Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Protokół ten zapewnia metodę wytwarzania kilkuset wielokomórkowych sferoid nowotworowych w każdym dołku płytki wielodołkowej nadającej się do mikroskopii automatycznej. Wytworzone sferoidy można podzielić na różne klasy wielkości, a informacje subkomórkowe można wyodrębnić z każdej komórki. Technika ta wytwarza wystarczającą ilość surowicy, która może być wykorzystana w bezpośrednich badaniach przesiewowych i interferencyjnych RNA.

Rozcieńczyć materiał podstawowy ECM w zimnym podłożu wolnym od czerwonej surowicy fenolowej za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek utrzymywanych w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Postawiłem 15 mikrolitrów materiału podstawowego ECM i roztworu pożywki na 96-dołkową płytkę obrazową. Wirować płytkę przez 20 minut w temperaturze 91 razy G w czterech stopniach Celsjusza.

Inkubować płytkę nie dłużej niż 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj podróże i EDTA do komórek. Inkubujemy komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod koniec inkubacji, zawieszamy komórki w kompletnym podłożu zawierającym 10% FBS.

Odpipetować 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do komory zliczającej hemocytometry. Policz liczbę komórek w czterech kwadrantach komory. Centra ogląda komórki w temperaturze 135 razy G przez cztery minuty w temperaturze pokojowej.

Jedne z tych komórek są granulowane, odsysane supernatantem i ponownie zawieszane w kompletnym pożywce wolnym od czerwieni fenolowej, aby uzyskać stężenie od 10 do sześciu komórek na mililitr. Rozcieńczyć komórki w kompletnym pożywce wolnym od czerwieni fenolowej. Zobacz komórki kroplami w ruchu okrężnym w łącznej objętości 35 mikrolitrów na studzienkę.

Inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Przy 1,2 mikrolitra materiału podstawowego ECM do 23,8 mikrolitrów kompletnego podłoża wolnego od czerwieni fenolowej na studzienkę, co daje końcową objętość 60 mikrolitrów na studzienkę. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.

Następnego dnia zastąp pożywkę 100 mikrolitrami świeżej, kompletnej pożywki wolnej od czerwieni fenolowej. Włóż 96-dołkową płytkę zawierającą sferoidy do konfokalnego mikroskopu przesiewowego o wysokiej zawartości. Wybierz odpowiednie lasery, aby wzbudzić użyte podłogi.

Pobieraj kanały sekwencyjnie, aby uniknąć przesłuchów, zobrazuj sferoidy za pomocą odpowiednich obiektywów. Aby przeanalizować morfologię sferoid, należy podzielić sferoidy na segmenty na podstawie fluorescencyjnie sprzężonego FLoidu i barwienia. Podziel jądra na segmenty na podstawie barwienia sześciokątnego trzech, trzech, trzech, czterech, dwóch.

Podziel cytoplazmę każdej komórki na segmenty przez pozostałą plamę sześciokątną trzy, trzy, cztery, dwie, która jest obecna w cytoplazmie komórki. Oblicz różne właściwości morfologiczne sferoid, w tym objętość, powierzchnię, sferyczność i liczbę jąder na sferoidy. Ross dysponuje zdjęciami, które pozwalają usunąć sferoidy mniejsze niż 75 mikrometrów sześciennych i większe niż 900 000 mikrometrów sześciennych.

Aby przeanalizować pojedynczą komórkę w sferoidach, należy podzielić sferoidy na segmenty na podstawie fluorescencyjnie sprzężonego barwienia sferoidalnego. Podziel jądra na segmenty na podstawie barwienia sześciokątnego trzech, trzech, trzech, czterech, dwóch. Podziel cytoplazmę każdej komórki na segmenty przez pozostałą plamę sześciokątną trzy, trzy, trzy, cztery, dwie, która jest obecna w cytoplazmie komórki.

Segmentuj lizosomy na podstawie wtórnego barwienia przeciwciałami. Oblicz różne właściwości morfologiczne komórek w każdej sferoidzie, w tym liczbę lizosomów na komórkę, objętość komórki i powierzchnię komórki. Rysunek przedstawia dokładne przeglądy trzech różnych typów sferoid, w tym obrazy w różnych płaszczyznach konfokalnych.

Pokazany jest również widok wolumetryczny całych sferoid. Rysunek przedstawia proces segmentacji pH, panel A pokazuje całe sferoidy w widoku wolumetrycznym. Panel B wyświetla ustaloną segmentację cytoplazmy, jąder i lizosomów we wszystkich komórkach pojedynczej sferoidy.

Cytoplazma i jądra są podzielone na segmenty na podstawie barwienia sześciokątnego trzy, trzy, trzy, cztery, dwa. Lizosomy są segmentowane na podstawie barwienia przeciwciałami anty lab one. Panele C są podzielone na segmenty tak samo jak panel B, ale w widoku trójdzielnym.

Można wykonywać różne pomiary morfologiczne na poziomie sferoid. Pomiary te obejmują obliczenie liczby jąder na sferoidy, a także te Felicity, objętość i powierzchnię pH. Typowa objętość każdej komórki w trzech typach sferoidów.

Na tym rysunku pokazano również liczbę lizosomów na komórkę. Optymalizacja początkowej gęstości osadzenia komórek na początku generowania SP jest krytycznym krokiem. Rysunek pokazuje, że dodanie zbyt wielu komórek nadal umożliwia tworzenie się sferoid.

Może to jednak spowodować fuzję sferoid. Wytworzone w ten sposób sferoidy mogą być poddane analizie transkryptomicznej i proteomicznej. Technika ta służy do ilościowej analizy wchłaniania dostarczanych przez leki nanocząsteczek i oceny ich toksyczności dla poszczególnych komórek w sferoidach.