Name: In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj technikę iniekcji donaczyniowej in ovo w zarodkach kurczaka do badań biologii rozwoju. Metoda umożliwia transfekcję genów i tworzenie organizmów transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31972547). Doceniamy redakcję Jing Wang i głos Malika Donlica z Washington State University, USA.

Wszystkie procedury związane z opieką i użytkowaniem zwierząt były zgodne z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia Stanów Zjednoczonych (NIH Pub. No. 85-23, poprawione w 1996 roku), a protokoły dotyczące zarodków kurczaków zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Zarządzania Zwierzętami Laboratoryjnymi i Etyki Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Yangzhou, Chiny (nr 201803124).
1. Pobieranie i przygotowanie zapłodnionych jaj
UWAGA: W przeciwieństwie do ssaków, kurczak ma miliony pęcherzyków w jednym jajniku, ale tylko kilka z tych pęcherzyków jest wystarczająco dojrzałych, aby owulować. Każdy pęcherzyk zawiera jedną komórkę jajową lub komórkę rozrodczą. Gdy tylko pęcherzyk dojrzeje i uwolni żółtko, jest on wbudowywany do lejka jajowodu. Gdy pęcherzyk dostaje się do brzucha szyjnego jajowodu, nasienie wiąże się z jajem w ciele kury, a wapń w ciele kury tworzy skorupkę, która otacza zapłodnione jajo, tworząc w ciele jajo o miękkiej skorupce. Skorupa wapniowa stopniowo gęstnieje, aż do wyprodukowania jaja.
<ol>
	<li>Odbierz zapłodnione jaja od lokalnego sprzedawcy lub instytucji, które można przechowywać w temperaturze 16°C przez 1 tydzień. 
	UWAGA: Wysoka temperatura przechowywania pomoże zarodkowi się rozwijać, podczas gdy niska temperatura zmniejszy żywotność zarodka. Zarodki nie rozwiną się, jeśli czas przechowywania będzie zbyt długi.</li>
	<li>Delikatnie i powoli wyszoruj skorupkę jajka 75% etanolem przed przeniesieniem jaj do inkubatora.</li>
	<li>Ułóż jaja bokiem, starannie na stojaku w inkubatorze w temperaturze 37,8 °C i wilgotności 60%. Po 60 godzinach inkubacji (HH stage 17) na zarodkach pojawią się widoczne naczynia krwionośne, a serce zacznie bić15. 
	UWAGA: Po 2 dniach inkubacji pojawiają się małe pierwotne kropki, wczesne stadium serca. Ten proces nazywa się wiśniowym beadingiem. Po ~2,5 dnia serce i inne segmenty ciała są uformowane z widocznymi naczyniami.</li>
</ol>
2. Przygotowanie przed wstrzyknięciem
<ol>
	<li>Przygotuj szklane naczynia włosowate, które będą używane jako igły. Przed iniekcją należy za pomocą ściągacza wyciągnąć kapilary szklane o średnicy 90 mm i średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 0,6 mm. Odłamać końcówki za pomocą kleszczyków (kąt nachylenia szklanej kapilary wynosi zwykle 45°) i sterylizować naczynia włosowate w świetle UV przez 2 godziny.</li>
	<li>Przygotuj materiały egzogenne, takie jak plazmidy, pakowane lentiwirusy i PGC.
	<ol>
		<li>Delikatnie wymieszaj plazmid pEGFP-N1 (plazmid o zwiększonej ekspresji GFP, 1 μg / μl) z liposomem w stosunku 1:3 (m/v). Dodać wodę, aby uzyskać końcowe stężenie DNA 10 ng/μl. Pozostawić mieszaninę DNA w temperaturze 37 °C na 20 minut przed wstrzyknięciem.</li>
		<li>Rozmrozić wirusy na lodzie przed wstrzyknięciem. Miano lentiwirusa używanego do wstrzykiwań powinno wynosić ponad 5 x 106 Tu/ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć rodzicielskie lub zmodyfikowane gonady PGC (E4.5, HH stopień 24) do 2,000-5,000 komórek/μL. 
		UWAGA: Tutaj pokazaliśmy procedurę wstrzykiwania za pomocą błękitu trypanowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Okienka
<ol>
	<li>Przed wystawieniem zarodków należy je wysterylizować, delikatnie i miękko przecierając powierzchnię skorupek jaj 75% alkoholem za pomocą wacika, upewniając się, że dokładnie wysterylizowano krawędź jaj.</li>
	<li>Po sterylizacji delikatnie postukaj kleszczami w koniec, aby utworzyć małe okienko (0,5 cm x 0,5 cm) na powierzchni skorupki jajka, aby odsłonić zarodek. Usuń błonę zarodka, a następnie umieść jajo na uchwycie pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
</ol>
4. Wtrysk
<ol>
	<li>Poszukaj naczyń krwionośnych pod mikroskopem i dostosuj ostrość mikroskopu preparacyjnego, aby zlokalizować zarodek, a następnie znajdź naczynie krwionośne gotowe do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Napełnij szklaną igłę roztworem egzogennym (plazmid, lentiwirus lub PGC) za pomocą pipety powoli, unikając pęcherzyków powietrza w igle.</li>
	<li>Skierować igłę z roztworem egzogennym na naczynie krwionośne, tak aby igła była ustawiona równolegle do wstrzykiwanego naczynia krwionośnego.</li>
	<li>Delikatnie włóż napełnioną igłę do naczynia i włącz pompę, aby wyrzucić roztwór (zwykle wstrzyknięta objętość wynosi ~1-5 μL) pod mikroskopem. Ciśnienie pompy powietrza powinno być wystarczająco niskie, aby zapobiec zniszczeniu naczyń, ponieważ zbyt wysokie ciśnienie powietrza uszkodziłoby naczynia krwionośne, prowadząc do przepływu z dużą prędkością.
	<ol>
		<li>Po wstrzyknięciu roztworu egzogennego do naczynia upewnij się, że kolor naczynia zmieni się w kolor roztworu i powróci do czerwieni w ciągu 2-5 sekund, co oznacza, że roztwór egzogenny został pomyślnie dostarczony do naczynia. W tym momencie roztwór dostaje się do tętnicy i wraz z biciem serca krąży z powrotem do zarodka przez tętnicę, a następnie do żyły. 
		UWAGA: Istnieją dwa miejsca wstrzyknięcia do wstrzyknięcia naczyniowego (<klasa silna = "xfig" >Ryc. 1B): jedno to głowa, w której roztwór egzogenny jest wstrzykiwany z żyły w głowie zarodka i do serca przez przepływ krwi, a następnie krąży do całego zarodka z bijącym sercem (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1B, strzałka 1). Innym jest aorta grzbietowa krwi zarodka; roztwór egzogenny jest wstrzykiwany i rozprzestrzenia się na cały zarodek (<klasa silna = "xfig" > Ryc. 1B. Strzałka 2) z biciem serca embrionalnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy wyjąć komórkę jajową z mikroskopu stereoskopowego i wrzucić 200 μl roztworu penicyliny do wnętrza skorupki jajka. Wytnij kawałek taśmy medycznej o długości 3 cm i uszczelnij okno. Delikatnie zeskrob taśmę nożyczkami, aby wycisnąć wszelkie pęcherzyki powietrza, a następnie odetnij kolejny kawałek, aby uszczelnić otwór w poprzek.</li>
	<li>Oznaczyć i umieścić wstrzyknięte jajo z powrotem w inkubatorze i inkubować do wymaganego etapu rozwojowego lub wylęgu.</li>
</ol>

<ol><li>Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+embryo+as+a+model+in+epigenetic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Chicken embryo as a model in epigenetic research.</a> Poultry Science. 100 (7), 101164(2021).</li>
<li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDarnell%2C+DK+%22Developmental+Biology+Protocols%22">Developmental Biology Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).</li>
<li>Fauzia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo%3A+a+preclinical+model+for+understanding+ischemia-reperfusion+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1034(2018).</li>
<li>Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+embryo+as+an+in+vivo+experimental+model+for+drug+testing%3A+Advantages+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations.</a> Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).</li>
<li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (9), e408(2007).</li>
<li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3792(2012).</li>
<li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55628(2017).</li>
<li>van de Lavoir, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+of+genetically+modified+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germline transmission of genetically modified primordial germ cells.</a> Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).</li>
<li>Ballantyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+primordial+germ+cells+are+bipotent+for+male+or+female+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827(2021).</li>
<li>Park, T. S., Han, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+into+primordial+germ+cells+is+an+efficient+tool+for+transgenesis+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+insertion+into+Z+chromosome+of+chicken+primordial+germ+cells+for+avian+sexing+model+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development.</a> The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).</li>
<li>Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHan%2C+JY+%22Avian+and+Reptilian+Developmental+Biology%3A+Methods+and+Protocols%22">Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. 229-242 (2017).</li>
<li>Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+chicken+primordial+germ+cells+isolated+from+embryonic+blood+and+production+of+germline+chimaeric+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Reproduction+Science%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens.</a> Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization+and+germline+chimera+preparation+of+primordial+germ+cells+from+the+Chinese+Meiling+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken.</a> Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+genes+and+pathways+in+chicken+germ+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UBE2I+stimulates+female+gonadal+differentiation+in+chicken+%28Gallus+gallus%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Agriculture%22%5BJournal%5D)">UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos.</a> Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGCS1+promotes+male+differentiation+of+chicken+embryos+by+regulating+the+generate+of+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22All+Life%22%5BJournal%5D)">HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol.</a> All Life. 14 (1), 577-587 (2021).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin1z+induces+the+male+pathway+in+the+chicken+by+down-regulating+Tcf4%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4.</a> Gene. 780, 145521(2021).</li>
<li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+viable+chicken+by+allogeneic+transplantation+of+primordial+germ+cells+induced+from+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 2989(2021).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Metoda iniekcji donaczyniowej in ovo zarodków kurczaków jest zoptymalizowana pod kątem transferu materiałów egzogennych (wektorowych, wirusowych lub PGC) do zarodka. W oparciu o tę metodę skonstruowaliśmy modele zarodków kurzych ze stabilną nadekspresją lub interferencją genów (SpinZ, JUN, UBE2I itp.) 17,18,19. Te dobrze ugruntowane modele dowodzą wykonalności tego podejścia. Ponadto nie tylko przenieśliśmy izolowane PG...

Embriony kurczaka są powszechnie używane od wieków w zastosowaniach rozwojowych, immunologicznych, patologicznych i innych biologicznych1,2,3. Mają wiele nieodłącznych zalet w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi w badaniach toksykologii i biologii komórki4. Zarodki kurze są łatwo dostępne i można nimi manipulować in vitro oraz bezpośrednio obserwować na każdym etapie rozwoju, co zapewnia poręczny system modeli badań nad zarodkami.
Ogólnie, obecne metody dostarczania zarodków kurzych, takie jak elektrotransfekcja i wstrzyknięcie do jamy podzarodkowej, mają ograniczenia, takie jak wymóg specjalistycznego sprzętu i zaprojektowanego programu oraz nieefektywność wynikająca z obecności żółtka i białka5,6,7. W tym miejscu pokazujemy prostą i wydajną metodę dostarczania materiałów egzogennych do zarodków kurczaków. Może to być potężne narzędzie wykorzystywane w badaniach biologii rozwoju. Wstrzyknięte materiały rozprzestrzeniają się do całego zarodka poprzez krążenie krwi. We wczesnym okresie rozwoju zarodków kurcząt PGC mogą migrować przez krew, kolonizować grzbiet narządów płciowych, a następnie przekształcać się w gamety, które stanowią cenną możliwą ścieżkę dostarczania materiałów egzogennych8. Obecnie metoda ta jest szeroko stosowana w badaniach nad funkcją genów, biologią zarodków i rozwoju oraz chimeryczną i transgeniczną produkcją kurczaków9,10,11.
Wstrzyknięcie donaczyniowe in ovo w zarodkach kurcząt jest dobrze znaną i powszechnie stosowaną metodą12,13,14. W tym artykule przedstawiamy kompleksowy opis tego protokołu, w tym materiały do wstrzykiwań, miejsca, dawkowanie i reprezentatywne wyniki.

<table><tbody><tr><td>Makromikroskop fluorescencyjny</td><td>OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapilary</td><td>Narishige</td><td>G1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td> Wektor <td></td><td>liposomu</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td> Invitrogen 12566014 <td>Clontech</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Zestaw łącznika komórek czerwonej fluorescencji&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>wektor lentiwirusa pLVX-EGFP</td><td>Addgene</td><td>128652</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz pneumatyczny</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

Jako klasyczny model systemu biologii embrionalnej, zarodek kurczaka został wykorzystany do zbadania rozwoju i różnicowania embrionalnego. Dostarczanie materiałów egzogennych do zarodków kurcząt ma ogromne zalety w badaniu funkcji genów, hodowli transgenicznej i przygotowywania chimer podczas rozwoju embrionalnego. Tutaj pokazujemy metodę iniekcji donaczyniowej in ovo, za pomocą której materiały egzogenne, takie jak wektory plazmidowe lub zmodyfikowane pierwotne komórki rozrodcze (PGC), mogą być przenoszone do zarodków kurcząt dawców we wczesnych stadiach rozwoju. Wyniki pokazują, że wstrzyknięcie donaczyniowe przez aortę grzbietową i głowę umożliwia dyfuzję wstrzykniętego materiału do całego zarodka przez układ krążenia krwi. W przedstawionym protokole określono skuteczność wprowadzenia egzogennego plazmidu i wektora lentiwirusowego oraz kolonizację wstrzykniętych egzogennych PGC w gonadę biorcy, obserwując fluorescencję w zarodkach. W artykule opisano szczegółowe procedury tej metody, zapewniając tym samym doskonałe podejście do badania funkcji genów, biologii zarodków i rozwoju oraz produkcji kurcząt chimerycznych gonad. Podsumowując, artykuł ten pozwoli naukowcom na przeprowadzenie in ovo dodonaczyniowego wstrzykiwania materiałów egzogennych do zarodków kurczaków z dużym sukcesem i powtarzalnością.

Prezentujemy tutaj metodę wstrzykiwania domyślnego w naczynia krwionośne zarodków kurzych in ovo. Schematyczny przebieg iniekcji wewnątrznaczyniowej przedstawiono na Rysunku 1; w naszym badaniu wykorzystaliśmy różne roztwory egzogenne, aby przetestować i zweryfikować proces wstrzykiwania.
Aby lepiej zwizualizować wstrzyknięte materiały, jako znacznik do zarodka wstrzyknięto błękit trypanowy (0,4%). Zaobserwowano, że znacznik (niebieski) rozprzestrzenia si...

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Cześć, nazywam się Kai Jin i pracuję na Uniwersytecie Yangzhou. W imieniu naszej grupy badawczej zamierzam zaprezentować potężne narzędzie, jakim jest zarodek kurczaka w badaniach rozwojowych. Zarodek kurczaka jest klasycznym modelem rozwojowym, który został wykorzystany do zbadania rozwoju i różnicowania, w rzeczywistości zewnętrzne pomiary laboratoryjne w zarodkach kurczaków są cennym narzędziem dla biologii rozwojowej, takiej jak transfekcja genów, hodowla transgeniczna i preparat transmuralny gonad.W naszym laboratorium ustaliliśmy metody wstrzykiwania typu mu, ale dla wielu badaczy szczegóły iniekcji są niejasne i trudne do ustalenia. W tym filmie pokażemy szczegóły iniekcji naczyniowej we wczesnym stadium rozwoju zarodka kurczaka w ovo. Jeśli jesteś zainteresowany, skontaktuj się z nami.Tutaj pokazujemy szczegóły protokołu. Pobieranie i przygotowanie zapłodnionych jaj. Po pierwsze, w przeciwieństwie do ssaków, kurczak ma miliony pęcherzyków w jednym jajniku, ale tylko kilka z tych pęcherzyków jest wystarczająco dojrzałych, aby owulować.Każdy pęcherzyk zawiera jedną komórkę jajową lub komórkę rozrodczą. Gdy tylko pęcherzyk dojrzeje i uwolni żółtko, jest on wbudowywany do lejka jajowodu. Gdy pęcherzyk dostaje się do brzucha szyjnego jajowodu, nasienie wiąże się z jajem w ciele kury, a wapń w ciele kury tworzy skorupkę, która otacza zapłodnione jajo, tworząc w ciele jajo o miękkiej skorupce.Skorupki wapnia stopniowo gęstnieją, aż do wyprodukowania jaja. Zbierz zapłodnioną komórkę jajową, zwaną naukowo jajami zarodkowymi i umieść ją starannie na stojaku w inkubatorze w temperaturze 37,8 stopni Celsjusza i wilgotności 60%. Zarodki są inkubowane w odpowiednich warunkach.Po dwóch dniach inkubacji pojawiają się małe pulsujące czerwone kropki zwane pierwotnymi sercami. Ten proces nazywa się ubijaniem wiśni. Po około 2,5 dnia widoczne są naczynia krwionośne i uformowały się segmenty serca i ciała.Przygotowanie igieł i plazmidów. Jako igieł używamy szklanych naczyń włosowatych. Przed iniekcją należy przygotować szklane kapilary o średnicy zewnętrznej jednego milimetra i średnicy wewnętrznej 0,6 milimetra.Materiałami egzogennymi są zwykle plazmidy, pakowane lentiwirusy i pierwotne komórki rozrodcze lub PGC. W tym filmie używamy błękitu trypanowego, aby pokazać ślad wstrzykniętych materiałów. Windowing. Przed wystawieniem zarodków musimy je wysterylizować, aby zapobiec zarażeniu zarazkami.Odbywa się to poprzez delikatne przetarcie powierzchni zarodków wacikiem o stężeniu 75% alkoholu w miejscu otwarcia komórki jajowej. Po dezynfekcji delikatnie postukaj kleszczami w koniec skorupki jajka i ostrożnie przytnij kleszczami otwór o wymiarach 0,5 centymetra na 0,5 centymetra na powierzchni skorupki jajka, aby odsłonić zarodek. Iniekcja donaczyniowa in ovo.Spójrz na widok pod mikroskopem, wyreguluj ostrość mikroskopu, aby najpierw zlokalizować zarodek, a następnie znajdź naczynia krwionośne zarodka kurczaka gotowe do wstrzyknięcia. Skieruj igłę z substancją egzogenną na naczynie krwionośne, zwracając uwagę, że igła jest równoległa do wstrzykiwanego naczynia krwionośnego. Delikatnie włóż igłę do naczynia krwionośnego, a następnie włącz pompę powietrza.W tym momencie obca substancja dostaje się do tętnicy i wraz z biciem serca krąży z powrotem do zarodka przez tętnicę, a następnie do żyły. Istnieją dwa rodzaje zastrzyków naczyniowych. Jednym z nich jest wstrzyknięcie w głowę, w którym obca substancja jest wstrzykiwana z żyły w głowie zarodka i przepływa z powrotem do serca.Drugi to wstrzyknięcie do aorty grzbietowej, w którym obca substancja krąży do zarodka wraz z biciem serca. Wraz z biciem serca embrionalnego i krążeniem krwi możemy wyraźnie zobaczyć, że materiał obcy jest odbierany przez naczynia włosowate na końcu tętnicy, do żyły, a następnie wraca do zarodka z żyły, co wskazuje, że wstrzyknięty materiał obcy jest skutecznie dostarczany do każdej części zarodka. Po wstrzyknięciu wyjmij komórkę jajową z mikroskopu stereoskopowego, małymi nożyczkami odetnij trzycentymetrowy kawałek taśmy medycznej i przymocuj taśmę do otworu.Delikatnie zeskrob taśmę nożyczkami, aby wycisnąć wszelkie pęcherzyki powietrza, a następnie odetnij kolejny kawałek taśmy, aby uszczelnić otwór w krzyż. Po uszczelnieniu otworu, wstrzyknięte zarodki są ostrożnie umieszczane z powrotem w inkubatorze. Tutaj pokazujemy reprezentatywne obrazy zarodków kurczaka po wstrzyknięciu.Pierwszy obraz przedstawia wynik iniekcji plazmidu lentiwirusa. Zielona fluorescencja pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym wskazuje na pomyślną ekspresję wstrzykniętego plazmidu w zarodkach. Sugeruje to możliwość donaczyniowego wstrzykiwania plazmidów do zarodków kurczaków.Drugi obraz przedstawia wyniki wstrzyknięcia PGC. PGC zostały oznaczone jako RFP. Na tym zdjęciu mogliśmy zobaczyć wstrzyknięte PGC, które są tutaj czerwonymi punktami, znajdującymi się w gonadzie biorcy.Wskazuje to, że PGC dawcy były w stanie skutecznie wejść i skolonizować gonadę biorcy. Podsumowując, protokół ten przedstawia proces in-ovo donaczyniowego wstrzykiwania materiałów egzogennych, plazmidów lub PGC do zarodków kurczaków. Pokazana tutaj metoda jest łatwa do naśladowania i nauczenia się oraz warta zastosowania w wielu dziedzinach.To wszystko, czym chciałbym się z Wami podzielić. Mam nadzieję, że takie podejście ułatwi Panu pracę jako potężne narzędzie badawcze w zakresie osadzania zarodków kurzych i biologii rozwoju. Dziękujemy za obejrzenie tego filmu i życzymy powodzenia w badaniach.

in-ovo-intravascular-injection-in-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę transplantacji ludzkich komórek macierzystych do różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego zarodka kurczaka. Stanowi to model in vivo do oceny proliferacji i różnicowania różnych typów ludzkich komórek macierzystych w środowisku tkanki embrionalnej.

Ksenotransplantacja ludzkich komórek macierzystych do zarodka kurczaka

Za pomocą mikropipet z cienkimi końcówkami wstrzykujemy plazmidowe DNA do poddomen somitów lub cewek nerwowych kurczaka. Stężenie plazmidu jest tak dostosowane, aby uzyskać pojedyncze transfekowane komórki. Następnie pozwalamy komórkom przekształcić się w populacje klonalne.

Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

Ten film demonstruje procedurę dożylnego wstrzykiwania komórek rakowych do naczyń krwionośnych błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu wygenerowania modelu przerzutów raka CAM. Wstrzyknięte komórki ostatecznie tworzą rozproszone kolonie pojedynczych komórek nowotworowych, co pozwala na badanie inwazji raka i przerzutów.

Dożylne wstrzyknięcie komórek rakowych do naczyń błony moczowo-omoczniowej kurczaka: procedura mająca na celu ustalenie modelu raka błony moczowo-omoczniowej w celu zbadania inwazji raka i przerzutów

Ekspresja ektopowa to jedna z technik wyjaśniających rolę mikroRNA w rozwoju mózgu. Jednak celowanie w określone obszary za pomocą elektroporacji in ovo jest trudne. Tutaj pokazujemy skuteczny sposób selektywnego elektroportowania brzusznych i grzbietowych obszarów śródmózgowia.

In ovo Ekspresja mikroRNA w brzusznym śródmózgowiu piskląt

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Ten protokół opisuje trzy metody pozyskiwania i wykorzystywania zarodków kurczaków w wieku od 5 do 8 dni oraz ich błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jako modelu in vivo do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków.

Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków

Kurze zarodki, jako klasyczny model rozwojowy, są używane w naszym laboratorium do oceny kardiotoksyczności rozwojowej po ekspozycji na różne zanieczyszczenia środowiska. Metody ekspozycji i metody oceny morfologicznej/funkcjonalnej zostały opisane w niniejszym manuskrypcie.

Wykorzystanie zarodka kurzego jako potężnego narzędzia w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej

Poznaj technikę iniekcji donaczyniowej in ovo w zarodkach kurczaka do badań biologii rozwoju. Metoda umożliwia transfekcję genów i tworzenie organizmów transgenicznych.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Przeglądaj więcej filmów