Bioprospekcja mikroorganizmów ekstremofilnych w celu rozwiązania problemu zanieczyszczenia środowiska

Protokół opisuje uproszczone podejście do badań przesiewowych i izolacji mikroorganizmów odpornych na metale ciężkie ze źródeł geotermalnych. Podejście to stanowi obszar badawczy cieszący się rosnącym zainteresowaniem na całym świecie pod kątem zastosowań w dziedzinie biodetekcji i bioremediacji. Opisaną tam metodę można łatwo zmodyfikować w celu wyizolowania drobnoustrojów z różnych źródeł środowiska, takich jak woda, żywność, gleba czy osady.

Minimalne stężenie hamujące w celu identyfikacji opornych drobnoustrojów jest szybką strategią charakteryzowania nowych gatunków lub szczepów. Protokół ten jest łatwy do wykonania i wymaga jedynie umiejętności manualnych i doświadczenia w zakresie podstawowych technik mikrobiologicznych. Na początek zaszczepij dwa gramy pobranej próbki w 50 mikrolitach świeżo przygotowanej pożywki Luria-Bertani o pH czterech lub siedmiu.

Inkubować tę próbkę w temperaturze miejsca pobierania próbek plus minus pięć stopni Celsjusza. Umieść 200 mikrolitrów próbki na agarze Luria-Bertani o pH czterech lub siedmiu i utrzymuj ją w stanie statycznym w temperaturze 55 lub 60 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po inkubacji wyizolować pojedyncze kolonie i powtórzyć ten cykl powlekania smug co najmniej trzy razy.

Aby przygotować jeden mililitr zamrożonego bulionu komórkowego, dodaj 20% glicerolu do komórek hodowanych przez noc. Użyj mieszanki acetonu i suchego lodu do szybkiego zamrażania. Aby przygotować inokulum z wywaru glicerynowego, zaszczepij 50 mikrolitrów w 50 mililitrach Luria-Bertani.

Aby uzyskać profil wzrostu, rozcieńczyć tę wstępną kulturę w 10 mikrolitrach Luria-Bertani. Aby dostosować gęstość optyczną do 0,1, dodaj 600 nanometrów. Hoduj te komórki przez 16 godzin w temperaturze 55 lub 60 stopni Celsjusza w wytrząsarce orbitalnej.

Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach w odstępach 30-minutowych. Krzywa z tych danych z czasem na osi X i gęstością optyczną przy 600 nanometrach na osi Y. Wykreślić podobne krzywe wzrostu o zmiennym pH pożywki hodowlanej, aby określić optymalne pH dla warunków laboratoryjnych, zaszczepić izolat smugowy z glicerolu w 50 mikrolitrach pożywki Luria-Bertani i inkubować przez noc.

Odwirować tę wyhodowaną przez noc kulturę przez 10 minut w temperaturze 5 000 razy G, a następnie wyrzucić supernatant i zebrać paletę kultur. Bezpośrednio przed użyciem przygotuj 10 mililitrów buforu do lizy bakterii składającego się z 20 milimolowych Tris-HCL, dwóch milimolowych EDTA, 1,2% Triton X-100 i 20 miligramów na mililitr lizosomu. Ponownie zawiesić osad w 180 mikrolitrach buforu do buforu do mikrolizy.

Ekstrakcja genomowego DNA zgodnie z instrukcją w zestawie do oczyszczania i pomiar genomowego DNA i jego czystości za pomocą UV-Vis. Aby ocenić czystość, należy określić proporcje gęstości optycznej od 260 do 280 i od 260 do 230. Oceń integralność genomowego DNA, ładując 200 nanogramów każdej próbki na 0,8% żelu agarozowym i porównując rozkład wielkości z markerem molekularnym wzrostu i masy.

Hoduj izolat z wywaru glicerolu w 200 mililitrach Luria-Bertani w optymalnych warunkach pH i temperatury. Rozcieńczyć każdą hodowlę wstępną w pięciu mililitrach pożywki Luria-Bertani w 50 mililitrach probówek polipropylenowych zawierających rosnące stężenia metali ciężkich i antybiotyków, aby uzyskać gęstość optyczną 0,1 przy 600 nanometrach. Hoduj komórki przez 16 godzin na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obrotów na minutę w temperaturze 55 lub 60 stopni Celsjusza.

Obliczyć minimalne stężenie hamujące dla antybiotyków lub metali ciężkich, identyfikując wartości stężeń w probówkach, w których nie dochodzi do rozwoju drobnoustrojów. Sprawdzić, czy stężenie jest hamujące i nie jest śmiertelne dla komórek, posiewając 200 mikrolitrów kultury wyhodowanej w minimalnych stężeniach hamujących na płytkach agarowych Luria-Bertani i sprawdzając obecność kolonii po całonocnej inkubacji. Protokół ten został wykorzystany do przetestowania próbek bakteryjnych z obszaru Piscarelli, kwaśnego siarkowego środowiska geotermalnego Fenotypowa charakterystyka izolowanych mikroorganizmów wykazała, że izolat jeden ma wyższą tolerancję na arsenian i wanadan oraz jest odporny na kadm.

Dane porównawcze sugerują, że izolat pierwszy ma silną odporność na arsen pięciowartościowy, podczas gdy izolat drugi ma oporność na arsen trójwartościowy. Testy oporności na antybiotyki wykazały, że izolat jeden jest bardzo wrażliwy na wszystkie badane antybiotyki, nawet gdy stosowano niskie stężenia. Natomiast izolat drugi jest oporny na wszystkie testowane antybiotyki z wyjątkiem chloramfenikolu i tetracykliny.

Mikroorganizm prawdopodobnie nabył oporność na antybiotyki w wyniku przypadkowych mutacji lub horyzontalnego transferu genów, co stanowi selektywną przewagę w ekstremalnych warunkach środowiskowych. Badanie to pokazuje przydatność takich metod do selekcji mikroorganizmów środowiskowych, które mogą dezaktywować zanieczyszczenia i przekształcać je w nieszkodliwe produkty.