Hodowla i badania przesiewowe pasożytniczego nicienia Ditylenchus dipsaci

Protokół ten pozwala na odkrycie nowych nematocydów do zwalczania Ditylenchus dipsaci za pomocą techniki hodowli i średnioprzepustowych badań chemicznych. Prostota tej techniki pozwala na badania przesiewowe tysięcy związków tygodniowo w celu identyfikacji związków o potencjale nematobójczym. Technika ta może zidentyfikować nowe związki do zabijania nicieni pasożytujących na roślinach uprawnych, a tym samym zwiększyć globalną podaż żywności.

Na początek przygotuj 500 mililitrów agaru odżywczego lub pożywki NA z 23 gramami na litr NA i ultraczystą wodą. Stosując sterylną technikę, wlej 25 mililitrów autoklawizowanej pożywki NA do 20 jednorazowych szalek Petriego o średnicy 100 milimetrów i głębokości 15 milimetrów. Przygotuj 500 mililitrów pożywki Gamborg B5 lub GA, zawierającej 3,2 grama na litr podłoża podstawowego GA z minimalną ilością substancji organicznych, 20 gramów na litr sacharozy, 15 gramów na litr agaru i wody destylowanej.

Stosując sterylną technikę, wlej 50 mililitrów autoklawowanej pożywki GA do 10 jednorazowych szalek Petriego. Aby przeprowadzić sterylizację nasion, wlej 150 nasion grochu do sterylnej dwulitrowej zlewki z mieszadłem w pobliżu płomienia palnika Bunsena na stole laboratoryjnym. Dodaj 200 mililitrów 95% etanolu do nasion i energicznie mieszaj na talerzu mieszającym przez pięć minut.

Następnie odlej etanol do pojemnika na odpady. Wlej roztwór wybielacza do zlewki, aby całkowicie zanurzyć nasiona. Mieszaj energicznie na talerzu mieszającym przez 20 minut.

Następnie wylej wybielacz do pojemnika na odpady. Wlej wodę destylowaną do zlewki, aby zanurzyć nasiona i energicznie mieszaj na talerzu mieszającym przez 20 minut. Po ostatnim umyciu wodą wlej wysterylizowane nasiona do szklanej szalki Petriego.

Aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczenia, przenieś sześć nasion na każdą 10-centymetrową płytkę NA w okapie z przepływem laminarnym za pomocą wysterylizowanych kleszczy. Ułóż nasiona na obwodzie płytki. Zawiń płytki pojedynczo w laboratoryjną folię do owijania i inkubuj je w ciemności przez trzy dni w temperaturze 26 stopni Celsjusza.

W okapie z przepływem laminarnym umieść dwa niezanieczyszczone nasiona na każdej płytce GA za pomocą wysterylizowanych kleszczy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 7 do 10 dni, aby nasiona mogły wykiełkować. Przygotuj 50 mililitrów roztworu sacharozy o 20 gramach na litr

Przefiltrować, wysterylizować roztwór sacharozy i odstawić na bok. W kapturze z przepływem laminarnym wytnij kawałek agaru zawierający tkankę korzeniową z istniejącej płytki hodowlanej. Odpipetować 500 mikrolitrów roztworu sacharozy na nowej płytce GA z sadzonkami grochu i umieścić kostkę agaru na wierzchu sacharozy.

Utrzymuj kulturę w pudełku wyłożonym folią aluminiową w temperaturze pokojowej. Aby utrzymać kulturę, subkulturuj nicienie na świeżych talerzach GA co osiem do dziewięciu tygodni. Nicienie są gotowe do ekstrakcji po około ośmiu tygodniach.

W kapturze z przepływem laminarnym pokrój agar i tkankę korzeniową w jednocentymetrową kostkę za pomocą sterylnego skalpela. Przenieś kostki agaru do lejka wyłożonego filtrem do kawy i powoli wlej wodę destylowaną na agar, aby zwilżyć filtr do kawy. Wyjmij lejek wyłożony filtrem kawy ze zlewki i napełnij zlewkę wodą destylowaną, aż poziom wody dotknie dna filtra po wymianie lejka wyłożonego filtrem kawy.

Przykryj lejek i zlewkę wyłożone filtrem kawy folią aluminiową. Aby zebrać robaki, wyjmij lejek wyłożony filtrem do kawy i zasysaj górne 40 mililitrów wody ze zlewki zbiorczej, nie zakłócając osiadłych robaków. Zebrać pozostałą ciecz do 15-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej za pomocą 10-mililitrowej plastikowej pipety serologicznej.

Aby przygotować płytki testowe, wlej wodę destylowaną w autoklawie do sterylnego koryta i dozuj 40 mikrolitrów wody destylowanej z koryta do każdej studzienki płaskiej 96-dołkowej płytki za pomocą wielokanałowej pipety. Dodaj substancje chemiczne z 96-dołkowych płytek wyjściowych do roztworów chemicznych do płytek testowych, trzykrotnie wbijając je w płytkę chemiczną. Następnie przenieś kołki 10 razy na płytkę testową.

Zetrzyj na papierze przed roztworem czyszczącym. Aby policzyć liczbę nicieni z kolekcji, najpierw ponownie zawiesić kolekcję, a następnie odpipetować pięć mikrolitrów roztworu za pomocą końcówek o niskiej retencji na szkiełko. Policz liczbę nicieni w pięciu mikrolitrach za pomocą mikroskopu preparacyjnego.

Następnie dostosuj stężenie do dwóch robaków na mikrolitr za pomocą sterylnej, destylowanej wody. Następnie dodaj 10 mikrolitrów próbki do każdej studzienki z 96-dołkowych płytek za pomocą wielokanałowej pipety i koryta. Owiń talerze wilgotnym ręcznikiem papierowym i umieść je w pudełku.

Następnie dodaj dodatkowo wilgotny ręcznik papierowy, aby ustabilizować i zapewnić minimalny ruch płytek i przymocuj do lepkiej podkładki w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 20 stopni Celsjusza ustawionym na 200 obr./min. Obserwuj płytki w piątym dniu pod mikroskopem preparacyjnym. Policz liczbę ruchomych i całkowitych D.dipsaci w kontrolach rozpuszczalnikowych DMSO i studzienkach poddanych działaniu leków.

Jeśli robaki są nieruchome, dodaj dwa mikrolitry jednomolowego wodorotlenku sodu do końcowego stężenia 40-milimolowego do studzienki, aby stymulować ruch. Oblicz proporcję robaków mobilnych. Na ekranach D.dipsaci studnie, które w sposób powtarzalny przyniosły 0% mobilnych robaków, są klasyfikowane jako silne trafienia.

Trzy różne płytki leku zostały przebadane w stężeniu 60 mikromolów, przy czym każda płytka leku ma trzy kontrpróby biologiczne. Wszystkie trzy płytki zawierały 6% kontroli tylko z rozpuszczalnikiem DMSO. Wiele płytek zawierających leki z biblioteki małych cząsteczek nie zawierało żadnej cząsteczki o obserwowalnej bioaktywności przeciwko D. dipsaci.

Niektóre płytki miały w pełni powtarzalne trafienia, podczas gdy inne zawierające scharakteryzowane nematocydy różniły się swoją aktywnością. Słupki błędu reprezentują błąd standardowy średniej. W tym przypadku fluopyram wykazywał silną aktywność w teście.

Fluopyram wywoływał pozorny, zależny od dawki wpływ na ruchliwość D. dipsaci przy EC50 9,3-mikromolowym. Oksamyl nie miał istotnego wpływu na ruchomość w stężeniu do 120 mikromolów. Oksamyl nie miał istotnego wpływu na ruchomość do stężenia 120 mikromolów.

Dodanie wodorotlenku sodu poprawiło czułość testu w wykrywaniu nieruchomych robaków. 40-milimolowy wodorotlenek sodu zastosowano jako punkt końcowy testu w celu stymulowania ruchu u zdolnych do tego osób, a tym samym odróżnienia robaków w stanie spoczynku od robaków chorych. Protokół ten umożliwił identyfikację związków o nowych mechanizmach działania przeciwko D. dipsaci i innym gatunkom.