Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

Protokół ten zademonstruje implementację i optymalizację mikroskopii spektralnej SRS oraz sposób, w jaki można ją wykorzystać do zastosowań histologicznych stymulowanych ramanowskim w czasie rzeczywistym. Główną zaletą tej techniki jest szybkość, z jaką próbki mogą być przetwarzane po odpowiednim ustawieniu oprzyrządowania, ponieważ SRS nie wymaga przetwarzania i barwienia tkanek. Protokół ten ma zastosowanie do innych aplikacji SRS, nie tylko do histologii.

Takie zastosowania obejmują małe cząsteczki, leki, komórki i tkanki. Zacznij od zainstalowania pary soczewek achromatycznych dla wiązki pompy, aby dwukrotnie zwiększyć rozmiar wiązki laserowej jako punkt wyjścia. Umieść soczewkę o średnicy 100 i 200 milimetrów w odległości około 300 milimetrów od siebie.

Następnie wyrównaj wiązkę pompy przez środek obu soczewek. Następnie umieść lustro za drugą soczewką, aby wysłać wiązkę w kierunku ściany oddalonej o więcej niż jeden metr. Śledź wiązkę od lustra do ściany za pomocą karty IR i sprawdź, czy wiązka zmienia swój rozmiar.

Skolimuj wiązkę, jeśli belka zmienia swój rozmiar w funkcji odległości. Połącz dwie wiązki laserowe, instalując lusterko dichroiczne z kilkoma lusterkami kierowniczymi do regulacji. Zoptymalizuj przestrzenne nakładanie się pompy i Stokesa, monitorując wiązki za zwierciadłem dichroicznym w dwóch różnych miejscach oddalonych od siebie o około jeden metr.

Iteracyjnie wyreguluj lusterko kierownicze, a następnie lusterko dichroiczne, aby wyrównać belkę Stokesa z belką pompy. Upewnij się, że połączone wiązki są wysyłane do środka lusterek skanujących laserowego mikroskopu skaningowego, regulując parę lusterek sterujących, gdy lusterka skanujące znajdują się w pozycji zaparkowanej. Po kondensatorze użyj kolejnej pary soczewek o ogniskowych odpowiednio 100 milimetrów i 30 milimetrów, aby przekazać transmitowaną wiązkę na fotodiodę, upewniając się, że obie wiązki są zawarte w fotodiodzie.

Następnie zainstaluj dwa filtry dolnoprzepustowe, aby zablokować modulowaną wiązkę Stokesa. Umieść próbnik wiązki na ścieżce wiązki Stokesa, aby pobrać 10% wiązki i wysłać ją do szybkiej fotodiody w celu wykrycia ciągu impulsów o częstotliwości 80 megaherców. Weź jedno z wyjść bufora fanout i przefiltruj je filtrem pasmowo-przepustowym, aby uzyskać falę sinusoidalną o częstotliwości 20 megaherców.

Następnie użyj tłumika RF, aby dostosować napięcie szczytowe do szczytowego napięcia wyjściowego do około 500 miliwoltów. Wyślij wynikowe wyjście do przesuwnika fazowego, który umożliwia precyzyjną regulację fazy RF za pomocą źródła napięcia. Wyślij to wyjście do wzmacniacza mocy RF i podłącz wyjście amplifier do EOM.

Po odblokowaniu wiązki Stokesa zoptymalizuj głębokość modulacji pierwszego EOM, umieszczając fotodiodę w ścieżce wiązki. Dostosuj napięcie EOM i płytkę ćwierćfalową, aż głębokość modulacji będzie wydawać się zadowalająca. Umieść fotodiodę za lustrem dichroicznym, aby wykryć wiązkę laserową.

Najpierw zablokuj wiązkę Stokesa, a następnie powiększ jeden z pików impulsów pompy na oscyloskopie. Umieść pionowy kursor, aby zaznaczyć czasowe położenie tego piku za pomocą oscyloskopu. Teraz zablokuj belkę pompy i odblokuj wiązkę Stokesa.

Przetłumacz stopień opóźnienia, aby tymczasowo dopasować pozycje szczytowe na oscyloskopie do pozycji zaznaczonej w poprzednim kroku. Obliczając odległość opóźnienia wymaganą do dopasowania dwóch wiązek, a następnie wydłużając tor wiązki szybszej wiązki lub skracając tor wiązki wolniejszej wiązki. Następnie przygotuj próbkę szkiełka mikroskopowego z DMSO i taśmą dwustronną jako przekładką, aby utrzymać próbkę między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.

Umieścić próbkę na mikroskopie stroną z szkiełkiem nakrywkowym skierowaną w stronę obiektywu mikroskopu i obserwować próbkę z dwuteownika w świetle jasnego pola. Znajdź punkt skupienia próbki zarówno na górnej, jak i dolnej warstwie pęcherzyków powietrza na styku taśmy szklanej, a następnie przesuń fokus tak, aby znajdował się między dwiema warstwami taśmy. Następnie ustaw moc wyjściową przestrajalnej wiązki na 798 nanometrów.

W oparciu o przepustowość optyczną kondensatora dostosuj moc optyczną tak, aby wynosiła około 40 miliwatów dla pompy i wiązek Stokesa w ognisku obiektywu. Następnie otwórz zeskanowany obraz w MATLAB i kliknij przycisk oznaczony ostrością, aby rozpocząć skanowanie. Wyreguluj lusterko kierownicze przed skanerem galvo, aby wyśrodkować sygnał DC na wyświetlaczu pierwszego kanału.

Przesuń zmotoryzowany stopień opóźniający i uważnie obserwuj wyjście blokady pokazane na wyświetlaczu kanału drugiego. Na koniec dostosuj opóźnienie czasowe, aby zmaksymalizować intensywność sygnału AC. Wyreguluj zwierciadło dichroiczne, aby wyśrodkować sygnał SRS na kanale AC.

Następnie wyreguluj fazę wzmacniacza lock-in, aby zmaksymalizować sygnał. Po zamontowaniu szkiełka z próbką na mikroskopie i dostosowaniu mocy obu wiązek do około 40 miliwatów każda przy ognisku próbki, jak pokazano wcześniej. Otwórz zeskanowany obraz z programu MATLAB.

Następnie znajdź maksymalny sygnał SRS, skanując stopień opóźniający odpowiadający 2,913 odwrotnemu centymetrowemu pikowi Ramana DMSO. Uzyskaj obraz SRS odpowiadający pikowi Ramana o długości 2 913 913 centymetrów odwrotnych do 2 DMSO. Otwórz obraz w ImageJ i wybierz mały obszar na środku ramki.

Funkcja miary służy do obliczania średniej i odchylenia standardowego wartości w wybranym obszarze. Aby uzyskać kalibrację dostępu do częstotliwości, zapisz skan hiperspektralny z zakresem stopnia opóźnienia obejmującym 2, 913 i 2, 994 odwrotne centymetrowe piki Ramana DMSO. Następnie zapisz pozycje stolika odpowiadające zestawowi danych hiperspektralnych.

Wykonaj regresję liniową dla pozycji stołu montażowego i przesunięć Ramana o 2, 913 i 2, 994 centymetry odwrotne. Korzystając z równania regresji liniowej, przekształć pozycje opóźnienia na odpowiadające im częstotliwości Ramana. W celu kalibracji rozdzielczości spektralnej należy oszacować pozycję stolika na podstawie poprzedniej pozycji ze zwiększoną długością ścieżki optycznej spowodowaną wstawieniem prętów.

Wyrównaj przestrzenne zachodzenie belek na siebie ze względu na niewielkie odchylenie belki podczas dodawania prętów szklanych. Zainstaluj rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej, płytkę ćwierćfalową i drugi EOM w ścieżce wiązki nasączającej po pierwszym EOM. Odłącz wejście sygnału od drugiego EOM, a następnie podłącz wejście sygnału do pierwszego EOM i włącz go.

Moduluj wiązkę Stokesa z częstotliwością 20 megaherców, wysyłając wiązkę przez pierwszy EOM. Dostosuj nachylenie i położenie pierwszego EOM, aby upewnić się, że wiązka jest wyśrodkowana przez kryształ EOM. Przygotować próbkę szkiełka tkankowego za pomocą taśmy dwustronnej, szkiełka mikroskopowego i szkła nakrywkowego.

Umieść próbkę na mikroskopie stroną z szkiełkiem nakrywkowym skierowaną w stronę obiektywu mikroskopu. W przypadku obrazowania SRS w trybie epi zainstaluj płytkę półfalową, zanim wiązka wejdzie do mikroskopu, aby zmienić polaryzację wiązki docierającej do mikroskopu. Umieść rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej nad obiektywem, aby umożliwić zdepolaryzowaną wiązkę odbitą wstecznie do detektora.

Następnie użyj 75-milimetrowej soczewki achromatycznej i 30-milimetrowej soczewki asferycznej, aby przekazać rozproszone wstecznie fotony z tylnej apertury obiektywu do fotodetektora. Zamontuj detektor, aby zebrać światło rozproszone wstecznie skierowane przez rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej. Następnie zainstaluj filtr, aby zablokować modulowaną wiązkę przed wejściem do detektora.

Różnice w długościach prętów wpływają na rozdzielczość spektralną. Gdy nie są używane szklane pręty ćwierkające, dwa piki Ramana z DMSO nie są w ogóle rozwiązywane. Wzrost liczby szklanych ćwierkających prętów zaczyna rozwiązywać dwa szczyty w zadowalającym punkcie.

Dopasowane ćwierkanie rozwiązuje oba szczyty i może być używane do kalibracji pozycji stopnia do częstotliwości. Dwa ciągi impulsów z opóźnieniem czasowym o polaryzacji ortogonalnej użyte do obrazowania widm DMSO pokazują opóźnienie czasowe między wzbudzeniami SRS z akceptowalną głębokością modulacji i separacją czasową. W przeciwieństwie do tego, słabe dwukolorowe przesunięcie fazowe SRS powoduje powstawanie odwróconych lub ujemnych pików.

Pokazano tutaj dwukolorowe obrazowanie SRS w czasie rzeczywistym na 2, 850 i 2, 930 odwrotnych centymetrach tkanki mózgowej myszy ex vivo. Surowe obrazy lipidów i białek zostały oznaczone kolorami, aby uzyskać pojedynczy obraz przedstawiający wkład lipidów i białek. Przeprowadzono również fałszywe barwienie hematoksyliny i eozyny, aby naśladować barwienie hematoksyliną i eozyną do patologicznych zastosowań.

Przestrzenne nakładanie się czasowe i optymalizacja rozdzielczości przestrzennej to najważniejsze kroki w podejściu SRS do ogniskowania przestrzennego. Ta metoda jest ogólnie stosowana do innych eksperymentów mikroskopowych z sondą pompy, takich jak mikroskopia absorpcyjna w stanach nieustalonych. Metoda pozwala również na obrazowanie cząsteczek niefluorescencyjnych w komórkach i tkankach.

Przedstawiona tutaj metoda przyspiesza czas pozyskiwania obrazów do przyszłej translacji stymulowanej histologii Ramana w klinice.