In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Cześć, nazywam się Kai Jin i pracuję na Uniwersytecie Yangzhou. W imieniu naszej grupy badawczej zamierzam zaprezentować potężne narzędzie, jakim jest zarodek kurczaka w badaniach rozwojowych. Zarodek kurczaka jest klasycznym modelem rozwojowym, który został wykorzystany do zbadania rozwoju i różnicowania, w rzeczywistości zewnętrzne pomiary laboratoryjne w zarodkach kurczaków są cennym narzędziem dla biologii rozwojowej, takiej jak transfekcja genów, hodowla transgeniczna i preparat transmuralny gonad.

W naszym laboratorium ustaliliśmy metody wstrzykiwania typu mu, ale dla wielu badaczy szczegóły iniekcji są niejasne i trudne do ustalenia. W tym filmie pokażemy szczegóły iniekcji naczyniowej we wczesnym stadium rozwoju zarodka kurczaka w ovo. Jeśli jesteś zainteresowany, skontaktuj się z nami.

Tutaj pokazujemy szczegóły protokołu. Pobieranie i przygotowanie zapłodnionych jaj. Po pierwsze, w przeciwieństwie do ssaków, kurczak ma miliony pęcherzyków w jednym jajniku, ale tylko kilka z tych pęcherzyków jest wystarczająco dojrzałych, aby owulować.

Każdy pęcherzyk zawiera jedną komórkę jajową lub komórkę rozrodczą. Gdy tylko pęcherzyk dojrzeje i uwolni żółtko, jest on wbudowywany do lejka jajowodu. Gdy pęcherzyk dostaje się do brzucha szyjnego jajowodu, nasienie wiąże się z jajem w ciele kury, a wapń w ciele kury tworzy skorupkę, która otacza zapłodnione jajo, tworząc w ciele jajo o miękkiej skorupce.

Skorupki wapnia stopniowo gęstnieją, aż do wyprodukowania jaja. Zbierz zapłodnioną komórkę jajową, zwaną naukowo jajami zarodkowymi i umieść ją starannie na stojaku w inkubatorze w temperaturze 37,8 stopni Celsjusza i wilgotności 60%. Zarodki są inkubowane w odpowiednich warunkach.

Po dwóch dniach inkubacji pojawiają się małe pulsujące czerwone kropki zwane pierwotnymi sercami. Ten proces nazywa się ubijaniem wiśni. Po około 2,5 dnia widoczne są naczynia krwionośne i uformowały się segmenty serca i ciała.

Przygotowanie igieł i plazmidów. Jako igieł używamy szklanych naczyń włosowatych. Przed iniekcją należy przygotować szklane kapilary o średnicy zewnętrznej jednego milimetra i średnicy wewnętrznej 0,6 milimetra.

Materiałami egzogennymi są zwykle plazmidy, pakowane lentiwirusy i pierwotne komórki rozrodcze lub PGC. W tym filmie używamy błękitu trypanowego, aby pokazać ślad wstrzykniętych materiałów. Windowing. Przed wystawieniem zarodków musimy je wysterylizować, aby zapobiec zarażeniu zarazkami.

Odbywa się to poprzez delikatne przetarcie powierzchni zarodków wacikiem o stężeniu 75% alkoholu w miejscu otwarcia komórki jajowej. Po dezynfekcji delikatnie postukaj kleszczami w koniec skorupki jajka i ostrożnie przytnij kleszczami otwór o wymiarach 0,5 centymetra na 0,5 centymetra na powierzchni skorupki jajka, aby odsłonić zarodek. Iniekcja donaczyniowa in ovo.

Spójrz na widok pod mikroskopem, wyreguluj ostrość mikroskopu, aby najpierw zlokalizować zarodek, a następnie znajdź naczynia krwionośne zarodka kurczaka gotowe do wstrzyknięcia. Skieruj igłę z substancją egzogenną na naczynie krwionośne, zwracając uwagę, że igła jest równoległa do wstrzykiwanego naczynia krwionośnego. Delikatnie włóż igłę do naczynia krwionośnego, a następnie włącz pompę powietrza.

W tym momencie obca substancja dostaje się do tętnicy i wraz z biciem serca krąży z powrotem do zarodka przez tętnicę, a następnie do żyły. Istnieją dwa rodzaje zastrzyków naczyniowych. Jednym z nich jest wstrzyknięcie w głowę, w którym obca substancja jest wstrzykiwana z żyły w głowie zarodka i przepływa z powrotem do serca.

Drugi to wstrzyknięcie do aorty grzbietowej, w którym obca substancja krąży do zarodka wraz z biciem serca. Wraz z biciem serca embrionalnego i krążeniem krwi możemy wyraźnie zobaczyć, że materiał obcy jest odbierany przez naczynia włosowate na końcu tętnicy, do żyły, a następnie wraca do zarodka z żyły, co wskazuje, że wstrzyknięty materiał obcy jest skutecznie dostarczany do każdej części zarodka. Po wstrzyknięciu wyjmij komórkę jajową z mikroskopu stereoskopowego, małymi nożyczkami odetnij trzycentymetrowy kawałek taśmy medycznej i przymocuj taśmę do otworu.

Delikatnie zeskrob taśmę nożyczkami, aby wycisnąć wszelkie pęcherzyki powietrza, a następnie odetnij kolejny kawałek taśmy, aby uszczelnić otwór w krzyż. Po uszczelnieniu otworu, wstrzyknięte zarodki są ostrożnie umieszczane z powrotem w inkubatorze. Tutaj pokazujemy reprezentatywne obrazy zarodków kurczaka po wstrzyknięciu.

Pierwszy obraz przedstawia wynik iniekcji plazmidu lentiwirusa. Zielona fluorescencja pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym wskazuje na pomyślną ekspresję wstrzykniętego plazmidu w zarodkach. Sugeruje to możliwość donaczyniowego wstrzykiwania plazmidów do zarodków kurczaków.

Drugi obraz przedstawia wyniki wstrzyknięcia PGC. PGC zostały oznaczone jako RFP. Na tym zdjęciu mogliśmy zobaczyć wstrzyknięte PGC, które są tutaj czerwonymi punktami, znajdującymi się w gonadzie biorcy.

Wskazuje to, że PGC dawcy były w stanie skutecznie wejść i skolonizować gonadę biorcy. Podsumowując, protokół ten przedstawia proces in-ovo donaczyniowego wstrzykiwania materiałów egzogennych, plazmidów lub PGC do zarodków kurczaków. Pokazana tutaj metoda jest łatwa do naśladowania i nauczenia się oraz warta zastosowania w wielu dziedzinach.

To wszystko, czym chciałbym się z Wami podzielić. Mam nadzieję, że takie podejście ułatwi Panu pracę jako potężne narzędzie badawcze w zakresie osadzania zarodków kurzych i biologii rozwoju. Dziękujemy za obejrzenie tego filmu i życzymy powodzenia w badaniach.