Model hodowli ludzkiego narządu rogówki z usuwaniem Descemeta tylko z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez zmodyfikowany czynnik wzrostu fibroblastów 1

Celem tego filmu jest opisanie modelu hodowli ludzkiego narządu rogówki Descemeta Stripping Only z przyspieszonym gojeniem, stymulowanym przez zmodyfikowany czynnik wzrostu fibroblastów jeden. Dystrofia śródbłonka rogówki Fucha (FECD) jest chorobą charakteryzującą się utratą funkcji pompy w komórkach śródbłonka rogówki oraz nadmiernym gromadzeniem się kolagenu i innych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na powierzchni błony Descemeta, tworząc guttae rogówki. Jedynym znanym sposobem leczenia FECD jest keratoplastyka śródbłonka w różnych formach, z których wszystkie wiążą się z ryzykiem odrzucenia i utraty komórek śródbłonka.

Podczas gdy postępy w chirurgii okulistycznej umożliwiły tym procedurom stały się z czasem mniej inwazyjne, każda forma przeszczepu wiąże się z ryzykiem odrzucenia i możliwością dożywotniego stosowania sterydów. Descemet's Stripping Only (DSO) jest eksperymentalną alternatywą, w której pacjenci z FECD z guttae zlokalizowanymi w środku rogówki mają usunięty centralny czteromilimetrowy okrąg błony Descemeta bez wymiany przeszczepu. Usunięcie guttae zachęca zdrowe komórki obwodowe do migracji do wewnątrz i zreformowania monowarstwy śródbłonka, ostatecznie odwracając obrzęk zrębu i poprawiając widzenie.

Chociaż metoda ta ma wiele zalet, proces gojenia jest długi i niespójny, a niektórzy pacjenci wymagają przeszczepu ratunkowego, jeśli nie widać gojenia w ciągu miesiąca po operacji. Leczenie, które stymuluje szybsze gojenie się ran po DSO, może sprawić, że procedura stanie się bardziej wykonalną opcją dla pacjentów z FECD. Protokół ten modeluje kliniczną procedurę DSO w formacie hodowli narządów przy użyciu ludzkich rogówek dawcy, w celu przetestowania metod leczenia w celu poprawy gojenia się ran po DSO, aby DSO stało się bardziej wykonalną opcją dla pacjentów z FECD.

Nasze laboratorium wykorzystuje ten model do testowania gojenia się ran w rogówkach leczonych zmodyfikowanym czynnikiem wzrostu fibroblastów, dla których pokażemy reprezentatywne wyniki w dalszej części tego filmu. W tej części procedury zostanie użyty stempel biopsyjny w celu oznaczenia czteromilimetrowego obszaru rany, z którego zostanie usunięta błona Descemeta. Za pomocą sterylnych kleszczyków usuń rogówkę z podłoża i spłucz w 1X PBS, aby usunąć resztki pożywki i resztki komórek.

Po spłukaniu umieść śródbłonek rogówki do góry na pokrywie szalki Petriego. Zanurz nowy czteromilimetrowy stempel do biopsji w błękitnym trypanu w naczyniu spawalniczym i strzepnij nadmiar. Obiema rękami umieść stempel powyżej środka rogówki i opuść go prosto w dół na powierzchnię śródbłonka, wywierając minimalny nacisk.

Nie zmieniając pozycji ani nacisku na rogówkę, przenieś stempel do jednej ręki i sięgnij po kleszcze nowo wolną ręką. Użyj kleszczy, aby przytrzymać rogówkę na miejscu, jednocześnie delikatnie przekręcając kilkakrotnie stempel biopsyjny o około 90 stopni w przód iw tył. Podnieś stempel do biopsji prosto do góry z rogówki i odłóż na bok.

Spłucz jeszcze raz w 1X PBS, aby usunąć nadmiar błękitu trypanowego. Przenieść rogówkę z pokrywki szalki Petriego do lunety preparucyjnej. Trzymając rogówkę na miejscu za pomocą zakrzywionych kleszczy, naciąć błonę Descemeta, lekko przeciągając końcówkę ostrej igły o rozmiarze 30 wzdłuż pierścienia błękitu trypanowego pozostawionego przez stempel biopsyjny.

Użyj minimalnego nacisku, aby uniknąć przerwania leżącego poniżej zrębu. Za pomocą haczyka sinskey wykonuj delikatne ruchy nabierające, aby podnieść i odkleić błonę Descemeta wokół krawędzi rany. Praca w kierunku środka zmiany.

Membrana Descemeta powinna stawiać bardzo mały opór. Jeśli masz trudności, prawdopodobnie podciągasz zręb. Jeśli tak się stanie, zacznij od nowa, podnosząc od nowego punktu wzdłuż krawędzi rany.

Gdy większość błony Descemeta zostanie oddzielona od zrębu, użyj kleszczy Gorovoy, aby usunąć błonę i odłożyć na bok. Zbadaj usunięty obszar pod kątem pozostałych kawałków błony i usuń za pomocą kleszczy Gorovoy. Po usunięciu Descemeta zabarwić rogówkę błękitem trypanowym, aby uwidocznić obszar rany.

Przepłucz rogówkę w 1X PBS zawierającym 0,01% chlorku wapnia i chlorku magnezu, aby usunąć resztki komórek, które mogłyby wchodzić w interakcje z błękitem trypanowym i ułatwić ścisłe przyleganie pozostałych CEC do nienaruszonej błony Descemeta. Umieść rogówkę w spawanym naczyniu i odpipetuj 30 mikrolitrów błękitu trypanowego na warstwę śródbłonka przez 30 sekund. Użyj kleszczy, aby delikatnie kołysać rogówkę, aby upewnić się, że cała powierzchnia śródbłonka jest pokryta.

Spłucz nadmiar błękitu trypanowego w PDS wapniem i magnezem i zobrazuj zabarwioną rogówkę pod mikroskopem preparacyjnym dla punktu czasowego dnia zero. Po zakończeniu tej procedury należy umieścić rogówki w sześciodołkowej płytce zawierającej pożywkę o niskiej surowicy, składającą się z następujących wymienionych składników. Posaz lewą rogówkę w ośmiu młynach z samą pożywką o niskiej surowicy, a prawą rogówkę w pożywce o niskiej surowicy, uzupełnioną zmodyfikowanym FGF-1 lub innymi pożądanymi zabiegami testowymi.

Inkubuj rogówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 6% CO2 przez 14 dni z codzienną wymianą pożywki. Powtórz procedurę barwienia trypanem w trzecim, szóstym, dziewiątym, dwunastym i czternastym dniu i zobrazuj każdą rogówkę natychmiast po barwieniu. Upewnij się, że ustawienia aparatu są spójne we wszystkich punktach czasowych.

Po okresie hodowli można wykonać dodatkowe barwienia na rogówkach w oparciu o zainteresowania badawcze, specyficzne dla eksperymentu. Dodatkowe barwienia związane z zainteresowaniami badawczymi naszego laboratorium obejmują barwienie alizaryną, a także barwienie fluorescencyjne w celu włączenia EDU i białek ścisłego połączenia ZO-1. Barwienie alizaryną wykonuje się w celu wizualizacji granic komórek w celu potwierdzenia wyników barwienia trypanem i wizualizacji morfologii komórek w wyleczonym obszarze.

Barwienie immunofluorescencyjne ZO-1 pozwala na wizualizację tworzenia się ścisłego połączenia między CEC, co jest szczególnie interesujące w gojonym obszarze i wokół niego. Znakowanie EdU jest wykonywane jako miara jakościowa w celu potwierdzenia, że proliferacja przyczynia się do gojenia i może być również wykorzystana do ilościowego określenia proliferujących komórek w niektórych kontekstach. Bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące wykonywania tych konkretnych procedur barwienia znajdują się w artykule odpowiadającym temu filmowi.

Oto reprezentatywne obrazy pary rogówek uznanych za dystroficzne przez Eye-Bank, które były inkubowane z lub bez zmodyfikowanego FGF-1 przez okres 14 dni. Jak widać na zdjęciach, zmodyfikowana rogówka poddana działaniu FGF-1 wykazała przyspieszone gojenie w porównaniu z nieleczoną rogówką kontrolną. Dodatkowe barwienie alizaryną pod koniec okresu hodowli posłużyło do wyznaczenia granic komórek i potwierdziło te wyniki.

Obserwacja ta została powtórzona na 11 parach dystroficznych rogówek, aby zweryfikować model w próbce rogówki najbardziej istotnej dla klinicznej procedury DSO. Oprogramowanie do przetwarzania obrazów, takie jak ImageJ, może być używane do pomiaru zabarwionego obszaru na tych obrazach w celu ilościowego określenia postępu gojenia się ran, jak można zobaczyć tutaj. Wszystkie dystroficzne rogówki leczone zmodyfikowanym FGF-1 wykazały większe gojenie w 14 dniu, w porównaniu z nieleczonym partnerem, co spowodowało średnio 91% uzdrowienia w przeciwieństwie do 38% w kontrolnych rogówkach.

I ta różnica była istotna statystycznie. Dodatkowa immunohistochemia uwidoczniona za pomocą obrazowania konfokalnego ujawniła częściowo zorganizowaną ekspresję białka ścisłego połączenia ZO-1, odzwierciedlającą wcześniejsze wzorce barwienia alizaryny. Znakowanie EDU potwierdziło obecność proliferujących komórek w obszarze rany i wokół niej i było widoczne w wyższych poziomach w leczonych rogówkach w porównaniu z nieleczonymi kontrolami.

W niektórych parach rogówki śmierć CEC może być widoczna na obrzeżach obszaru rany, szczególnie w dystroficznych rogówkach. Oto przykładowe zdjęcia rogówek barwionych trypanem, które wykazują znaczną śmierć komórek obwodowych. Jak widać na obrazach, śmierć komórek obwodowych następuje głównie we wcześniejszych punktach czasowych i stopniowo odwraca się w okresie hodowli.

To obwodowe zabarwienie może komplikować ilościowe określenie obszaru rany, gdy łączy się on z raną, ponieważ ustalenie położenia krawędzi obszaru rany może być trudne. Jednak we wszystkich przypadkach barwienie trypanem obwodowym oczyściło się na tyle, aby uzyskać mierzalne obrazy w ostatnim punkcie czasowym 14 dnia. Uważamy, że zjawisko to jest unikalne dla rogówek dawców hodowanych ex vivo i nie ma znaczenia dla ludzkich rogówek in vivo.

Ponieważ o naszej wiedzy uszkodzenie śródbłonka obwodowego nie zostało zgłoszone w żadnym klinicznym badaniu przypadku DSO. Drugi wzór barwienia, określany jako barwienie dalece peryferyjne, został uchwycony na obrazach czerwieni Alizarin, ale był również widoczny na obrazach błękitu trypanowego przez cały okres hodowli. Obserwacja ta charakteryzuje się pierścieniem ciemnych zabarwień wokół rąbka, co wskazuje na uszkodzony śródbłonek.

Pomimo tego terminu, ten wzór był tak powszechny zarówno w normalnych, jak i dystroficznych rogówkach, że nie były one liczone jako dodatnie dla barwienia obwodowego. Protokół ten pozwolił nam wykazać lepsze wyniki gojenia w hodowanych rogówkach traktowanych zmodyfikowanym FGF-1 po usunięciu Descemeta. Ponadto ten protokół usuwania służy jako cenna metoda dla innych badaczy badających DSO i może być wykorzystany do szerokiej gamy zastosowań, w tym do testowania innych terapii gojenia ran, oceny modyfikacji techniki chirurgicznej i porównywania gojenia w różnych populacjach dawców lub stadiach choroby.

Mamy nadzieję, że to badanie i inne badania wykorzystujące ten protokół zachęcą klinicystów do rozważenia DSO jako wartościowej opcji leczenia dla kwalifikujących się pacjentów z FECD w przyszłości.