Wysokoprzepustowa analiza niefotochemicznego hartowania w uprawach przy użyciu fluorometrii chlorofilu z modulacją amplitudy impulsów

Metoda ta może zapewnić wgląd w zmienność genetyczną w niefotochemicznym hartowaniu dostępnym w panelach różnorodności genetycznej lub populacjach hodowlanych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania przesiewowego dużej liczby genotypów pod kątem zmienności w niefotochemicznym hartowaniu w ciągu jednego dnia. Protokół jest przedstawiony dla glicyny max lub soi, ale może być dostosowany do analizy innych przestrzeni roślinnych, z których można pobrać talerze podnoszące.

Dla kogoś, kto wykonuje protokół po raz pierwszy, kluczowe jest obchodzenie się z tarczą podnoszącą, aby zapobiec uszkodzeniu lub przesyceniu gąbek wodą. Na początek pobierz próbki roślin na polu 30 dni po wykiełkowaniu. Napełnij 1/3 poziomu wody destylowanej we wszystkich studzienkach 24-dołkowej płytki.

Na wieczku i boku płytki należy oznaczyć kontrpróby, z których należy pobrać próbki. Przytrzymaj najmłodszy, w pełni rozwinięty liść znajdujący się na szczycie rośliny przy gumowym korku. Wciśnij świdrowiec korkowy Humboldta numer dwa przez liść i przekręć, aby przeciąć krążek, omijając środkowe żebro.

Kolejno zbierz pięć krążków z tego samego liścia w celu uzyskania replik technicznych. Wypchnij krążki liściowe z omacnicy korkowej do pojedynczego dołka na 24-dołkowej płytce za pomocą bawełnianego wacika i powtórz to dla innej rośliny o tym samym genotypie. Sprawdź, czy wszystkie krążki liściowe unoszą się w wodzie.

Jeśli nie, delikatnie przesuń krążki liściowe przyklejone do boku studni do pozycji pływającej za pomocą bawełnianego wacika. Przejdź do dysków z próbkowaniem z poniższego wykresu. Umieść pokrywkę i uszczelnij półprzezroczystą elastyczną folią.

po zakończeniu pobierania próbek na całej płytce 24-dołkowej. Przechowuj talerz z dala od bezpośredniego światła słonecznego w torbie, pudełku lub pustej lodówce. W czystej przestrzeni laboratoryjnej postukaj w pokrywę zapieczętowanej płytki, aby usunąć krążki liściowe przyklejone do pokrywy podczas transportu.

Rozwiń folię i zdejmij pokrywkę. Przenieść krążek liściowy z pierwszego położenia płytki 24-dołkowej na świeżą płytkę 96-dołkową z krążkiem liściowym skierowanym płasko w dół na dnie studzienki. Przetnij filtr aspiratora do nosa na pół.

Zanurz powstały filtr do połowy w wodzie i przetrzyj ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Włóż filtr do studzienki z tarczą liściową, aby utrzymać wilgotność. Wziąć drugi krążek liściowy z pierwszej pozycji płytki 24-dołkowej i umieścić go stroną zadrukowaną do dołu w następnej dostępnej pozycji płytki 96-dołkowej.

Zanurz pozostałą połowę wytworzonego filtra nosowego w wodzie i przetrzyj go ręcznikiem papierowym przed włożeniem go do studzienki z drugim krążkiem liściowym. Przyklej taśmą prawy górny róg, aby ułatwić orientację płytki w ciemności w celu obrazowania. Uszczelnij płyty półprzezroczystą elastyczną folią i zawiń płytę w folię aluminiową.

Napisz numery działek i identyfikatory tabliczki na folii aluminiowej. Umieść płytki w ciemnym pudełku lub szafce na co najmniej 30 minut, aby rozluźnić pierwsze dwie fazy hartowania niefotochemicznego. Stosować przedłużony okres inkubacji w ciemności, wynoszący jedną godzinę przed obrazowaniem, jeśli interesujące są długoterminowe fazy hartowania niefotochemicznego.

Przygotować dodatkową atrapę płytki do ogniskowania podczas analizy, umieszczając krążek liściowy w każdym rogu świeżej płytki 96-dołkowej i jeden pośrodku. Zabezpiecz krążki liściowe filtrami do nosa, tak jak w przypadku poprzednich płytek, uszczelnij płytkę i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej i wilgotności względnej 50%. Włącz imager i otwórz oprogramowanie do obrazowania.

Kliknij Ustawienia, a następnie Protokół, aby otworzyć okno do wprowadzania kroków w eksperymentalnym protokole PAM. Ustaw specyfikację techniczną maszyny podaną w rękopisie. Ustaw program tak, aby rozpoczynał się od impulsu nasycającego, aby zmierzyć maksymalną wydajność kwantową fotosyntezy przystosowanej do ciemności, wprowadzając 20 sekund w polu o nazwie Po opóźnieniu.

Kliknij pole Zastosuj impuls i wprowadź 1 w polu zatytułowanym Tyle razy. Ustaw impuls PPFD na 6, 152, długość impulsu na 800 milisekund i zaznacz pole Wykonaj zdjęcia F prime i FM prime ze wszystkimi impulsami. Zaznacz opcję Wstaw po, aby dodać drugi krok do protokołu.

Wprowadź 30 sekund w polu zatytułowanym Po opóźnieniu. Następnie należy wybrać opcję Zmień aktynikę i w polu zatytułowanym Actinic PPFD wprowadzić wartość 50, aby ustawić natężenie światła w komorze na 50 PPFD. Kliknij Wstaw po, aby dodać nowy krok do protokołu i wprowadź 150 sekund w polu zatytułowanym Po opóźnieniu.

Wybierz opcję Zastosuj impuls i wprowadź 4 w polu zatytułowanym Ta liczba razy, aby zastosować impulsy pomiarowe co 150 sekund cztery razy z rzędu, gdy światło aktyniczne jest utrzymywane na poziomie 50 PPFD. Dostosuj opóźnienie i natężenie światła dla każdego kroku zgodnie z wartościami podanymi w manuskrypcie przed zapisaniem protokołu jako pliku pcl w żądanej lokalizacji. Wyłącz światło i umieść atrapę płytki ekranem do dołu na stoliku na próbkę, tak aby powierzchnia adaksjalna liścia była skierowana w górę w kierunku detektora, a gąbka była skierowana w dół w kierunku platformy.

Ustaw wysokość stolika próbki tak, aby tarcze liściowe znajdowały się 140 milimetrów nad podstawą urządzenia. Kliknij ikonę połącz/rozłącz z kamerą imager i kamerą sprzętową, aby uruchomić kamerę. Kliknij symbol fluorescencji ostrości, reprezentowany przez czerwoną, dwustronną ikonę strzałki z dwiema zielonymi liniami u podstawy, a następnie dostosuj obiektyw i ekspozycję, aby ustawić ostrość na płycie.

Kliknij ponownie ikonę fluorescencji ostrości, aby wyłączyć światło. Pracując w ciemności, zastąp atrapę płytki płytką do analizy. Umieść go ekranem do dołu z taśmą na zewnątrz używaną do orientacji w prawym górnym rogu i kliknij ikonę kamery obrazu mapy.

Dostosuj ekspozycję obrazu, otwierając lub zamykając przysłonę, aż pasek w wyskakującym okienku znajdzie się w zielonej strefie. Klikaj przycisk Spróbuj ponownie po każdej regulacji przysłony, aż ekspozycja zostanie prawidłowo wyregulowana, a instrument wykona zdjęcie. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Zastosuj izolację obrazu, aby zablokować sygnały tła.

Skoncentrowany obszar liścia będzie wyświetlany w kolorze szarym, a tło w kolorze niebieskim. Wybierz obszar lub piksele, które mają obejmować tylko dyski liści, dostosowując histogram i poziom gamma z menu rozwijanego Modyfikuj obraz, klikając obraz prawym przyciskiem myszy. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz Usuń wysokie i niskie cięcia, aby usunąć jasnoniebieskie podświetlone obszary.

Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz Usuń zabłąkane, aby usunąć wszystkie piksele, które nie dotykają ostatnich trzech pozostałych pikseli. Wszystkie obszary na obrazie, które pojawiają się jako izolowane wyspy, zostaną przeanalizowane oddzielnie i uwzględnione w końcowych danych wyjściowych. Kliknij ikonę uruchamiania protokołu, aby uruchomić program.

U dołu ekranu pojawi się licznik czasu informujący o tym, ile czasu pozostało do działania protokołu. Poczekaj, aż protokół zostanie zakończony. Kliknij Plik i Zapisz jako, aby zapisać dane jako plik igr.

Zamknij okno, klikając czerwony krzyżyk w prawym górnym rogu okna przed rozpoczęciem kolejnej płytki próbki. Aby wyeksportować dane fluorescencji chlorofilu, otwórz plik igr w oprogramowaniu do obrazowania i kliknij Plik, a następnie Eksportuj do folderu, aby utworzyć nowy folder ze wszystkimi niezbędnymi plikami. Typowy pomiar niefotochemicznego hartowania w soi uprawianej na polu wykazał, że po początkowym błysku nasycenia w celu określenia Fv/Fm, gdy krążki liści były wystawione na działanie słabego światła 50 mikromoli na metr na sekundę, niefotochemiczne hartowanie było mniejsze niż jeden.

Co więcej, po przeniesieniu do wysokiego oświetlenia wynoszącego 2 000 mikromoli na metr na sekundę, niefotochemiczne wygaszanie wzrastało do maksymalnej wartości czterech po 15 minutach. Nieudany pomiar wykazał minimalny wzrost niefotochemicznego wygaszania po przeniesieniu do wysokiego światła. Orientacja płytek w imagerze oraz jasno zdefiniowany plan pobierania próbek i posiewu krążków liściowych są niezbędne do zapewnienia, że dane są powiązane z prawidłowym genotypem.

Protokół ten może określić ilościowo wpływ zmiennych środowiskowych, takich jak susza i linienie, na hartowanie niefotochemiczne lub ocenić hartowanie niefotochemiczne na różnych poziomach koron drzew w celu udoskonalenia modeli upraw.