Zbiorcze badania przesiewowe biblioteki shRNA w celu identyfikacji czynników modulujących fenotyp oporności na leki

Ogólnym celem poniższego filmu jest zademonstrowanie wykorzystania zbiorczej biblioteki epigenetycznej shRNA do przeprowadzenia negatywnego badania przesiewowego. To badanie przesiewowe umożliwia identyfikację określonych celów epigenetycznych poprzez sekwencjonowanie. Procedura ta może pomóc w identyfikacji czynników epigenetycznych odpowiedzialnych za pośredniczenie w nabytej oporności na cytarabinę w AML Kroki są następujące.

Wybór najsilniejszego promotora w celu uzyskania trwałej i przedłużonej ekspresji shRNA. Obecny protokół koncentruje się na badaniach przesiewowych RNAi przy użyciu biblioteki czynnika epigenetycznego shRNA w linii komórkowej MV4-11 opornej na cytarabinę. Promotorami stosowanymi w tym celu są ludzki EF-1 alfa, ludzki CMV i SFFV, promotory wyrażające białko zielonej fluorescencji.

Zlicz komórki, stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego. Zawieś komórki w pożywce 10% RPMI zawierającej 8 mikrogramów na ml polibrenu. Wysiewać 1 milion komórek w 1,5 ml pożywki na dołek sześciodołkowej płytki w trzech powtórzeniach.

Dodać różne objętości skoncentrowanych lentiwirusów. Na przykład lentiwirusy, na przykład 10, 20 i 40 mikrolitrów, w zależności od miana lentiwirusów do każdej studzienki. Delikatnie zakręć talerzem, aby wymieszać zawartość.

Przeprowadzić dezynfekcję przez odwirowanie w temperaturze 920 g w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut. Natychmiast inkubować płytki w inkubatorze dwutlenku węgla. Przestrzegać zwykłej praktyki rolniczej po upływie 48 godzin i określić ją ilościowo po upływie 72 godzin.

Następnie postępuj zgodnie z krokami przedstawionymi na schemacie blokowym, aby wybrać promotora wykazującego spójne wyrażenie GFP w całej kulturze. Przygotowanie zbiorczej biblioteki ludzkich czynników epigenetycznych shRNA lentiwirusowych. Hoduj komórki 293T o niskiej liczbie pasażowania z dobrym tempem proliferacji w trzech 10-centymetrowych szalkach do hodowli komórkowych z 8 ml 10% pożywki DMFM na każdej płytce.

Gdy komórki osiągną 60% zbieżności, całkowicie zastąp je świeżą pożywką. Przygotować mieszaninę do transfekcji zgodnie z opisem, która zawiera pożywkę bez surowicy, plazmid PAX2 do pakowania lentiwirusa, plazmid otoczkowy pMD2. G, połączone plazmidy biblioteczne, a na końcu odczynnik do transfekcji.

Stuknij mieszaninę, aby dobrze ją wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodaj mieszaninę transfekcji do komórek 293T i delikatnie wymieszaj, obracając płytki. Inkubować płytki w inkubatorze dwutlenku węgla.

Zmień podłoże po 24 godzinach. Po 48 godzinach sprawdź ekspresję GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zapewnić wysoką skuteczność transfekcji do komórek 293T. Zebrać supernatanty wirusa po 48, 60 i 72 godzinach i przechowywać je w temperaturze 4 stopni, a następnie dodawać świeżą pożywkę, 8 ml, w każdym punkcie czasowym po zebraniu wirusa.

Przefiltruj wirusy w puli za pomocą filtra 0,4 mikrona. W celu uzyskania wysokiego miana wirusów, należy skoncentrować zebrane wirusy przez ultrawirowanie. Przefiltrowane supernatanty wirusa przenieść do probówek 70 Ti i odwirować przy 18 000 g przez 2 godziny.

Użyj wstępnie schłodzonego wirnika i odwiruj pod kątem 4 stopni. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki i całkowicie usuń supernatant. Delikatnie zawiesić osad w 400 mikrolitrach DMEM bez FBS i antybiotyków za pomocą mikropipety, inkubować na lodzie przez 1 godzinę.

Podmień wirusy i zamroź w temperaturze minus 80 stopni. Obliczyć stężenie wirusa, jak pokazano. Oszacowanie skuteczności transdukcji lentiwirusów.

Transdukuj komórki 293T ze skoncentrowanym wirusem w różnych objętościach, 2, 4 i 8, aby potwierdzić pomyślne przygotowanie lentiwirusa. Wartość do skoncentrowanego wirusa do 100X w celu przeprowadzenia eksperymentu miareczkowania w docelowej linii komórkowej. Zasiaj 1 milion docelowych linii komórkowych w 1,5 ml pożywki 10% RPMI zawierającej 8 mikrogramów na ml polibrenu w jednym dołku sześciodołkowej płytki.

Dodaj cztery różne objętości, 1, 1,5, 2, 2,5 mikrolitra wirusów 100X. Przeprowadzić dezynfekcję przez odwirowanie płytki o masie 920 g przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 72 godzinach zmierz procent komórek GFP dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.

Określ objętość wirusów, aby uzyskać 30% wydajność transdukcji. Ta niska wydajność transdukcji ma zapewnić pojedynczą integrację shRNA na komórkę. Transdukcja połączonej epigenetycznej biblioteki shRNA w lekoopornej linii komórkowej.

Oblicz liczbę komórek, które mają zostać pobrane do eksperymentu, jak poniżej, w oparciu o liczbę integrantów wirusowych. Zawieś ponownie 11 milionów komórek w 16 ml pożywki 10% RPMI. Dodać polibren, osiem mikrogramów na ml i dobrze wymieszać, a następnie dodać wymaganą objętość wirusów, aby uzyskać 30% wydajność transdukcji, jak obliczono wcześniej.

Wysiewać wszystkie komórki na sześciodołkowej płytce o gęstości 1 miliona komórek na 1,5 ml na studzienkę. Wirować płytkę przez 90 minut w temperaturze 920 g w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Inkubować płytkę przez noc w inkubatorze z dwutlenkiem węgla.

Po 24 godzinach zmienić pożywkę i przenieść transdukowane komórki do kolby T-75. Po 48 godzinach sprawdź GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby upewnić się, że transdukcja przebiega pomyślnie. Po 72 godzinach należy określić ilościowo GFP za pomocą cytometrii przepływowej.

Wzbogacenie komórek GFP dodatnich. Rozszerz transdukowane komórki, hodując je w gęstości 0,5 miliona na ml przez 5 do 7 dni i przeprowadź sortowanie przepływowe z ustawieniem sortowania przepływowego ustawionym na wysoką czystość i niską wydajność. Hoduj posortowane komórki w pożywce 10% RPMI.

Po 72 godzinach przeprowadź oszacowanie po sortowaniu procentu komórek dodatnich GFP, aby zapewnić ponad 95% wydajność sortowania. Badania przesiewowe w celu zidentyfikowania czynników epigenetycznych pośredniczących w oporności na leki. Hoduj komórki transdukowane biblioteką shRNA w 10% RPMI przez okres do 5 dni.

Odwiruj 10 milionów komórek w dwóch egzemplarzach. Wyrzucić supernatant i przechowywać granulki w temperaturze minus 80 stopni. Próbki te posłużą jako podstawowe odniesienie dla epigenetycznej biblioteki shRNA.

Hoduj pozostałe transdukowane komórki jako duplikaty, R1 i R2, z których każda jest utrzymywana przy liczbie komórek, która zapewnia 500-krotną reprezentację biblioteki. Leczyć jeden z duplikatów lekiem, 10 mikromolową cytarabiną, a drugi bez leczenia farmakologicznego. Pożywkę do kolb z lekiem i bez niego należy zmieniać co 72 godziny.

Powtórz zmianę pożywki trzy razy, aby uzyskać łączną ekspozycję na lek wynoszącą 9 dni. Po 9 dniu leczenia farmakologicznego należy sprawdzić żywotność komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego. Odwirować pozostałe żywe komórki, przemyć sterylnym PBS i odwirować przy 280 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

Odrzucić supernatant i przechowywać granulki w temperaturze minus 80 w celu ekstrakcji DNA. Amplifikacja zintegrowanych shRNA metodą PCR. Ekstrahować DNA z transdukowanych komórek podstawowych, komórek poddanych działaniu substancji i niepoddanych działaniu substancji, a następnie sprawdzić stężenie za pomocą fluorometru, obliczyć wymaganą ilość DNA, jak pokazano, i poddać próbki pierwszej rundzie PCR.

Mieszaninę reakcyjną PCR przedstawiono w tabeli 2 wraz z warunkami termocyklera. Skonfiguruj wiele reakcji zawierających 850 nanogramów DNA w probówce, co daje w sumie 43 reakcje. Połącz produkty PCR i oczyść je.

Eluować produkty w buforze o pojemności 50 mikrolitrów i oznaczać je ilościowo, a na koniec przechowywać w temperaturze minus 20. W przypadku drugiej rundy PCR należy użyć starterów o odwróconym indeksie, a odczynniki są zestawione w tabeli 4. Ustawić cztery reakcje z 500 nanogramami pierwotnego produktu PCR w całkowitej objętości reakcji 50 mikrolitrów dla każdej próbki wraz z kontrolą ujemną.

Załaduj cały produkt do elektroforezy za pomocą 2% żelu agarozowego TBE i potwierdź rozmiar pasma za pomocą jednej drabinki molekuł KB. Wizualizacja produktów PCR w systemie dokumentacji żelu. Wyciąć określone pasmo i oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania żelu.

Obliczenia dotyczące oczyszczania za pomocą zestawu znajdują się w tabeli 3. Eluować w końcowej objętości 30 mikrolitrów buforu elucyjnego o przybliżonym stężeniu każdego eluentu około 80 do 90 nanogramów na mikrolitr. Sekwencjonowanie i analiza danych nowej generacji.

Produkty oczyszczone żelem są poddawane sekwencjonowaniu nowej generacji w celu uzyskania liczby odczytów dla potrzeb zubożonego shRNA. Przytnij sekwencje adapterów, wyrównaj przefiltrowane odczyty do sekwencji referencyjnych, załaduj pliki za pomocą SAMtools, aby uzyskać podsumowanie wyrównania. Załaduj przycięte pliki fastQ do CRISPRCloud2 i przeprowadź analizę zgodnie z instrukcjami.

Kliknij na link podany dla CRISPRCloud2. Wybierz typ ekranu jako ekrany przetrwania i rezygnacji. Ustaw liczbę grup i wpisz nazwę każdej grupy.

Przekaż bibliotekę referencyjną w formacie pliku FASTA. Przesłane dane są przetwarzane, a wyniki są dostępne w podanym adresie URL. Dane reprezentatywne.

Ten rysunek przedstawia komórki rodzicielskie i oporne MV4-11 traktowane rosnącym stężeniem cytarabiny, od 0,1 mikromola do 1 000 mikromolowców i ocenę żywotności za pomocą testu MTT. Rysunek ten przedstawia reprezentatywne wykresy przepływu GFP określone ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej pod koniec 72 godzin dla ludzkich promotorów EF-1 alfa, ludzkiego CMV i SFFV. Ludzki CMV pokazuje nasz niejednorodny pik, podczas gdy ludzki EF-1 alfa i SFFV wykazują pojedynczy jednorodny pik.

Ten rysunek przedstawia wykres słupkowy dla trzech różnych sprawności promotora w MV4-11. GFP oparty na SFFV wykazał wyciszenie GFP w długotrwałej hodowli. Komórki GFP sterowane przez hEF-1 alfa wykazały trwałą ekspresję po sortowaniu tych komórek.

Lewy panel pokazuje skuteczność transfekcji połączonej biblioteki shRNA transfekowanej w 293T pod koniec 48 godzin pod mikroskopią fluorescencyjną. Prawy panel pokazuje wydajność transdukcji wirusa pulowego w komórkach 293T o różnych objętościach wirusa, 2, 4 i 8 mikrolitrów. Liczba ta przedstawia wydajność transdukcji w linii komórkowej opornej na MV4-11 o różnych objętościach wirusów, takich jak 1, 1,5, 2, 2,5 mikrolitra, aby osiągnąć 30% wydajność transdukcji.

Rysunek ten przedstawia sortowanie komórek dodatnich GFP z 30% wydajnością transdukcji przy wysokiej czystości i niskiej wydajności. Rysunek przedstawia schematyczną ilustrację leczenia farmakologicznego komórek posortowanych z dodatnim wynikiem GFP przez przedłużoną ekspozycję na cytarabinę wynoszącą 9 dni, a następnie sprawdzenie żywotności i pobranie komórek pod kątem DNA. Ten rysunek przedstawia regiony wiążące startera użytego w pierwszej i drugiej rundzie PCR.

Rysunek ten ilustruje rozmiar prążka produktu PCR na końcu pierwszej rundy PCR, 397 pary zasad i drugiej rundy produktu PCR 399 pary zasad, która została wymyta żelem, oczyszczona i podana dla NGS. Rysunek ten ilustruje reprezentację wzbogaconych lub zubożonych shRNA ukierunkowanych na czynniki epigenetyczne, które mogą pośredniczyć w oporności na cytarabinę w AML. Konkluzja. Protokół ten podkreśla znaczenie ukierunkowanych badań przesiewowych w kierunku knockdown w celu systematycznego badania zarówno niezbędnych, jak i nieistotnych genów oraz demonstruje wykorzystanie tego podejścia jako funkcjonalnej platformy, umożliwiającej identyfikację celów odpowiedzialnych za oporność na leki.