Name: Pierwotne kultury astrocytów szczurów i mikrogleju oraz ich zastosowanie w badaniu stwardnienia zanikowego bocznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę hodowli pierwotnych astrocytów i mikrogleju szczura do badania sygnalizacji wapniowej w kontekście stwardnienia zanikowego bocznego. Protokół umożliwia szczegółową analizę zachowania komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Rozwoju Technologicznego Republiki Serbii Kontrakt nr 451-03-9/2021-14/ 200178, projekt FENS - NENS Education and Training Cluster "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" oraz grant EC H2020 MSCA RISE #778405. Dziękujemy Mariji Adžić i Minie Perić za dostarczenie obrazów immunohistochemicznych oraz Danijeli Bataveljić za pomoc w pisaniu artykułów na papierze.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywami UE dotyczącymi ochrony zwierząt do celów naukowych i za zgodą Komisji Etycznej Wydziału Biologii Uniwersytetu w Belgradzie (numer zatwierdzenia EK-BF-2016/08). Jeśli chodzi o materiał pacjenta (surowice dla IgG), został on pobrany do rutynowego badania klinicznego za świadomą zgodą pacjenta zgodnie z Kodeksem Etycznym Światowego Stowarzyszenia Lekarzy (Deklaracja Helsińska) dla eksperymentów z udziałem ludzi. Protokół został zatwierdzony przez komisję bioetyczną Centrum Klinicznego Serbii (nr 850/6).
1. Przygotowanie pierwotnej hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Izolacja tkanki mózgowej 
	UWAGA: Izolację należy wykonać na lodzie, używając lodowatych roztworów.
	<ol>
		<li>Użyj nowonarodzonych szczeniąt w wieku 1-3 dni do podstawowej hodowli komórek noworodków33. 
		UWAGA: W przedstawionym tutaj badaniu wykorzystano Sprague Dawley hSOD1G93A i nietransgeniczne szczury. Do genotypowania wykorzystano ogony szczurów do późniejszej ekstrakcji DNA i PCR.</li>
		<li>Posyp głowę szczeniaka 70% etanolem i natychmiast szybko odetnij jej głowę za pomocą nożyczek.</li>
		<li>Rozetnij skórę za pomocą nożyczek o małym kącie, aby odsłonić czaszkę. Otwórz czaszkę, wykonując cięcie od otworu wielkiego w kierunku oczodołów. Następnie wykonaj prostopadłe cięcie linii środkowej. Usunąć mózg z czaszki i umieścić go na szalce Petriego zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). 
		UWAGA: Wyczyść narzędzia między szczeniętami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między szczeniętami transgenicznymi i nietransgenicznymi. Izolacja kory mózgowej od reszty mózgu powinna być wykonana pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
		<li>Za pomocą końcówki kleszczy rozerwij połączenia między obiema półkulami. Następnie oddziel półkule zakrzywionymi kleszczami, delikatnie popychając półkulę od środka na bok.</li>
		<li>Usuń opony, ostrożnie rozrywając je prostymi i zakrzywionymi kleszczami.</li>
		<li>Usuń hipokamp, ściskając go zakrzywionymi kleszczami. Wyrzuć hipokamp lub użyj go do innego przygotowania hodowli komórkowych. 
		UWAGA: Dalsze kroki należy wykonywać pod okapem z przepływem laminarnym, aby zapewnić sterylne warunki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizacja i dysocjacja tkanek
	<ol>
		<li>Przenieś jedną korę do 15 ml probówki wypełnionej 3 ml zimnego PBS. Pipetować zawiesinę w górę i w dół za pomocą końcówki o pojemności 1 ml, wykonując 10-15 ruchów, aż zawiesina stanie się jednorodna. 
		UWAGA: Bądź bardzo ostrożny, aby nie wytwarzać pęcherzyków w tym procesie.</li>
		<li>Wirować przy 500 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml zimnego PBS, pipetując go w górę i w dół za pomocą końcówki o pojemności 1 ml. Powtórz krok wirowania. 
		UWAGA: Wszystkie roztwory stosowane od tego momentu należy wstępnie podgrzać do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml kompletnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykami (penicyliną i streptomycyną). Przenieść homogenat do probówki o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Przepuścić homogenat przez igły 21 G i 23 G (po trzy razy każda) w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. 
		UWAGA: Bądź bardzo ostrożny, aby nie wytwarzać pęcherzyków w tym procesie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlać zawiesinę komórkową przygotowaną z jednej kory do płytki Petriego o średnicy 60 mm lub kolby T25 (z powierzchnią wstępnie pokrytą powłoką polipeptydową do wzrostu przylegających komórek) zawierającej 3 ml kompletnego DMEM. Lekko wstrząsnąć szalką Petriego, aby zawiesina została równomiernie rozprowadzona.</li>
	<li>Hodować komórki w inkubatorze w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 / 95% powietrza o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zmienić pożywkę 48 godzin po izolacji i wymieniać pożywkę co 3 dni.</li>
	<li>Aby pobudzić wzrost astrocytów, gdy komórki osiągną zbieżność 70%-80%, umyj je wstępnie podgrzanym PBS, aby usunąć luźno przyczepione komórki glejowe i ślady FBS w pożywce.
	<ol>
		<li>Trypsynizuj leżącą poniżej warstwę astrocytów, dodając 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu trypsyny (0,25% trypsyny, 0,02% EDTA w PBS, sterylnie filtrowane).</li>
		<li>Umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 2-5 minut.</li>
		<li>Sprawdź komórki pod mikroskopem. Kiedy zaczną się odłączać, dodaj 4 ml kompletnego DMEM.</li>
		<li>Zebrać zawiesinę komórek i przenieść ją do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 500 × g przez 5 min.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnego podłoża. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Ponownie pokryć komórki w gęstości 10,4 komórek/cm, 2 w 5 ml świeżego, kompletnego DMEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 3 dni. Aby zminimalizować obecność innych typów komórek glejowych, po osiągnięciu przez astrocyty 50% konfluencji i przed każdą wymianą pożywki, umyj komórki kompletnym DMEM.
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę sklarowaną nad osadem za pomocą pipety o pojemności 1 ml i kilkakrotnie delikatnie nanieść na warstwę komórek. Upewnij się, że cała powierzchnia warstwy komórek jest pokryta podczas tego etapu mycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80% konfluencji (zwykle po 14 dniach), powtórz trypsynizację i pobieranie astrocytów, jak opisano w kroku 1.6.</li>
	<li>Nasiona 5 × 103 astrocytów na okrągłym szkiełku nakrywkowym o średnicy 7 mm pokrytym poli-L-lizyną (50 μg/ml). Używaj ich w eksperymentach po 48 godzinach.</li>
	<li>Aby promować mikroglej, po kroku 1.7 pozwól komórkom glejowym dotrzeć do warstwy zlewającej się34. Kiedy komórki mikrogleju pojawią się na wierzchu warstwy astrocytów (po 10-15 dniach, rozpoznawane po mniejszych, bardziej owalnych ciałach i krótszych procesach), potrząsaj szalką Petriego na wytrząsarce orbitalnej przez 2 godziny z prędkością 220 obr./min.</li>
	<li>Dyspergowanie i wysiewanie komórek mikrogleju
	<ol>
		<li>Oderwane i luźno połączone komórki należy delikatnie umyć, zasysając pożywkę sklarowaną nad osadem końcówką pipety o pojemności 1 ml i delikatnie nanieść ją kilkakrotnie na warstwę komórek. Upewnij się, że podczas tego etapu płukania pokryłeś całą powierzchnię warstwy komórek, zbierz pożywkę z oderwanymi komórkami i przenieś ją do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Wirować przy 500 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki.</li>
		<li>Przepuścić zawiesinę komórek przez igłę 21 G, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. 
		UWAGA: Większość opublikowanych metod wykorzystuje trypsynę lub papainę do dysocjacji tkanki; jednak igły 21 G mają tę zaletę, że zapobiegają nadmiernemu trawieniu komórek, co pozwala na łagodniejszą dysocjację.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Wysiew 5 × 103 komórek mikrogleju na okrągłym szkiełku nakrywkowym o średnicy 7 mm pokrytym poli-L-lizyną (50 μg/ml). Używaj ich w eksperymentach po 48 godz. 
		UWAGA: Trudno jest uzyskać czystą hodowlę mikrogleju przez wstrząsanie, ponieważ komórki prekursorowe oligodendrocytów i astrocyty mogą być nadal obecne w zmiennej liczbie, w zależności od doświadczenia eksperymentatora. Protokół immunocytochemiczny używany do szacowania obecności różnych populacji komórek w hodowlach glejowych został opisany w innym miejscu35.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Immunocytochemia
<ol>
	<li>Opłucz komórki posiane na szkiełkach nakrywkowych w PBS, 2 x 1 min.</li>
	<li>Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Prać w PBS 3 x 5 min.</li>
	<li>Inkubować w roztworze blokującym zawierającym 10% normalnej surowicy osła (NDS)/1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/0,1% Triton X-100 przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl roztworu blokującego na szkiełko nakrywkowe o średnicy 10 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 w następujących rozcieńczeniach: mysie anty-GFAP 1:300, kozie anty-Iba1 1:500. Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w temperaturze +4 °C.</li>
	<li>Płukać w PBS, 3 x 10 min.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem: anty-mysim osłem (wzbudzenie 488 nm [1:200)) lub anty-kozłem osła (wzbudzonym przy 647 nm [1:200)). Inkubować komórki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Prać w PBS, 7 x 5 min.</li>
	<li>Inkubować komórki z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, 1:4,000) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Prać w PBS 5 x 5 min.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą roztworu montażowego; użyj jednej kropli na szkiełko nakrywkowe. 
	UWAGA: Rozcieńczenia przeciwciał mogą się różnić w zależności od producenta. Użytkownicy muszą określić optymalne rozcieńczenia dla swoich eksperymentów.</li>
</ol>
3. Obrazowanie filmów poklatkowych
UWAGA: Roztwory zawierające barwnik fluorescencyjny powinny być chronione przed bezpośrednim światłem. Przed rozpoczęciem eksperymentu z obrazowaniem upewnij się, że szklane szkiełko nakrywkowe nie porusza się podczas włączania perfuzji.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów i komórek
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór zewnątrzkomórkowy (ECS) do obrazowania: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glukozy i 10 mM HEPES. Dostosować pH do 7,4. Upewnij się, że osmolarność wynosi 280-300 mOsm/kg i przygotuj ECS bez Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glukozy, 10 mM HEPES i 0,1 mM EGTA.</li>
		<li>Przygotować roztwory testowe: 100 μM ATP rozpuszczone w ECS, 1 μM Thg w ECS bez Ca2+ i 0,1 mg/ml ALS IgG w ECS8.</li>
		<li>Przenieś jedno szkiełko nakrywkowe do naczynia z ECS, aby wypłukać cały DMEM. Przygotować roztwór do ładowania barwnikiem, rozcieńczając 1 mM roztwór podstawowy Fluo-4 AM z ECS do końcowego stężenia 5 μM Fluo-4 AM.
		<ol>
			<li>Umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami w roztworze nasycającym barwnik na 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Myj komórki w ECS przez 20 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Jeśli ogniwa nie są odpowiednio obciążone (tj. jeśli podstawowy poziom fluorescencji jest zbyt niski <5% zakresu dynamicznego kamery przy czasie naświetlania większym niż 400 ms), należy wydłużyć czas ładowania do 45 min do 1 h w temperaturze 37 °C. Alternatywnie, należy zmieszać roztwór podstawowy Fluo-4 AM z równą objętością 20% (w/v) detergentu (Pluronic) w DMSO przed rozcieńczeniem w ECS, co daje końcowe stężenie Pluronic ~0,02%. 
		UWAGA: Eksperymentalne przykłady tego badania przeprowadzono z ludzkimi IgG wyizolowanymi z surowic krwi pacjentów z ALS, jak opisano wcześniej4,5,11. Każdy eksperyment przeprowadzono na próbkach IgG od jednego pacjenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie wideo 
	UWAGA: W tym protokole system obrazowania wideo został połączony z ksenonową lampą o krótkim łuku, systemem polichromatora i odwróconym mikroskopem epifluorescencyjnym wyposażonym w obiektyw zanurzeniowy w wodzie, glicerynie i oleju. Obrazowanie poklatkowe wykonano przy użyciu systemu aparatów cyfrowych.
	<ol>
		<li>Włącz elementy zestawu do obrazowania na 15 minut przed eksperymentem, aby system osiągnął temperaturę roboczą.</li>
		<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe w komorze rejestracyjnej z 1 ml roztworu roboczego (ECS lub ECS bez Ca2+).</li>
		<li>Aby wybrać właściwy protokół obrazowania, otwórz oprogramowanie do obrazowania i w panelu Akwizycja wybierz pary filtrów dla Fluo4-AM o długości fali wzbudzenia przy 480 nm, zwierciadle dichroicznym przy 505 nm i długości fali emisji przy 535 nm.</li>
		<li>Wybierz pole widzenia, zwracając uwagę na stałą liczbę komórek w całym eksperymencie. Dostosuj odpowiednio czas ekspozycji i wzmocnienie detektora, w taki sposób, aby sygnał nie był nasycony. Wybierz tryb pseudokoloru do akwizycji. Aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje, zapoznaj się z instrukcją dostarczoną przez producenta.</li>
		<li>Dostosuj częstotliwość próbkowania do 1 Hz (1 klatka na sekundę).</li>
		<li>Obrazowanie należy rozpocząć od uzyskania podstawowego poziomu fluorescencji przez 3-5 minut w celu wyznaczenia linii podstawowej (F0). Zapewnić stały przepływ roztworu roboczego.</li>
		<li>Zatrzymaj przepływ roztworu roboczego i przełącz się na roztwór testowy na żądany czas (zobacz również słupki czasu w przykładach <silna klasa="xfig">Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3). Pomiędzy każdym roztworem badanym przemywać komórki stałym przepływem roztworu roboczego przez 3-5 minut.</li>
		<li>Utrzymuj objętość roztworu w komorze zapisu na poziomie ~1 ml, organizując stałe ssanie od góry roztworu (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2E). 
		UWAGA: Aby zastosować leczenie bezpośrednio do obrazowanych komórek, niestandardowy system dostarczania wykonany ze szklanej pipety (średnica wewnętrzna 0,8 mm) został umieszczony w odległości ~350 μm i ~1 mm nad komórkami, pod kątem 45° w połączeniu z systemem wymiany roztworu zawierającym zawory zaciskowe i elektroniczny sterownik zaworu (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 2E).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) odpowiadający pojedynczej komórce.
	<ol>
		<li>Wybierz klatkę o największym natężeniu sygnału (tj. z aplikacji ATP) i okrąż jedną komórkę za pomocą aplikacji Polygonal Tool. Powtórz te czynności dla wszystkich komórek w pobranym polu. Wybierz pięć ROI w tle za pomocą narzędzia Okrąg.</li>
		<li>Aby zmierzyć średnią intensywność sygnału pojedynczej komórki i tła dla każdej klatki czasowej, wybierz wszystkie ROI i użyj polecenia Multi Measure w Menedżerze ROI w ImageJ lub dowolnego równoważnego polecenia w oprogramowaniu komercyjnym (patrz Spis materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyeksportuj średnie wartości intensywności sygnału ROI jako arkusz kalkulacyjny.</li>
	<li>Uśrednij pięć ROI tła i odejmij uśrednione tło każdej klatki od średniej intensywności ROI klatki uzyskanej w tym samym czasie.</li>
	<li>Aby znormalizować uzyskane dane do sygnału bazowego, należy użyć równania (1): 
	ΔF/F0 = (F - F0)/F0 (1) 
	gdzie F jest intensywnością sygnału w każdej ramce czasowej po odjęciu tła, a F0 jest podstawową fluorescencją Fluo-4. 
	UWAGA: W tym badaniu użyto niestandardowego kodu.</li>
	<li>Aby przeanalizować aktywność wapnia, należy określić kilka parametrów4: amplituda piku wapnia (ΔF/F0), zintegrowana zmiana (całka czasowa, powierzchnia pod zapisem odpowiedzi) stanu przejściowego wapnia (ΔF/F0 × s), czas do osiągnięcia szczytu, który upłynął od początku stymulacji do maksimum stanu przejściowego wapnia (s), czas narastania-czas, jaki upłynął od początku stymulacji do wartości ΔF/F0, która osiąga 50%-80% maksymalnej amplitudy (s), połowa szerokości-pełna szerokość stanu nieustalonego przy połowie maksymalnej amplitudy (s), częstotliwość odpowiedzi, jeśli są powtarzalne (Hz).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W artykule przedstawiono metodę pierwotnej hodowli komórek jako szybkie i "budżetowe" narzędzie do badania różnych aspektów (pato)fizjologii komórki, takich jak ALS w szczurzym modelu hSOD1G93A . Technika ta nadaje się zatem do badań na poziomie pojedynczych komórek, które można ekstrapolować i dalej badać na wyższym poziomie organizacji (tj. w wycinkach tkanek lub na żywym zwierzęciu). Hodowla komórkowa jako technika ma jednak kilka zastrzeżeń. Niezwykle ważne jest wykonanie izolacji tkanki mózgowej i dysocja...

Techniki hodowli komórkowych dały początek licznym postępom w różnych dziedzinach neurofizjologii komórkowej w zdrowiu i chorobie. W szczególności pierwotne hodowle komórkowe, świeżo wyizolowane z tkanki neuronalnej zwierzęcia laboratoryjnego, pozwalają eksperymentatorowi dokładnie badać zachowanie różnych komórek w różnych pożywkach biochemicznych i konfiguracjach fizjologicznych. Wykorzystanie różnych fluorescencyjnych wskaźników fizjologicznych, takich jak barwniki wrażliwe na Ca2+, w połączeniu z poklatkową mikroskopią wideo zapewnia lepszy wgląd w komórkowe procesy biofizyczne i biochemiczne w czasie rzeczywistym.
ALS jest wyniszczającą chorobą neurodegeneracyjną, która atakuje górne i dolne neurony ruchowe1. Choroba ma złożoną patogenezę typu rodzinnego, ale głównie w postaci sporadycznej (90% przypadków)2. Powszechnie wiadomo, że autonomiczne mechanizmy niekomórkowe przyczyniają się do patofizjologii ALS, przede wszystkim ze względu na istotną rolę komórek glejowych3. ALS jest również dobrze scharakteryzowany jako choroba neurozapalna z udziałem humoralnych i komórkowych czynników zapalenia.
Immunoglobulina G jest szeroko stosowana jako marker molekularny w ALS i innych chorobach neurodegeneracyjnych. Badanie poziomu tego markera w surowicy może wskazywać na obecność i stadium zapalenia układu nerwowego w chorobie4,5,6, podczas gdy jego obecność w płynie mózgowo-rdzeniowym może wskazywać na naruszenie bariery krew-mózg7. IgG zidentyfikowano również jako złogi w neuronach ruchowych rdzenia kręgowego u pacjentów z ALS7. Niemniej jednak podejście to wykazało pewne niespójności w korelacji poziomu IgG ze stopniem zaawansowania i charakterystyką choroby6.
IgG wyizolowane z surowicy pacjentów z ALS (ALS IgG) może wywołać odpowiedź wapniową u naiwnych astrocytów8 i uwalnianie glutaminianu w neuronach, wskazując na efekt ekscytotoksyczny - cechę charakterystyczną patologii ALS9. Jednak badania na szczurzym modelu ALS hSOD1G93A (zawierającym wiele kopii ludzkiej mutacji SOD110) wykazały szereg markerów stresu oksydacyjnego w hodowanych komórkach neurogleju11, tissues12,13,14, lub żywe zwierzęta13. Warto zauważyć, że astrocyty wyhodowane z modelu szczura ALS były bardziej podatne na stres oksydacyjny wywołany nadtlenkiem niż astroglej z nietransgenicznych rodzeństwa z miotu11.
Komórki mikrogleju w hodowli są dotknięte ALS IgG w mniej widoczny sposób. Mianowicie, linia komórek mikrogleju BV-2 wykazała wzrost sygnału z fluorescencyjnych markerów stresu oksydacyjnego w odpowiedzi na zastosowanie tylko próbek pacjentów z 4/11 ALS IgG15. Powszechnie wiadomo, że mikroglej uczestniczy w wielu patologiach neurozapalnych, przyczyniając się do stresu oksydacyjnego i późnej fazy progresji w niekomórkowym autonomicznym mechanizmie ALS16,17. Niemniej jednak dane z ALS IgG wskazują, że komórki te mogą nie być tak reaktywne jak astrocyty na te humoralne czynniki zapalenia ALS. Przeprowadzono kilka badań na pierwotnych astrocytach z mysich modeli ALS, nie tylko u młodych, ale także u zwierząt z objawami, zarówno na mózgu, jak i na rdzeniu kręgowym18,19,20,21. Dotyczy to również pierwotnych kultur mikrogleju, choć w mniejszym stopniu niż astrocytów i głównie z regionów mózgu w stadium embrionalnym22,23,24.
Używamy obrazowania poklatkowego Ca2+ na komórkach w hodowli głównie jako sposobu na śledzenie wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych tego jonu jako fizjologicznego markera ekscytotoksyczności. Tak więc, poprzez biofizyczną charakterystykę tych stanów nieustalonych (amplituda, obszar pod stanem przejściowym, czas narastania, częstotliwość) badacz może uzyskać eksperymentalne parametry diagnostyczne z różnych komórkowych modeli neurodegeneracji. Technika ta oferuje zatem przewagę w postaci ilościowej oceny fizjologicznej IgG jako biomarkerów choroby. Istnieje obszerna literatura na temat roli IgG i Ca2+ w indukcji ALS. Większość z tych badań przeprowadzono poprzez indukcję ALS poprzez wstrzyknięcie pacjentom IgG do zwierząt doświadczalnych25,26,27,28,29, które następnie wykazały wewnątrzkomórkowe podwyższenie Ca2+ i depozycje IgG. W ramach szeregu badań badano wpływ ALS IgG na synapsę ruchową in vitro30,31,32. W powyższym kontekście, przedstawiona tutaj technika skupia się na komórkach glejowych jako ważnych graczach w niekomórkowym autonomicznym mechanizmie ALS i określa ilościowo ich potencjalną odpowiedź ekscytotoksyczną na IgG jako humoralne czynniki zapalenia nerwów. Podejście to może mieć szersze zastosowanie w testowaniu innych czynników humoralnych, takich jak całe surowice, płyn mózgowo-rdzeniowy lub cytokiny w różnych systemach hodowli komórkowych oraz w komórkowych modelach ogólnego stanu zapalnego.
Ten artykuł opisuje, jak przygotować pierwotne kultury komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej szczurów Sprague Dawley i jak dalej wykorzystywać te komórki do badania patofizjologii ALS za pomocą IgG pochodzącej z surowic pacjenta. Szczegółowe są protokoły dotyczące obciążania barwnikiem hodowanych komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1) oraz zapisów zmian Ca2+ w eksperymentach z obrazowaniem poklatkowym. Przykłady nagrań wideo pokażą, jak komórki glejowe reagują na ALS IgG w porównaniu z ATP, które aktywuje receptory błony purynergicznej. Po raz pierwszy pokazano przykład, w jaki sposób astrocyty wyizolowane z mózgu szczura ALS hSOD1G93A reagują z bardziej wyraźną odpowiedzią Ca2 + na IgG ALS w porównaniu z kontrolami nietransgenicznymi i jak powiązać ten proces z różnicami w działaniu magazynu Ca2 +. Pokazano również przykład obrazowania wapnia w komórkach mikrogleju z ostrym wyzwaniem ALS IgG, z jedynie umiarkowaną odpowiedzią wewnątrzkomórkowego wapnia.

<table><tbody><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>Sarstedt, Niemcy</td><td>62 554 502</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 2 ml</td><td>Sarstedt, Niemcy</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>Igła 21 G</td><td>Nipro, Japonia</td><td>HN-2138-ET</td><td></td></tr><tr><td>Igła 23 G</td><td>Nipro, Japonia</td><td>HN-2338-ET</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>Nipro, Japonia</td><td>SY3-5SC-EC</td><td></td></tr><tr><td>6 mm okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>Menzel Glasser, Niemcy</td><td>630-2113</td><td></td></tr><tr><td>60 mm szalka Petriego</td><td>ThermoFisher Sientific, Stany Zjednoczone</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver A1</td><td>Carl Zeiss, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>2110</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Osioł-anty koza AlexaFluor 647 Przeciwciało IgG</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A-21447</td><td></td></tr><tr><td>Osioł-anty mysz AlexaFluor 488 Przeciwciało IgG</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>" evolve"-EM 512 System aparatów cyfrowych</td><td>Fotometria, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi ImageJ Software</td><td>Open source na licencji GNU General Public License</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów FITC</td><td>Chroma Technology Inc., Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>Fluo-4 AM</td>, USA <td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-Iba1</td><td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td><td>011-27991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biowest, Francja</td><td>P5455</td><td></td></tr><tr><td>System szybkiej wymiany roztworów</td><td>ALA Scientific Instruments, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Matlab</td><td>Math Works, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-GFAP</td><td>Merck Millipore, USA</td><td>MAB360</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>324590</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin i Streptomycyna</td><td>ThermoFisher Sientific, Stany Zjednoczone</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Odczynniki Carlo Erba, Hiszpania</td><td></td> Wytrząsarka 471686 <td></td></tr><tr><td>DELFIA PlateShake</td><td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny</td><td>Carl ROTH GmbH</td><td>X987.2</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargine</td><td>Tocris Bioscience, Wielka Brytania</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Oscylometr ciśnienia par Vapro 5520</td><td>Wescor, ELITechGroup Inc., Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania ViiFluor</td><td>Visitron System Gmbh, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System polichromatora VisiChrome</td><td>Visitron System Gmbh, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfiguracja o wysokiej wydajności VisiView</td><td>Visitron System Gmbh, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksenonowa lampa łukowa</td><td>Ushio, Japonia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pierwotne kultury astrocytów szczurów i mikrogleju oraz ich zastosowanie w badaniu stwardnienia zanikowego bocznego

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Ten protokół pokazuje, jak przygotować pierwotne hodowle komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej szczurów Sprague Dawley oraz jak wykorzystać te komórki do badania patofizjologii stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) w szczurzym modelu hSOD1G93A. Po pierwsze, protokół pokazuje, jak izolować i hodować astrocyty i mikroglej z pourodzeniowej kory szczura, a następnie, jak scharakteryzować i przetestować te kultury pod kątem czystości za pomocą immunocytochemii przy użyciu markera kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) astrocytów i zjonizowanej cząsteczki adaptora wiążącego wapń 1 (Iba1) markera mikrogleju. W kolejnym etapie opisano metody obciążania barwnikiem (wrażliwy na wapń Fluo 4-AM) hodowanych komórek oraz zapisy zmian Ca2+ w eksperymentach obrazowania wideo na żywych komórkach.
Przykłady nagrań wideo obejmują: (1) przypadki obrazowania Ca2+ hodowanych astrocytów ostro narażonych na immunoglobulinę G (IgG) wyizolowanych od pacjentów z ALS, wykazujących charakterystyczną i specyficzną odpowiedź w porównaniu z odpowiedzią na ATP, jak wykazano w tym samym eksperymencie. Przykłady pokazują również bardziej wyraźny przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia wywołany przez ALS IgG w astrocytach hSOD1G93A w porównaniu z nietransgenicznymi kontrolami; (2) Obrazowanie Ca2 + hodowanych astrocytów podczas wyczerpywania się zapasów wapnia przez thapsygarginę (Thg), niekonkurencyjny inhibitor ATPazy Ca2 + retikulum endoplazmatycznego, a następnie wejście wapnia w magazynie wywołane przez dodanie wapnia do roztworu rejestrującego, co pokazuje różnicę między działaniem magazynu Ca2 + w hSOD1G93A i w astrocytach nietransgenicznych; (3) Obrazowanie Ca2 + hodowanego mikrogleju wykazujące głównie brak odpowiedzi na ALS IgG, podczas gdy zastosowanie ATP wywołało zmianę Ca2 +. W artykule podkreślono również możliwe zastrzeżenia i przestrogi dotyczące krytycznej gęstości komórek i czystości kultur, wyboru odpowiedniego stężenia barwnika Ca2+ i technik ładowania barwnikiem.

Charakterystyka różnych typów komórek glejowych w hodowli 
Przygotowanie astrocytów do eksperymentów zajmuje zazwyczaj od 15 do 21 dni, natomiast hodowla komórek mikrogleju trwa od 10 do 15 dni. W celu oceny czystości hodowli komórkowych przeprowadzono barwienie immunocytochemiczne. Rysunek 1 przedstawia ekspresję podwójnego znakowania markera astrocytarnego GFAP oraz markera mikrogleju Iba1 w odpowiednich hodowlach.
Obrazowanie wapnia pozwala ...

Prezentujemy tutaj protokół, jak przygotować pierwotne hodowle komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej szczurów do obrazowania poklatkowego wewnątrzkomórkowego Ca2+ do badań nad patofizjologią stwardnienia zanikowego bocznego w modelu szczurzym hSOD1G93A.

Pierwotne kultury astrocytów szczurów i mikrogleju oraz ich zastosowanie w badaniu stwardnienia zanikowego bocznego

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Protokół ten pozwala ujawnić międzykomórkowy wzorzec sygnalizacji wapniowej, który charakteryzuje odpowiedź każdego typu komórki zarówno w zdrowiu, jak i w chorobie. Technika ta pozwala na szybką i szczegółową biofizyczną charakterystykę złożonego zachowania komórkowego. Planujemy wykorzystać tę indukowaną przez IgG sygnalizację wapniową jako odcisk palca dla spersonalizowanej medycyny chorób neurozapalnych.W prawdziwym życiu nie jest łatwo dostrzec i śledzić wszystkie procesy i zdarzenia, zwłaszcza te dziejące się pod mikroskopem. Dlatego ważne są dane wizualne. Po odcięciu głowy od jednego do trzech dni szczeniąt odsłoń czaszkę, rozcinając skórę małymi skośnymi nożyczkami.Następnie otwórz czaszkę, przecinając otwór wielki w kierunku oczodołów i wykonaj prostopadłe cięcie linii środkowej. Usuń mózg z czaszki i umieść go na szalce Petriego zawierającej PBS. Użyj końcówki kleszczy, aby rozerwać połączenia między obiema półkulami i oddziel półkule zakrzywionymi kleszczami, delikatnie popychając półkulę od środka do boku.Użyj prostych i zakrzywionych kleszczy, aby usunąć opony, ostrożnie je rozrywając. Następnie usuń hipokamp, ściskając go zakrzywionymi kleszczami i wyrzuć lub użyj do innego przygotowania hodowli komórkowej. Następnie przenieś korę do 15-mililitrowej probówki zawierającej trzy mililitry zimnego PBS i homogenizuj tkankę, pipetując w górę iw dół 10 do 15 razy za pomocą jednomililitrowej końcówki.Odwirować komórki o masie 500 g przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach zimnego PBS, pipetując końcówką o pojemności jednego mililitra. Odwiruj ponownie i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach kompletnego DMEM uzupełnionego 10% FBS i antybiotykami.Po przeniesieniu homogenatu do dwumililitrowej probówki, przepuść homogenat przez igły o rozmiarze 21 i 23, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Wlać zawiesinę komórkową przygotowaną z jednej kory na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą trzy mililitry kompletnego DMEM i lekko wstrząsnąć szalką Petriego, tak aby zawiesina była równomiernie rozprowadzona. Inkubuj komórki w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla i 95% powietrzem w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Aby pobudzić wzrost astrocytów, usuń stare podłoże i umyj komórkę wstępnie podgrzanym PBS, aby usunąć luźno przyczepione komórki glejowe i ślady FBS, gdy osiągną 70 do 80% konfluencji. Następnie trypsynizuj leżącą poniżej warstwę astrocytów, dodając jeden mililitr wstępnie podgrzanego roztworu trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy komórki zaczynają się odłączać, i dodaj cztery mililitry kompletnego DMEM.Zbierz zawiesinę komórek i przenieś ją do 15-mililitrowej probówki. Następnie odwirować probówkę o masie 500 g przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze kompletnego podłoża.Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie przygotuj naczynie hodowlane i dodaj pożywkę hodowlaną. Ponownie platerować komórki w gęstości od 10 do czwartej komórek na centymetr kwadratowy w pięciu mililitrach świeżego kompletnego DMEM i myć komórki kompletnym DMEM przed każdą wymianą pożywki.Po osiągnięciu 70 do 80% konfluencji powtórz trypsynizację i wysiew pięć razy 10 do trzecich astrocytów na siedmiomilimetrowym okrągłym szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną. Pozwól im się przymocować przez 10 minut i dodaj cały DMEM. Użyj ich w eksperymentach po 48 godzinach.Po przygotowaniu kultur mikrogleju, w celu pobudzenia mikrogleju, pozwól komórkom glejowym na zlewanie się, a mikroglej pojawi się na warstwie astrocytów po 10 do 15 dniach. Potrząsaj szalką Petriego na wytrząsarce orbitalnej przez dwie godziny z prędkością 220 obr./min. Teraz delikatnie umyj oderwane i luźno połączone komórki, zasysając supernatant jednomililitrową końcówką pipety.Delikatnie dozuj supernatant na warstwę komórek kilka razy, upewniając się, że podczas tego etapu płukania pokryjesz całą powierzchnię warstwy komórek. Zbierz pożywkę z oderwanymi komórkami i przenieś ją do 15-mililitrowej probówki. Odwirować, ponownie zawiesić i policzyć komórki, jak pokazano wcześniej.Wysiewaj pięć razy po 10 do trzeciego mikrogleju na siedmiomilimetrowym okrągłym szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną. Pozwól im dołączyć przez 10 minut i dodaj cały DMEM. Użyj ich w eksperymentach po 48 godzinach.Aby wypłukać cały DMEM, przenieś jedno szkiełko nakrywkowe do naczynia z roztworem zewnątrzkomórkowym. Przygotuj roztwór ładujący barwnik, rozcieńczając jeden milimolowy Fluo-4 AM roztworem zewnątrzkomórkowym, aby osiągnąć końcowe stężenie pięciu mikromolowców. Umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami w roztworze barwiącym na 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności i myj komórki w roztworze zewnątrzkomórkowym przez 20 minut.Umieścić szkiełko nakrywkowe w komorze rejestracyjnej z jednym mililitrem roztworu roboczego. Wybierz pole widzenia ze stałą liczbą komórek w całym eksperymencie. Rozpocznij obrazowanie i określ linię bazową, uzyskując podstawowy poziom fluorescencji przez trzy do pięciu minut.Następnie zatrzymaj przepływ roztworu roboczego i przełącz się na roztwór testowy na żądany czas. Pomiędzy każdym roztworem badanym przemywać komórki stałym przepływem roztworu roboczego przez trzy do pięciu minut. Utrzymuj objętość roztworu w komorze rejestracyjnej na poziomie jednego mililitra, organizując stałe ssanie od góry roztworu.Wybierz ramkę o największej intensywności sygnału i okrąż jedną komórkę za pomocą narzędzia Wielokąt. Po okrążeniu wszystkich komórek w pozyskanym polu wybierz pięć interesujących obszarów w tle za pomocą narzędzia Okrąg. Następnie zmierz średnią intensywność sygnału pojedynczej komórki i tła dla każdej ramy czasowej.Zaznacz wszystkie interesujące Cię obszary i użyj polecenia Multi-Measure w Menedżerze ROI w ImageJ lub dowolnego równoważnego polecenia w oprogramowaniu komercyjnym. Po zaimportowaniu danych do oprogramowania MATLAB uśrednij pięć ROI w tle i odejmij uśrednione tło każdej klatki od średniej intensywności ROI klatek uzyskanych jednocześnie. Później przeanalizuj aktywność wapnia, określając amplitudę piku wapnia, zintegrowaną zmianę stanu przejściowego wapnia, czas do szczytu, czas narastania, połowę szerokości i częstotliwość.GFAP służy do wizualizacji astrocytów, a Iba1 do wizualizacji mikrogleju. astrocyty hSOD1G93A reagują na immunoglobulinę G ALS z większą amplitudą przejściowego wapnia, bardziej znaczącą ogólną zintegrowaną zmianą i krótszym czasem do osiągnięcia szczytu niż astrocyty nietransgeniczne. Odpowiedź na immunoglobulinę G ALS można odróżnić od odpowiedzi na ATP.Asturocyty hSOD1G93A miały wyższy poziom jonów wapnia w zapasach, co ujawniło się wyczerpaniem zapasów, co wskazuje na przeciążenie tego jonu. Mikroglej hodowano, a średnią intensywność fluorescencji ekstrahowano w czasie. Ślady wapnia w trzech komórkach oznaczały, że tylko jedna komórka zareagowała na immunoglobulinę G ALS, podczas gdy wszystkie komórki odpowiedziały na ATP.Pseudokolorowe obrazy reprezentowały intensywność fluorescencji i linię bazową w odpowiedzi na ALS, IgG i ATP. Komórki muszą być odpowiednio obciążone, a parametry systemu obrazowania muszą być odpowiednio dostosowane, tak aby sygnał nie został rozdzielony podczas eksperymentu. Wraz z wydzielaniem wapnia można wykonać zaciskanie łat.W ten sposób można uzyskać pełniejszy obraz korelacji między różnymi prądami jonów błonowych a emitowaniem wapnia. Zrozumienie wewnątrzkomórkowej homeostazy wapnia ma zasadnicze znaczenie dla badania kilku reakcji na bodźce naturalne, a także na stresowe i zewnętrzne.

primary-cultures-rat-astrocytes-microglia-their-use-study-amyotrophic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hodowli neuronów korowych szczura w obecności warstwy zasilającej z gleju. Hodowane neurony wykazują polaryzację i tworzą synapsy; mogą zostać one oddzielone od gleju w celu wykorzystania w różnych zastosowaniach, takich jak elektrofizjologia, obrazowanie wapnia, testy przeżywalności komórek, immunocytochemia oraz izolacja RNA/DNA/białek.

Bilaminarna kokultura pierwotnych neuronów korowych i gleby szczura

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Film demonstruje technikę hodowli pierwotnych astrocytów z kory szczura. Kora jest mechanicznie dysocjowana w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek glejowych, która jest następnie powlekana na płytkach pokrytych polipeptydami w celu promowania selektywnej proliferacji astrocytów. Następnie astrocyty są enzymatycznie dysocjowane od płytek i przenoszone na świeże podłoża, co pozwala na hodowlę czystych astrocytów.

Generowanie pierwotnej kultury astrocytów z mózgu szczeniaka szczura

Ten film demonstruje metodę izolowania i hodowli mikrogleju z mózgów szczurów. Polega ona na oddzieleniu mikrogleju od innych komórek neuronalnych i nieneuronalnych za pomocą płytek pokrytych przeciwciałem monoklonalnym specyficznym dla mikrogleju.

Izolacja i hodowla mikrogleju z mózgów szczurów przy użyciu pożywek bez surowicy

Astrocyty zostały uznane za wszechstronne komórki uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu oraz naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Tutaj przedstawiamy szybką procedurę uzyskiwania czystych hodowli astrocytów myszy w celu zbadania biologii tej głównej klasy komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Rozwój bólu neuropatycznego wiąże się z patologicznymi zmianami komórek glejowych rdzenia kręgowego. Brakuje niezawodnego systemu hodowli glejowej pochodzącego z dorosłej tkanki rdzenia kręgowego i przeznaczonego do badania tych komórek in vitro. Dlatego pokazujemy tutaj, jak ustalić pierwotne mieszane kultury glejowe z tkanki rdzenia kręgowego dorosłej myszy.

Przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłych myszy

Opisany tutaj protokół AWESAM jest optymalny do hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych w szybki, prosty i tani sposób. Astrocyty AWESAM wykazują spontaniczną sygnalizację Ca2 +, morfologię i profile ekspresji genów podobne do astrocytów in vivo.

Hodowla mysich astrocytów podobnych do vivo przy użyciu szybkiego, prostego i niedrogiego protokołu AWESAM

Wysiłki zmierzające do szczegółowego zrozumienia funkcji mikrogleju zostały utrudnione przez brak modeli hodowli mikrogleju, które podsumowują właściwości dojrzałego mikrogleju in vivo. Protokół ten opisuje podejście oparte na izolacji i hodowli, mające na celu utrzymanie solidnego przetrwania wysoce rozgałęzionego dojrzałego mikrogleju szczurów w warunkach o zdefiniowanej pożywce.

Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje izolację oczyszczonych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, ułatwiając późniejsze zastosowania, takie jak analiza RNA i hodowla komórek. Zawiera szczegółowe metody i procedury dysocjacji komórek mające na celu poprawę zarówno jakości, jak i wydajności izolowanych komórek.

Izolacja czystych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do testów in vitro i badań transkryptomicznych

Poznaj metodę hodowli pierwotnych astrocytów i mikrogleju szczura do badania sygnalizacji wapniowej w kontekście stwardnienia zanikowego bocznego. Protokół umożliwia szczegółową analizę zachowania komórkowego.

Pierwotne kultury astrocytów szczurów i mikrogleju oraz ich zastosowanie w badaniu stwardnienia zanikowego bocznego

Przeglądaj więcej filmów