchy wystawała z końcówki pipety. Po przyklejeniu kawałka plasteliny do szkiełka podstawowego, wciśnij w niego końcówkę pipety tak, aby lewe lub prawe oko było skierowane do góry.Upewnij się, że oko jest prawidłowo zorientowane pod mikroskopem. Aby uzyskać zdjęcie, wybierz obiektyw zanurzony w wodzie. W przypadku odmiany nieśmiertelnej należy użyć pipety laboratoryjnej, aby przykleić dużą kroplę schłodzonej wody do spodu obiektywu zanurzeniowego w wodzie.Ostrożnie umieść szkiełko z przygotowanym muchą na stoliku mikroskopu. Następnie ręcznie opuść obiektyw zanurzony w wodzie, aż zetknie się z powierzchnią wody lub oko muchy dotknie kropli. Następnie przełącz ścieżkę światła w kierunku kamery mikroskopu i wygeneruj obraz na żywo.Ponownie ustaw ostrość dla aparatu i oceń orientację oka, biorąc pod uwagę, że oko musi być skierowane promieniowo do obiektywu mikroskopu. Użyj oprogramowania tabeli przeglądowej, aby wykryć przesycenie. W przypadku much niepigmentowanych dostosuj czas ekspozycji tak, aby najjaśniejsze piksele znajdowały się tuż poniżej limitu nasycenia dla każdego obrazu.Nagraj obraz i zapisz go jako plik RAW, aby zarchiwizować wszystkie odpowiednie metadane nagrania. Następnie wyeksportuj obraz w formacie tif. Aby określić ilościowo względną fluorescencję eGFP w rabdomore mikrofotografii zanurzonych w wodzie, dostosuj ustawienia ImageJ, klikając Analizuj, a następnie Ustaw pomiary i zaznacz tylko pole Średnia wartość szarości.Zaimportuj obraz tif, klikając Plik, a następnie Otwórz. Wybierz reprezentatywny obszar obrazu, na którym ustawiona jest ostrość, i powiększ go do 200 do 300%, kilkakrotnie naciskając Control i razem. Następnie wybierz narzędzie Owal i naciskając Shift, wygeneruj okrągłe zaznaczenie na obrazie, które jest znacznie mniejsze niż jedna rabdomora fluorescencyjna.Następnie poszukaj dokładnego rozmiaru wyświetlanego pod paskiem narzędzi w oknie głównym ImageJ. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji w zaznaczeniu kołowym, przesuń okrąg do pierwszego rabdomeru za pomocą strzałek na klawiaturze, a następnie kliknij Analizuj, a następnie Zmierz. Pojawi się okno wyników z listą zmierzonej wartości szarości.Kontynuuj pomiary rabdomore od dwóch do sześciu, a także zmierz sygnał tła. W przypadku much niepigmentowanych należy wykonać dodatkowe pomiary odpowiednich obszarów ciała komórki. Zmierz fluorescencję dwóch kolejnych ommatidiów, co daje trzy kontrpróby techniczne.Zaznacz analizowaną ommatidię za pomocą narzędzia Ołówek i zapisz ten obraz do dokumentacji. Wybierz i skopiuj zmierzone wartości szarości z okna wyników, a następnie wklej je do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszych obliczeń. Posortuj wartości intensywności fluorescencji według ich pochodzenia w kategoriach rabdomera, ciało komórki i tło, a następnie oblicz średnią intensywność z każdej kategorii.Następnie oblicz względną ilość eGFP obecnego w rabdomerze, używając pierwszego wzoru dla oczu bez pigmentacji, a drugiego dla oczu pigmentowanych. Alternatywnie, aby określić ilościowo morfologię oka za pomocą fluorescencji eGFP na mikrofotografiach zanurzonych w wodzie, wybierz trzy sąsiadujące ze sobą ommatidia w reprezentatywnym regionie obrazu, który jest ostry. Oceń 18 rabdomore wyboru indywidualnie zgodnie z ich intensywnością eGFP, ostrością krawędzi i kontrastem w stosunku do otaczającego sygnału tła.Na koniec należy ocenić wyraźnie widoczne rabdomory o wartości dwóch, tygodniowe widoczne rabdomory o wartości jednego i nieobecne rabdomory o wartości zero, aby wygenerować indeks zwyrodnienia. U transgenicznych muszek Drosophila wykazujących ekspresję białka fuzyjnego eGFP TRPL, fluorescencja rabdomeralna zanika w świetle z powodu translokacji eGFP TRPL. Pozwala to na przeprowadzenie genetycznego badania przesiewowego w celu zidentyfikowania mutantów wadliwych w internalizacji eGFP TRPL.U muszek kontrolnych eGFP TRPL przemieszcza się z rabdomore do ciała komórki po 16 godzinach oświetlenia, co powoduje znaczny spadek fluorescencji rabdomeralnej w porównaniu ze stanem przystosowanym do ciemności. Druga ciemna inkubacja ponownie podnosi fluorescencję rabdomeralną w kierunku wartości początkowej. Jednak w przypadku wadliwego mutanta vps35MH20 z ubytkiem translokacji TRPL wzór fluorescencji nie zmienia się drastycznie po 16 godzinach oświetlenia i późniejszej adaptacji do ciemności przez 24 godziny.Ta metoda kwantyfikacji może wykryć statystycznie wysoce istotną wadę recyklingu. Muchy białookie umożliwiają wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych zarówno z rabdomeru, jak i ciała komórki. W przeciwieństwie do tego, u czerwonookiej muchy, sygnały fluorescencyjne są wykrywalne tylko w rabdomere, ale nie w ciele komórki.Jeśli chodzi o kwantyfikację zwyrodnienia siatkówki, fluorescencję eGFP TRP można ocenić w ciągu kilku tygodni. Gdy był trzymany w 12-godzinnym cyklu światła i 12-godzinnej ciemności przez dwa tygodnie, wskaźnik degeneracji zmniejszył się u zmutowanych much, ale nie u much kontrolnych. W tym protokole należy rozróżnić oczy pigmentowane i niepigmentowane.Ponieważ pigmentacja wpływa na sygnał fluorescencyjny, ilościowa mikroskopia zanurzeniowa w wodzie została zoptymalizowana indywidualnie dla obu przypadków. Obrazowanie DPP i mikroskopia zanurzeniowa w wodzie to metody wysokoprzepustowe o ograniczonej rozdzielczości. W celu zbadania lokalizacji subkomórkowej zalecamy mikroskopię immunofluorescencyjną na skrawkach tkanek.W celu szczegółowej analizy fenotypów zwyrodnieniowych można przeprowadzić mikroskopię elektronową.

studying-membrane-protein-trafficking-drosophila-photoreceptor-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Niniejszy raport opisuje zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz technik fotowybielania w celu określenia ekspresji powierzchniowej, szlaków transportu i kinetyki ruchu egzogennych białek znakowanych pH-wrażliwym białkiem GFP w błonie plazmatycznej neuronów.

Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Źródło: Wagner, K.  i inni., Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia wizualizację transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu białek TRPL znakowanych eGFP. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie transgenicznych muszek do obrazowania, przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych komórek fotoreceptorowych oraz ilościowe określenie transportu TRPL...

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Opisano protokół obrazowania na żywo białek lub struktur autofluorescencyjnych oznaczonych GFP w pojedynczych oocytach Drosophila.

Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Podczas gdy transport białek na powierzchni komórki jest stosunkowo łatwy do zbadania, wizualizacja transportu białek wewnątrzkomórkowych jest znacznie trudniejsza. Tutaj używamy konstruktów zawierających fotoaktywowany GFP i demonstrujemy metodę dokładnego śledzenia białka prekursorowego amyloidu z aparatu Golgiego do dalszych przedziałów i śledzenia jego klirensu.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego transportu APP za pomocą fotoaktywowalnego GFP

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Poznaj nieinwazyjne metody lokalizacji białek fotoreceptorowych w oku złożonym Drosophila przy użyciu eGFP. Techniki te pozwalają badać transport białek i degenerację siatkówki, dostarczając wiedzy o dziedzicznych chorobach prowadzących do ślepoty u ludzi.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Przeglądaj więcej filmów