Name: Mechaniczny test unikania konfliktów do pomiaru zachowania bólowego u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj mechaniczny test unikania konfliktów do oceny wrażliwości bólowej u myszy. Ta metoda pozwala badać motywacyjne aspekty zachowania bólowego i usprawnia translację badań przedklinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

GM jest wspierany przez NDSEG Graduate Fellowship. VLT jest wspierany przez NIH NIGMS grant #GM137906 oraz Fundację Rity Allen. AJS jest wspierany przez granty Departamentu Obrony W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197 oraz Fundację Rity Allen. Jesteśmy wdzięczni dr Alexxai Kravitzowi z Washington University School of Medicine za zaprojektowanie i bezpłatne udostępnienie plików drukarki 3D dla podłogi komory 2 i płytki sondy.

Wszystkie eksperymenty z użyciem myszy i procedury w nich przestrzegane zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania MD Anderson Cancer Center i Uniwersytetu Stanforda, zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Budowa MCA
<ol>
	<li>Zbuduj komorę 1 o wymiarach: 125 mm x 125 mm x 125 mm (szerokość x głębokość x wysokość) z nieprzezroczystego białego akrylu o grubości 3 mm użytego do ścian bocznych, podłogi, sufitu. Użyj przezroczystego akrylu o grubości 3 mm do ściany frontowej. Sklej ze sobą wszystkie strony z dużym wyprzedzeniem za pomocą dedykowanego kleju akrylowego. 
	UWAGA: Klej akrylowy jest uważany za materiał niebezpieczny (łatwopalny, szkodliwy dla par, może być szkodliwy w przypadku połknięcia, może podrażniać skórę lub oczy). Takie kleje powinny być używane wyłącznie zgodnie z instrukcjami producenta (tj. z odpowiednimi środkami ochrony osobistej w dobrze wentylowanym pomieszczeniu).</li>
	<li>Przymocuj pokrywę komory 1 za pomocą zawiasu, aby myszy można było łatwo umieścić w komorze i wyjąć z niej. Przymocuj samoprzylepną taśmę z diodami elektroluminescencyjnymi (LED) do wewnętrznej powierzchni pokrywy, aby zapewnić oświetlenie o natężeniu ~4800 luksów.</li>
	<li>Zamknij komorę 1 od reszty MCA, wsuwając i wysuwając nieprzezroczysty arkusz akrylowy z pozycji.</li>
	<li>Zbuduj komorę testową MCA, komorę 2, jako nieoświetloną komorę o długości 270 mm, wykonaną ze wszystkich stron z półprzezroczystego ciemnoczerwonego akrylu (o grubości 3 mm), z pokrywą na zawiasach na górze. Umieść siatkę 13 x 31 z otworami 2 mm na podłodze komory 2, przez które może wystawać szereg sond z końcówkami o średnicy 0,5 mm (np. stępione kołki mapy). 
	UWAGA: kołki z blokiem papieru ściernego o ziarnistości 120 lub podobnym. Wyczyść je w ciepłej wodzie z detergentem przed dezynfekcją sporobójczym środkiem dezynfekującym.</li>
	<li>Dostosuj wysokość sond, umieszczając dodatkowe arkusze akrylowe pod płytą podstawy sondy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Korzystając z tego podejścia, skonfiguruj urządzenie z trzema ustawieniami: 0 mm, 2 mm i 5 mm wysokości sondy.</li>
	<li>Jako alternatywę dla stępionych pinów mapy lub podobnych materiałów, użyj plików drukarki 3D do wydrukowania podłogi komory 2 i płyty sondy (zobacz Plik Uzupełniający 1: SpikeBed-MCA.stl, który odnosi się do sond mechanicznych, oraz Plik Uzupełniający 2: MCA_baseplate.stl, który tworzy podłogę komory 2). 
	UWAGA: Jeśli druk 3D nie jest dostępny, przyklej pinezki mapowe do arkusza akrylowego za pomocą tego samego kleju akrylowego, który został użyty do budowy ścian urządzenia.</li>
	<li>Drukuj z nadającego się do prania i biokompatybilnego materiału, takiego jak nylon 12 lub podobny (zalecane).</li>
	<li>Skonstruuj komorę 3 o następujących wymiarach: 125 mm x 125 mm x 125 mm jako nieoświetlone, półprzezroczyste ciemnoczerwone pudełko akrylowe (ze wszystkich stron), umieszczone na przeciwległym końcu do komory 1. Umieść pokrywę na zawiasach na komorze, podobnie jak w komorach 1 i 2. Komora ta służy jako zaciemniony obszar ucieczki od sond mechanicznych w komorze 2.</li>
</ol>
2. Habituacja i testowanie MCA myszy
<ol>
	<li>Podobnie jak w przypadku wszystkich eksperymentów obejmujących wyniki behawioralne na zwierzętach, obserwuj odpowiednią randomizację i zaślepienie, aby zminimalizować potencjalną stronniczość. 
	UWAGA: Reprezentatywne wyniki zostały wygenerowane przy użyciu 8-12 tygodniowych samców i samic myszy C57BL / 6J (szczep Jackson Laboratories numer 000664). Myszy trzymano w pomieszczeniach socjalnych, do 5 sztuk na klatkę, z dostępem do jedzenia i wody ad libitum oraz cyklem świetlnym od 07:00 do 19:00. MCA odbyło się w okresie jasnym, między godziną 09:00 a godziną 12:00.</li>
	<li>Na dzień przed zaplanowanym testem podstawowym zaaklimatyzuj myszy do jednostki MCA przez 5 minut (minimum) do 15 minut (maksimum) ze swoimi kolegami z klatki, aby ułatwić społeczną eksplorację całego urządzenia.</li>
	<li>W trakcie całego procesu upewnij się, że diody LED w komorze 1 są wyłączone, bariera między komorami 1 i 2 pozostaje otwarta, a sondy są ustawione na wysokość zero (tj. nie wystają poza podłogę komory 2).</li>
	<li>Przeprowadzić test wyjściowy na myszach (opcjonalnie), jeśli badanie obejmuje zwierzęta z grupy kontroli ujemnej (tj. pozorowaną operację chirurgiczną lub kontrolę wstrzyknięcia nośnika). W razie potrzeby należy użyć testu podstawowego, aby wykluczyć wszelkie nieuszkodzone wartości odstające, które nigdy nie przechodzą do komory 2, chociaż nie okazało się to konieczne. Jeśli to zastosowanie, należy podać wszystkie kryteria wykluczenia i liczbę wykluczonych myszy.
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem testów skonfiguruj kamerę wideo zdolną do nagrywania materiału 1080p na statywie z widokiem z boku na całe urządzenie MCA. Dostosuj pole widzenia w taki sposób, aby MCA wypełniło zarejestrowany obraz.</li>
		<li>Po rozpoczęciu nagrywania przytrzymaj ręczną tablicę suchościeralną w polu widzenia kamery, aby oznaczyć początek filmu informacjami identyfikującymi przebieg testu zwierzęcia (np. identyfikator myszy, wysokość sondy, data, punkt czasowy itp.).</li>
		<li>W pierwszym uruchomieniu ustaw wysokość sondy na zero. Przenieś mysz, która ma być poddana testowi, z klatki domowej do komory 1 z założonymi drzwiczkami szlabanu. Uruchom stoper, który jest widoczny w nagranym materiale filmowym. 
		UWAGA: Timer zapewnia, że odstępy czasu między różnymi częściami testu są spójne między przebiegami.</li>
		<li>Po 10 s włącz w komorze 1 diody LED. Po 20 sekundach przebywania myszy w oświetlonej komorze należy usunąć barierę między komorami 1 i 2.</li>
		<li>Obserwuj zwierzę przez 2 minuty. Zmierz opóźnienia i/lub czasy przebywania za pomocą stopera w trakcie trwania testu. Alternatywnie, materiał wideo może być analizowany po zakończeniu testów. 
		UWAGA: Ze względu na przepustowość i unikanie długotrwałej ekspozycji na bodźce awersyjne, granicę ustalono na 2 min.</li>
		<li>Zmierz co najmniej jeden z kilku zidentyfikowanych użytecznych wyników (patrz poniżej; <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Zaleca się przeanalizowanie wszystkich 5 miar wyników na początku testowania, w celu ustalenia, które aspekty zachowania różnią się w danej konfiguracji eksperymentalnej.
		<ol>
			<li>Wariant I: Zapisz opóźnienie do pierwszego wejścia do komory 2. Opcja II: Zapisz opóźnienie do przejścia przez komorę więcej niż w połowie komory 2. Opcja III: Zapisz całkowity czas przebywania w komorze 2. Opcja IV: Zapisz opóźnienie, aby dotrzeć do komory 3 (ucieczka). Opcja V: Podobnie jak w przypadku opcji II, zapisz całkowity czas przebywania w każdej komorze w ciągu 2 minut i przelicz je na proporcje. 
			UWAGA: Ponieważ każdy eksperyment jest unikalny i mogą na niego wpływać czynniki biologiczne i zmiany behawioralne unikalne dla modelu choroby, badacze mogą eksperymentować z tymi i innymi środkami we własnych rękach.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po zakończeniu testów umieść mysz z powrotem w klatce domowej, wyczyść komory MCA 70% etanolem i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. 
		UWAGA: Kał boli można zwykle stosunkowo łatwo usunąć z komory ręcznikami papierowymi przed etanolem/środkiem dezynfekującym. Jeśli konieczne będzie dokładniejsze czyszczenie, komory 2 i 3 można zdemontować i zanurzyć w ciepłej wodzie z mydłem.</li>
		<li>Po uruchomieniu wszystkich myszy w kohorcie z wysokością sondy ustawioną na zero, włóż 3 mm arkusz akrylu pod płytkę podstawy sondy mechanicznej i powtórz kroki od 2.4.2 do 2.4.7 z wysokością sondy 2 mm.</li>
		<li>Po uruchomieniu wszystkich myszy z wysokością sondy ustawioną na 2 mm, włóż drugi arkusz akrylu o grubości 3 mm pod płytę podstawy sondy i powtórz kroki od 2.4.2 do 2.4.7 z wysokością sondy 5 mm. 
		UWAGA: Przy użyciu tego podejścia grupa 8 myszy może być testowana w ciągu około 2 godzin. Używaj mniejszych grup, jeśli wymagany jest bardziej precyzyjny czas po podaniu leku (np. w przypadku eksperymentu z czasem trwania leku).</li>
		<li>Wykonaj końcowe czyszczenie środkiem dezynfekującym na koniec sesji testowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć badanie po wywołaniu nadwrażliwości na ból i/lub po leczeniu farmakologicznym.</li>
	<li>Porównaj wydajność każdej myszy na początku badania z ich wydajnością po wywołaniu bólu. Oceń wpływ interwencji farmakologicznej, porównując zwierzęta leczone nośnikiem ze zwierzętami leczonymi lekami w tym samym punkcie czasowym.</li>
	<li>Przeprowadzić nieparametryczną analizę statystyczną (np. test U Manna-Whitneya), jeśli zwierzęta osiągną granicę 2 minut bez osiągnięcia pożądanej miary wyniku, co skutkuje nieciągłymi danymi.</li>
</ol>

<ol><li>Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+sensitive+method+for+measuring+thermal+nociception+in+cutaneous+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia.</a> Pain. 32 (1), 77-88 (1988).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
<li>Sheahan, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+nerve+injury+minimally+affect+mouse+voluntary+behaviors+proposed+as+indicators+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammation and nerve injury minimally affect mouse voluntary behaviors proposed as indicators of pain.</a> Neurobiology of Pain. 2, 1-12 (2017).</li>
<li>Wodarski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-centre+replication+of+suppressed+burrowing+behaviour+as+an+ethologically+relevant+pain+outcome+measure+in+the+rat%3A+a+prospective+multicentre+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cross-centre replication of suppressed burrowing behaviour as an ethologically relevant pain outcome measure in the rat: a prospective multicentre study.</a> Pain. 157 (10), 2350-2365 (2016).</li>
<li>King, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+the+tonic-aversive+state+in+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unmasking the tonic-aversive state in neuropathic pain.</a> Nature Neuroscience. 12 (11), 1364-1366 (2009).</li>
<li>Harte, S. E., Meyers, J. B., Donahue, R. R., Taylor, B. K., Morrow, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Conflict+System%3A+A+Novel+Operant+Method+for+the+Assessment+of+Nociceptive+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanical Conflict System: A Novel Operant Method for the Assessment of Nociceptive Behavior.</a> PLoS One. 11 (2), 0150164(2016).</li>
<li>Pahng, A. R., Edwards, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Pain+Avoidance-Like+Behavior+in+Drug-Dependent+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Measuring Pain Avoidance-Like Behavior in Drug-Dependent Rats.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85 (1), 53(2018).</li>
<li>Odem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sham+surgeries+for+central+and+peripheral+neural+injuries+persistently+enhance+pain-avoidance+behavior+as+revealed+by+an+operant+conflict+test%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Sham surgeries for central and peripheral neural injuries persistently enhance pain-avoidance behavior as revealed by an operant conflict test.</a> Pain. 160 (11), 2440-2455 (2019).</li>
<li>LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+test+paradigm+to+measure+the+aversive+quality+of+inflammatory+and+neuropathic+pain+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">A behavioral test paradigm to measure the aversive quality of inflammatory and neuropathic pain in rats.</a> Experimental Neurology. 163 (2), 490-494 (2000).</li>
<li>LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+and+gabapentin+decrease+mechanical+hyperalgesia+and+escape%2Favoidance+behavior+in+a+rat+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Morphine and gabapentin decrease mechanical hyperalgesia and escape/avoidance behavior in a rat model of neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 290 (2), 137-140 (2000).</li>
<li>Vichaya, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motivational+changes+that+develop+in+a+mouse+model+of+inflammation-induced+depression+are+independent+of+indoleamine+2%2C3+dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Motivational changes that develop in a mouse model of inflammation-induced depression are independent of indoleamine 2,3 dioxygenase.</a> Neuropsychopharmacology. 44 (2), 364-371 (2019).</li>
<li>Hascoët, M., Bourin, M., Nic Dhonnchadha, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+light-dark+paradigm%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuropsychopharmacology+%26+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The mouse light-dark paradigm: a review.</a> Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry. 25 (1), 141-166 (2001).</li>
<li>Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+validation+of+voluntary+gait+and+mechanical+sensitivity+assays+associated+with+inflammatory+and+neuropathic+pain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Pharmacological validation of voluntary gait and mechanical sensitivity assays associated with inflammatory and neuropathic pain in mice.</a> Neuropharmacology. 130, 18-29 (2018).</li>
<li>Huck, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+Contribution+of+Myeloid-Lineage+TLR4+to+the+Transition+to+Chronic+Pain%3A+A+Focus+on+Sex+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal Contribution of Myeloid-Lineage TLR4 to the Transition to Chronic Pain: A Focus on Sex Differences.</a> Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).</li>
<li>Pitzer, C., La Porta, C., Treede, R. D., Tappe-Theodor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+neuropathic+pain+conditions+do+not+primarily+evoke+anxiety-like+behaviours+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and neuropathic pain conditions do not primarily evoke anxiety-like behaviours in C57BL/6 mice.</a> European Journal of Pain. 23 (2), 285-306 (2019).</li>
<li>Sieberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathic+pain+drives+anxiety+behavior+in+mice%2C+results+consistent+with+anxiety+levels+in+diabetic+neuropathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuropathic pain drives anxiety behavior in mice, results consistent with anxiety levels in diabetic neuropathy patients.</a> Pain Reports. 3 (3), 651(2018).</li>
<li>Meuwissen, K. P. V., van Beek, M., Joosten, E. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+and+Tonic+Spinal+Cord+Stimulation+in+the+Mechanical+Conflict-Avoidance+System%3A+Cognitive-Motivational+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">Burst and Tonic Spinal Cord Stimulation in the Mechanical Conflict-Avoidance System: Cognitive-Motivational Aspects.</a> Neuromodulation. 23 (5), 605-612 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych istotnych konfliktów interesów.

Podobnie jak w przypadku wszystkich testów behawioralnych, przez cały czas niezbędne jest właściwe obchodzenie się, randomizacja i ślepota na leczenie zwierząt. Biorąc pod uwagę wieloczynnikowy wpływ na złożone zachowania i podejmowanie decyzji, konieczne jest, aby zwierzęta były traktowane, przyzwyczajane i testowane tak konsekwentnie, jak to możliwe, przy jednoczesnym minimalizowaniu stresu. Należy również zadbać o odtworzenie czasu umieszczenia myszy w komorze 1, włączenia świateł LED i usunięcia bariery, ponieważ róż...

Ból to złożone doświadczenie z komponentami sensorycznymi i afektywnymi. Obniżenie progu percepcji bólu i nadwrażliwość na bodźce termiczne i/lub mechaniczne są kluczowymi cechami tego doświadczenia, które mogą zostać uchwycone przez testy zachowania bólu wywołane bodźcem (takie jak test wrażliwości cieplnej Hargreavesa i test wrażliwości mechanicznej von Freya)1,2. Chociaż takie testy dają solidne i powtarzalne wyniki, są one ograniczone przez ich zależność od odruchowego wycofania się z postrzeganego szkodliwego bodźca. To postawiło pod znakiem zapytania ciągłe poleganie badań nad bólem wyłącznie na tych testach. W tym celu naukowcy zajmujący się bólem od kilku lat badają alternatywne/uzupełniające testy behawioralne do wykorzystania w modelach bólu gryzoni, starając się uchwycić więcej afektywnych i / lub motywacyjnych składników bólu. Te niewywołane, dobrowolne lub nierefleksyjne środki (np. bieganie po kółkach, aktywność kopania, warunkowe preferencje dotyczące miejsca3,4,5) są wdrażane w celu poprawy przekładalności przedklinicznych badań nad bólem.
Test unikania konfliktów mechanicznych (MCA) został pierwotnie opisany przez Harte et al. w 2016 roku6, jest używany głównie u szczurów7,8, i reprezentuje modyfikację wcześniejszego podejścia - paradygmatu ucieczki miejsca. W tym podejściu szkodliwy bodziec tylnej łapy jest wykonywany w skądinąd pożądanej (ciemnej) komorze, aby skłonić zwierzę do celowego zachowania w celu ucieczki/uniknięcia takiej stymulacji9,10. Zamiast polegać na ręcznej, szkodliwej stymulacji tylnej łapy przez obserwatora, test MCA zmusza myszy do negocjowania potencjalnie szkodliwego bodźca, aby uciec z awersyjnego środowiska i dotrzeć do ciemnej komory. Konflikt/unikanie, od którego pochodzi nazwa testu, wynika z tych dwóch konkurujących ze sobą motywacji: ucieczki z jasno oświetlonych obszarów i unikania szkodliwej stymulacji łap. Test MCA ma również cechy wspólne z testami warunkowych preferencji miejscowych, w których połączenie ulgi w bólu ze wskazówkami środowiskowymi napędza zmiany w zachowaniu, które odzwierciedlają preferencję dla kontekstu uśmierzającego ból/nagradzającego11.
Zasadniczo rzecz biorąc, wszystkie te testy mają podobne podejście: wykorzystują zmianę preferencji zwierzęcia do jednego awersyjnego środowiska nad innym jako wskaźnik ich stanu afektywnego/motywacyjnego. Test MCA to paradygmat 3-komorowy składający się z jasno oświetlonej komory, po której następuje ciemna komora środkowa z sondami o regulowanej wysokości i ciemna trzecia komora bez żadnych bodźców awersyjnych. Mysz, która nie odniosła obrażeń, jest zazwyczaj zmotywowana do ucieczki do ciemnej komory, biorąc pod uwagę wrodzoną awersję gryzoni do jasnego światła12. W tym przykładzie naturalna motywacja do ucieczki z jasno oświetlonego otoczenia przezwycięża niechęć do spotykania się ze stymulacją tylnych łap (sondy o regulowanej wysokości), która występuje wyłącznie w zaciemnionym otoczeniu. W przeciwieństwie do tego, mysz odczuwająca ból (na przykład z powodu stanu zapalnego lub neuropatii) może zdecydować się na spędzenie większej ilości czasu w jasno oświetlonym otoczeniu, ponieważ istnieje motywacja do unikania nieprzyjemnych doświadczeń dotykowych sond mechanicznych w warunkach trwającej nadwrażliwości dotykowej.
Ten artykuł opisuje zmodyfikowaną wersję testu MCA. Dostosowaliśmy oryginalną metodę (która została przeprowadzona na szczurach6) do stosowania u myszy. Zmniejszyliśmy również liczbę testowanych wysokości sond z sześciu do trzech (0, 2 i 5 mm nad poziomem podłogi), aby usprawnić pozyskiwanie danych. Podejście to zostało przetestowane w wielu modelach bólu i potwierdzone znanymi lekami przeciwbólowymi, co wskazuje, że nadwrażliwość na ból i/lub związane z nią zmiany afektywne i motywacyjne napędzają te zmiany w zachowaniu. To podejście jest stosunkowo szybkie do przeprowadzenia i można je dostosować w porównaniu z innymi środkami nierefleksyjnymi, które mogą wymagać wielu dni przyzwyczajenia i treningu1,2. W połączeniu z innymi miarami bólu, MCA może generować cenne informacje na temat afektywnych i motywacyjnych aspektów bólu.

<table><tbody><tr><td>32,8 stopy 3000K-6000K Przestrajalne białe taśmy LED, ściemnialne super jasne taśmy LED z 600 diodami LED SMD 2835</td><td>Lepro</td><td>SKU: 410087-DWW-US</td><td>Do komory oświetleniowej 1.</td></tr><tr><td>https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html Wydrukowane w 3D "łóżko z kolcami" i "komora 2 piętro"</td><td>Shapeways</td><td>N/A</td><td>Opcjonalnie, do sond mechanicznych jako alternatywa dla pinów mapy.</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Różne</td><td>nie dotyczy</td><td>Do czyszczenia MCA między myszami.</td></tr><tr><td>Acryl-Hinge 2</td><td>TAP Plastics</td><td>N/A</td><td>do mocowania pokryw komór do tylnych ścian. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122</td></tr><tr><td>Arkusz akrylowy Chemcast Cast, przezroczysty</td><td>TAP Plastics</td><td>N/A</td><td>o grubości 3 mm. Na przednią ścianę komory 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510</td></tr><tr><td>Chemcast Cast Przezroczysty kolorowy akryl, przezroczysty ciemnoczerwony - 50%</td><td>TAP Plastics</td><td>N/A</td><td>o grubości 3mm. 50% przepuszczalności światła. Do ścian i pokryw komór 2 i 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519</td></tr><tr><td>Chemcast Półprzezroczysty i Nieprzezroczysty kolorowy odlew akrylowy, znak nieprzezroczysty biały - 0,1%</td> <td>TAP Tworzywa sztuczne</td><td>N/A</td><td>o grubości 3 mm. Do ścian bocznych i pokrywy komory 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341</td></tr><tr><td>Środek dezynfekujący (np. Quatricide)</td><td>Pharmacal Research Laboratories, Inc.</td><td>65020F</td><td>Do dezynfekcji MCA na koniec sesji testowej.</td></tr><tr><td>Markery i tablica suchościeralna</td><td>Różne</td><td>nie dotyczy</td><td>Aby dodać informacje eksperymentalne na początku materiału wideo.</td></tr><tr><td>Piny mapowe</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Opcjonalnie, do sond mechanicznych. Użyj papieru ściernego, aby stępić ostre punkty przed użyciem. Może być stosowany zamiast części drukowanych w 3D.</td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do czyszczenia/dezynfekcji MCA.</td></tr><tr><td>SCIGRIP Weld-On #3 Cement akrylowy</td><td>TAP Plastics</td><td>N/A</td><td>Do montażu arkuszy akrylowych w komorach i mocowania zawiasów. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131</td></tr><tr><td>Stoper</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do nagrywania opóźnień ucieczki/czasów przebywania w czasie rzeczywistym lub z nagranego wideo.</td></tr><tr><td>Timer</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Aby zapewnić włączenie diody LED, usuwanie bariery i zakończenie testu są konsekwentnie mierzone w czasie.</td></tr><tr><td>Kamera wideo</td><td>Różne</td><td>HDRCX405 Kamera Handycam</td><td>Do nagrywania zachowania myszy w urządzeniu MCA. Można go zastąpić dowolną kamerą wideo klasy konsumenckiej o rozdzielczości 1080p.</td></tr><tr><td>Statyw</td><td>Famall</td><td>N/A</td><td>Dopuszczalny jest każdy statyw, który może utrzymać kamerę na wysokości ławki do nagrywania materiału MCA.</td></tr></tbody></table>

mechaniczny test unikania konfliktów do pomiaru zachowania bólowego u myszy

Mechanical Conflict-Avoidance Assay to Measure Pain Behavior in Mice

Ból składa się zarówno z wymiarów sensorycznych (nocyceptywnych), jak i afektywnych (nieprzyjemnych). W modelach przedklinicznych ból był tradycyjnie oceniany za pomocą testów refleksyjnych, które pozwalają na wnioskowanie dotyczące komponentu nocyceptywnego bólu, ale dostarczają niewiele informacji na temat afektywnego lub motywacyjnego komponentu bólu. Opracowanie testów, które wychwytują te składniki bólu, jest zatem ważne z punktu widzenia translacji. Dlatego naukowcy muszą używać nierefleksyjnych testów behawioralnych, aby badać percepcję bólu na tym poziomie. Mechaniczne unikanie konfliktów (MCA) jest uznanym dobrowolnym, nieodruchowym testem zachowania, służącym do badania reakcji motywacyjnych na szkodliwy bodziec mechaniczny w paradygmacie 3-komorowym. Zmiana preferencji lokalizacyjnych myszy w obliczu konkurujących ze sobą szkodliwych bodźców służy do wnioskowania o postrzeganej nieprzyjemności jasnego światła w porównaniu ze stymulacją dotykową łap. Protokół ten przedstawia zmodyfikowaną wersję testu MCA, który badacze bólu mogą wykorzystać do zrozumienia reakcji afektywno-motywacyjnych w różnych modelach bólu myszy. Chociaż nie zostało to tutaj szczegółowo opisane, nasze przykładowe dane MCA wykorzystują dopodeszwowy kompletny adiuwant Freunda (CFA), oszczędzone uszkodzenie nerwu (SNI) oraz model złamania/odlewu jako modele bólu w celu zilustrowania procedury MCA.

Test MCA był z sukcesem stosowany w kilku mechanistycznie odmiennych mysich modelach bólu. Rysunek 2 przedstawia dane, w których wybraną miarą wyniku było przekroczenie punktu środkowego komory 2 (Rysunek 2A). Dane uzyskane przy zastosowaniu punktu połowy drogi w porównaniu z ucieczką do komory 3 są bardzo podobne, ~40 s dla połowy drogi względem ~45 s dla ucieczki do komory 3 w modelu bólu neuropatycznego wywołanego urazem oszczędzającym nerw (SNI) przy wysokoś...

Mechaniczny test unikania konfliktów jest używany jako nierefleksyjny odczyt wrażliwości na ból u myszy, który może być wykorzystany do lepszego zrozumienia reakcji afektywno-motywacyjnych w różnych modelach bólu myszy.

Mechaniczny test unikania konfliktów do pomiaru zachowania bólowego u myszy

Pain comprises of both sensory (nociceptive) and affective (unpleasant) dimensions. In preclinical models, pain has traditionally been assessed using ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania dotyczące skutecznego lub motywacyjnego stanu zwierząt w różnych stanach bólowych. Jest to ważny krok w kierunku poprawy przełożenia badań przedklinicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo szybka i łatwa do wykonania, a mimo to ocenia złożone motywacje, które wpływają na zachowanie związane z bólem.Zacznij od skonstruowania ścian bocznych, podłogi i sufitu komory pierwszej przy użyciu nieprzezroczystego białego akrylu o grubości trzech milimetrów. Do ściany frontowej użyj przezroczystego akrylu o grubości trzech milimetrów. Przymocuj pokrywę komory pierwszej za pomocą zawiasu, aby myszy można było łatwo umieścić w komorze i wyjąć z niej.Następnie przymocuj samoprzylepną taśmę z diodami elektroluminescencyjnymi do wewnętrznej powierzchni pokrywy, aby zapewnić oświetlenie o natężeniu około 4 800 luksów. Wsuń i wysuń nieprzezroczysty arkusz akrylowy z pozycji, aby zamknąć komorę pierwszą od reszty urządzenia MCA. Następnie zbuduj nieoświetloną komorę o długości 270 milimetrów, komorę testową MCA, używając półprzezroczystego ciemnoczerwonego akrylu ze wszystkich stron z pokrywą na zawiasach na górze.Następnie umieść siatkę 13 x 31 z dwoma milimetrowymi otworami na dnie komory, przez które może wystawać szereg sond z końcówkami o średnicy 0,5 milimetra. Dostosuj wysokość sond, umieszczając dodatkowe arkusze akrylowe pod płytą podstawy sondy. Korzystając z tego podejścia, skonfiguruj urządzenie z zerową, dwu- i pięciomilimetrową wysokością sondy.Jako alternatywę dla stępionych pinezek mapy lub podobnych materiałów, użyj plików drukarki 3D do wydrukowania podłogi komory drugiej i płytki sondy z zmywalnego i biokompatybilnego materiału, takiego jak plastik nylonowy 12. Na koniec zbuduj ciemną komorę trzecią, używając półprzezroczystego ciemnoczerwonego akrylu ze wszystkich stron z pokrywą na zawiasach, podobną do komór pierwszej i drugiej. Umieść go na przeciwległym końcu komory pierwszej, aby służył jako zaciemniony obszar ucieczki od sond mechanicznych w komorze drugiej.Dzień przed zaplanowaniem testów podstawowych zaaklimatyzuj myszy w jednostce MCA na 5 do 15 minut z ich kolegami z klatki, aby ułatwić społeczną eksplorację całego urządzenia. Upewnij się, że diody LED w komorze pierwszej są wyłączone, bariera między komorą pierwszą a drugą jest otwarta, a sondy nie wystają z podłogi komory drugiej. Następnie skonfiguruj kamerę wideo zdolną do nagrywania materiału o rozdzielczości 1080 pikseli na statywie z widokiem z boku na całe urządzenie MCA.Dostosuj pole widzenia w taki sposób, aby MCA wypełniło zarejestrowany obraz. Po rozpoczęciu nagrywania przytrzymaj ręczną tablicę suchościeralną w widoku pola kamery, aby oznaczyć początek filmu informacjami identyfikującymi przebieg testów zwierzęcia. W pierwszym uruchomieniu ustaw wysokość sondy na zero i przenieś mysz, która ma być testowana, z klatki domowej do komory pierwszej z założonymi drzwiami bariery.Uruchom licznik czasu, który jest widoczny w nagranym materiale filmowym. Po 10 sekundach włącz w komorze jedną diodę LED. Po tym, jak mysz znajduje się w oświetlonej komorze przez 20 sekund, usuń barierę między komorą pierwszą a drugą.Obserwuj zwierzę przez dwie minuty i mierz opóźnienia lub czasy przebywania za pomocą stopera w trakcie trwania testu. Zapisz opóźnienie do pierwszego wejścia do komory drugiej, opóźnienie do przejścia więcej niż połowy komory drugiej, całkowity czas przebywania w komorze drugiej, opóźnienie do osiągnięcia komory trzeciej oraz całkowity czas przebywania w każdej komorze w ciągu dwóch minut i przelicz je na proporcje. Po zakończeniu testowania umieść mysz z powrotem w klatce domowej.Oczyść komory MCA 70% etanolem i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Po przeprowadzeniu wszystkich myszy w kohorcie z wysokością sondy ustawioną na zero, włóż trzymilimetrowy arkusz akrylu pod płytkę podstawy sondy mechanicznej i powtórz bieg z wysokością sondy wynoszącą dwa milimetry. Po uruchomieniu wszystkich myszy z wysokością sondy ustawioną na dwa milimetry, włóż kolejny trzymilimetrowy arkusz akrylu pod płytkę podstawy sondy i powtórz przebieg z sondą o wysokości pięciu milimetrów.Wykonaj końcowe czyszczenie środkiem dezynfekującym na koniec sesji testowej. W kompletnym modelu bólu zapalnego wywołanego adiuwantem Freunda, wstrzyknięcie soli fizjologicznej nie zmienia latencji ucieczki w porównaniu z wartością wyjściową. Myszy, którym wstrzyknięto adiuwant, wykazały znaczny wzrost opóźnienia ucieczki cztery dni po wstrzyknięciu, ale tylko wtedy, gdy wysokość sondy została podniesiona do pięciu milimetrów.Tego zwiększonego opóźnienia nie zaobserwowano u myszy, które otrzymały karprofen 90 minut przed rozpoczęciem testów. Oszczędzony model uszkodzenia nerwów bólu neuropatycznego znacznie zwiększył opóźnienie ucieczki w porównaniu z wartością wyjściową, gdy wysokość sondy była ustawiona na pięć milimetrów. Wzrostowi temu zapobiegło podanie opioidowego leku przeciwbólowego buprenorfiny na 90 minut przed badaniem.Zwiększone opóźnienie ucieczki zaobserwowano również u myszy, które nie przeszły podstawowej rundy testów MCA przed uszkodzeniem nerwów. Zwiększonej latencji ucieczki u myszy z oszczędzonym uszkodzeniem nerwów na poziomie pięciu milimetrów zapobiegła gabapentyna podana 90 minut przed badaniem. W modelu złamania lub odlewu opóźnienie ucieczki z komory pierwszej wzrastało proporcjonalnie do wysokości sondy przed uszkodzeniem.Po urazie opóźnienie pozostało niezmienione na poziomie zero milimetrów, ale znacznie wzrosło na wysokości sondy wynoszącej dwa milimetry i pięć milimetrów dla mężczyzn oraz pięciomilimetrowej wysokości sondy dla kobiet w porównaniu z wartością wyjściową. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas próby tej procedury, jest upewnienie się, że wszystkie myszy są przyzwyczajone do urządzenia MCA oraz utrzymanie prawidłowej randomizacji i zaślepienia przez cały czas trwania badania. Metoda ta może być stosowana wraz z innymi miarami wrażliwości na ból, w tym von Freyem lub warunkową preferencją miejsca.

mechanical-conflict-avoidance-assay-to-measure-pain-behavior-in-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Elektroniczne pomiary von Freya są skuteczną i ulepszoną alternatywą dla klasycznych filamentów von Freya, ponieważ pozwalają na szybki i precyzyjny pomiar zmian w progach mechanicznego wycofywania gryzoni do stale stosowanych bodźców ciśnieniowych przed i po zdarzeniu zapalnym.

Pomiar zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya

Opisujemy protokół do badania rozwoju hiperalgezji i tolerancji wywołanej opioidami u myszy. Opierając się na pomiarze termicznych i mechanicznych reakcji nocyceptywnych zwierząt nieleczonych morfiną i leczonych morfiną, pozwala na ilościowe określenie wzrostu wrażliwości na ból (hiperalgezja) i spadku analgezji (tolerancji) związanego z przewlekłym podawaniem opiatów.

Ocena hiperalgezji wywołanej morfiną i tolerancji przeciwbólowej u myszy przy użyciu termicznych i mechanicznych modalności nocyceptywnych

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA), czyli choroba zwyrodnieniowa stawów, jest wyniszczającym stanem związanym z bólem, który pozostaje tylko częściowo kontrolowany przez dostępne leki przeciwbólowe. Opracowywane są modele zwierzęce, które mają na celu lepsze zrozumienie mechanizmów bólu związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów. W tym miejscu opisujemy metodologię monojodooctanowego modelu bólu zwyrodnieniowego stawów u myszy.

Model monojodooctanu bólu związanego z chorobą zwyrodnieniową stawów u myszy

W tym artykule podajemy szczegóły dotyczące metod produkcji i kontroli jakości rekombinowanego białka fuzyjnego IL4-10. Pokazujemy również, jak przetestować skuteczność tego białka w rozwiązywaniu bólu w mysim modelu bólu zapalnego.

Opracowanie białek rekombinowanych w leczeniu bólu przewlekłego

Zazwyczaj, model wstrzykiwania szyi myszy jest używany do oceny zachowań związanych z zadrapaniami wywołanymi przez świąd. Jednak model dostarcza informacji tylko o swędzeniu, a nie bólu. Tutaj u myszy wprowadza się model wstrzykiwania policzka, który może być używany do jednoczesnego pomiaru bólu i zachowań związanych ze swędzeniem.

Model iniekcji policzkowej do jednoczesnego pomiaru bólu i zachowań związanych ze swędzeniem

Opracowaliśmy wywołaną miarę bólu stawów i połączyliśmy ją ze standardową metodą pomiaru spontanicznego bólu w różnych mysich modelach chemicznie wywołanego zapalenia stawów. Miary te są czułe i powtarzalne dla różnych rodzajów bólu stawów.

Spontaniczne i wywołane pomiary bólu w mysich modelach jednostawowego bólu kolana

Aby opracować nowatorskie interwencje terapeutyczne w celu zapobiegania i leczenia bólu pleców, potrzebne są modele zwierzęce, które zbadają mechanizmy i skuteczność tych terapii z perspektywy translacyjnej. Niniejszy protokół opisuje test BMS, znormalizowaną metodę oceny wrażliwości mechanicznej pleców u szczura.

Ocena wrażliwości mechanicznej pleców u szczura do mechanistycznego badania przewlekłego bólu pleców

Metody prostej, szybkiej indukcji modelu bólu pleców u myszy są tutaj dostępne za pomocą iniekcji aktywatora plazminogenu w moczu do wnętrza więzadła.

Model bólu pleców myszy wywołany aktywatorem plazminogenu typu urokinazy

Ten protokół opisuje ocenę mechanicznej nadwrażliwości w modelu szczura neuropatycznego bólu ustno-twarzowego przy użyciu instrumentalnego urządzenia do oceny bólu ustno-twarzowego.

Ocena nadwrażliwości mechanicznej wywołanej uszkodzeniem nerwów u szczurów za pomocą operacyjnego testu bólu ustno-twarzowego

Tutaj prezentujemy zmodyfikowany model bólu zapalnego z wstrzyknięciem karagenu zarówno tylnej łapy, jak i w celu oceny efektu przeciwbólowego.

Zmodyfikowany model bólu zapalnego do badania działania przeciwbólowego u myszy

Protokół opisuje, jak mierzyć hiperalgezję kolana u myszy. Pokazujemy przykłady ostrego bólu kolana na mysich oraz modeli choroby zwyrodnieniowej stawów (OA).

Ocena hiperalgezji kolana u myszy za pomocą pomiaru ciśnienia

Poznaj mechaniczny test unikania konfliktów do oceny wrażliwości bólowej u myszy. Ta metoda pozwala badać motywacyjne aspekty zachowania bólowego i usprawnia translację badań przedklinicznych.

Mechaniczny test unikania konfliktów do pomiaru zachowania bólowego u myszy

Przeglądaj więcej filmów