Metoda krok po kroku do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV za pomocą kolorymetrycznego testu komórkowego

Istniejące wcześniej przeciwciała, które neutralizują AAV, stanowią barierę dla postępu terapii genowych AAV. Ten test jest narzędziem przesiewowym do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV. Główną zaletą jest to, że jest opłacalny, oszczędza czas, jest łatwy w konfiguracji i wymaga minimalnych umiejętności technicznych, sprzętu laboratoryjnego i odczynników.

Rozpocznij powlekanie komórek HT1080 pierwszego dnia, rozcieńczając komórki do stężenia 1 x 10 do piątych komórek na mililitr we wstępnie podgrzanym kompletnym pożywce DMEM. Następnie wysiewaj 100 mikrolitrów komórek na studzienkę na przezroczyste 96-dołkowe płytki z płaskim dnem do stężenia 1 x 10 do czwartych komórek na studzienkę. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez noc przez 16 do 22 godzin.

Drugiego dnia wygeneruj seryjne rozcieńczenia interesujących próbek surowicy w 1,5-mililitrowych probówkach mikrowirówkowych przy użyciu wstępnie podgrzanego kompletnego DMEM. Do każdej probówki z rozcieńczonymi próbkami surowicy dodaj 66 mikrolitrów 7,5x10 do sześciu genomów wirusa na mikrolitr roztworu roboczego wirusa. Wymieszać rozcieńczenie surowicy wirusa przez pipetowanie, a następnie umieścić probówki zawierające mieszaniny surowicy wirusa w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 30 minut, aby umożliwić potencjalną neutralizację.

Po 30 minutach odpipetować 100 mikrolitrów mieszaniny surowicy wirusa do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce zawierającej 1x10 do czwartej komórki na studzienkę, a następnie zawinąć płytkę w folię i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez noc przez 16 do 24 godzin. Trzeciego dnia odessać pożywkę z dołków 96-dołkowej płytki za pomocą odkurzacza pod wyciągiem bez naruszania przylegających komórek i dodać 50 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do każdej studzienki. Po zawinięciu talerza w folię pozostaw go na 10 minut w temperaturze pokojowej.

Później umyj i odessaj komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS w temperaturze pokojowej. Po drugim myciu odpipetować 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanego PBS do każdego dołka i owinąć płytkę folią, a następnie inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 90 minut w celu denaturacji endogennej fosfatazy alkalicznej, po inkubacji w 50 mikrolitrach świeżo przygotowanego rozpuszczonego BCIP/NBT do każdego dołka i inkubować owinięte płytki w temperaturze pokojowej przez dwie do 24 godzin. Później zrób zdjęcia każdej studzienki za pomocą obiektywu 4X w kamerze mikroskopu świetlnego, zapewniając spójne stosowanie tej samej ekspozycji, balansu bieli i ustawień światła we wszystkich testach.

Aby przeanalizować obraz w ImageJ, wybierz plik i kliknij przycisk Otwórz. W przypadku kolorowych obrazów przekonwertuj je na skalę szarości, wybierając kolejno karty Obraz, Tekst i 8-bitowe. Następnie przejdź do zakładki Obraz i wybierz Dostosuj i próg, aby zmienić próg, aż wszystkie kolorowe obszary będą pokolorowane i czerwone, ale tło nie.

kliknij Analizuj i ustaw pomiary i zaznacz pola wyboru Obszar, Ułamek obszaru, Limit do progu i Etykieta wyświetlania przed naciśnięciem OK.To określić odczyt sygnału danej studni, kliknij Analizuj i mierz, aby kolumna procentowa obszaru w wyskakującym okienku wyświetlała odczyt sygnału. W badaniu ustalono optymalną dawkę wirusa poprzez dodanie genu reporterowego AAV6-hPLAP do komórek w zakresie stężeń genomu wirusa. Wielokrotność infekcji wynosząca 15 000 spowodowała 36% zabarwienie płytki i została wybrana jako optymalna dawka wirusa.

Reprezentatywna analiza pokazuje korelację między ubarwieniem a wielorakością infekcji. Uzyskano najwyższe badane stężenie, które nie wpływało na liniową korelację między zabarwieniem a stężeniem wirusa. Badanie aktywności neutralizującej przeciwciała monoklonalnego anty-AAV6 przeciwko wirusowi adeno-kojarzącemu lub AAV6 w rozcieńczeniu log 10 wykazało 50% zahamowanie transdukcji AAV6 lub TI50 w stężeniu 10 nanogramów na mililitr.

W teście przeciwciała neutralizującego lub teście NAb stopień neutralizacji AAV różnił się w populacji naiwnej próbki z wartościami miana TI50 w zakresie od 1/2 do 1/80. Wyniki testu wykazały, że wartości miana TI50 hamujące AAV przed podaniem AAV wahały się od 1/4 do 1/80. Po podaniu AAV miano TI50 wzrosło do poziomu od 1/2000 do ponad 1/32 000, wykazując wyraźny kontrast w wartościach miana między podaniem przed i po podaniu AAV.

Podczas robienia zdjęć studni ważne jest, aby konsekwentnie używać tych samych ustawień mikroskopu przez cały czas trwania testu, a także upewnić się, że zdjęcia są robione bezpośrednio w środku studzienek.