Name: Wysokoprzepustowa analiza niefotochemicznego hartowania w uprawach przy użyciu fluorometrii chlorofilu z modulacją amplitudy impulsów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowej analizy niefotochemicznego hartowania w uprawach Glycine max przy użyciu fluorometrii PAM. Technika umożliwia szybkie badanie zróżnicowania genetycznego w ciągu jednego dnia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez projekt badawczy Realizing Increased Photosynthetic Efficiency (RIPE), który jest finansowany przez Fundację Billa i Melindy Gatesów, Fundację Badań nad Żywnością i Rolnictwem oraz Brytyjskie Biuro Spraw Zagranicznych, Wspólnoty Narodów i Rozwoju w ramach grantu numer OPP1172157.

1. Sadzenie nasion
<ol>
	<li>Wybierz pole z żyzną, przepuszczalną, ale nie piaszczystą glebą i o pH prawie 6,5. Wytyczyć działki rzędowe o długości 1,2 m w rozstawie 0,75 m, nacinając ziemię motyką.</li>
	<li>Posadzić 50 nasion/m G. max odmiany IA3023 na głębokości 3 cm wzdłuż każdej działki na początku sezonu wegetacyjnego, gdy temperatura gleby wynosi od 25 do 30 °C. 
	UWAGA: Do celów badań przesiewowych różnorodności genetycznej oczekuje się, że hodowanych i porównywanych jest wiele różnych genotypów. Posadź 2-5 rzędów na genotyp ułożonych w losowy wzór blokowy. Należy wziąć pod uwagę, czy warunki klimatyczne sprzyjają wzrostowi soi, w tym rodzaj gleby, temperaturę i długość dnia.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek liści z pola
<ol>
	<li>Pobrać próbki z roślin na polu 30 dni po wykiełkowaniu. 
	UWAGA: Po 30 dniach rośliny soi znajdą się w fazie wegetatywnej. Liczba dni po wykiełkowaniu przed pobraniem próbek zależy od kwestii biologicznej, którą się zajmujemy.</li>
	<li>Napełnij studzienki 24-dołkowej płytki do 1/3rd wodą destylowaną. Na wieczku i boku płytki należy oznaczyć kontrpróby, z których należy pobrać próbki.</li>
	<li>Wybierz najmłodszy, w pełni rozwinięty liść na szczycie rośliny, z której chcesz pobrać próbki. Przytrzymaj liść przy gumowym korku.</li>
	<li>Wciśnij świdrowiec korkowy Humboldta #2 przez liść i przekręć, aby przeciąć krążek, unikając nerwu środkowego. Kolejno zbierz 5 dysków z tego samego liścia w celu przeprowadzenia replik technicznych. Na każdą działkę należy pobrać około 30% więcej krążków liściowych niż jest to wymagane w przypadku uszkodzenia tkanki liścia podczas transportu lub pobierania próbek. 
	UWAGA: Liczba kontrprób biologicznych (poletka lub rośliny) oraz liczba kontrprób technicznych (krążki liściowe z tej samej rośliny lub działki) mogą się różnić w zależności od projektu doświadczalnego.</li>
	<li>Wypchnij krążki liściowe z omacnicy korkowej do pojedynczego dołka na 24-dołkowej płytce za pomocą bawełnianego wacika. Sprawdź, czy wszystkie krążki liściowe unoszą się w wodzie. Jeśli nie, delikatnie przesuń krążki liściowe przyklejone do boku studni do pozycji pływającej za pomocą bawełnianego wacika.</li>
	<li>Przejdź do następnego wykresu i powtórz kroki od 2.3 do 2.5. Wypchnij krążki liściowe z omacnicy korkowej do osobnej studzienki w 24-dołkowej płytce za pomocą bawełnianego wacika. Powtórz ten krok, aby zebrać trzecią kontrpróbę biologiczną.</li>
	<li>Powtarzać krok 2.6 do momentu pobrania próbek z pełnej płytki 24-dołkowej. Umieść pokrywkę i zamknij półprzezroczystą, elastyczną folią. Przechowuj talerz z dala od bezpośredniego światła słonecznego, w torbie, pudełku lub pustej lodówce (bez lodu). </li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek do analizy
<ol>
	<li>Po pobraniu próbek powrócić do czystej przestrzeni laboratoryjnej. Postukaj w pokrywę uszczelnionej płytki, aby usunąć krążki liści przyklejone do pokrywy podczas transportu. Rozwiń folię i zdejmij pokrywkę.</li>
	<li>Przenieść krążek liściowy z pierwszego położenia płytki 24-dołkowej na świeżą płytkę 96-dołkową, tak aby krążek liściowy był skierowany płasko w dół na dnie studzienki.</li>
	<li>Przetnij filtr aspiratora do nosa na pół. Zanurz powstały filtr do połowy w wodzie i przetrzyj ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Włóż filtr do studzienki z dyskiem liściowym, aby utrzymać wilgotność.</li>
	<li>Wziąć drugi krążek liściowy z pierwszej pozycji płytki 24-dołkowej i umieścić ją stroną zadrukowaną do dołu w następnej dostępnej pozycji płytki 96-dołkowej. Zanurz pozostałą połowę filtra nosowego wytworzonego w kroku 3.3 w wodzie i przetrzyj ręcznik papierowy przed włożeniem go do studzienki z drugim krążkiem liściowym.</li>
	<li>Powtórzyć kroki od 3.3 do 3.4 dla trzeciego krążka liściowego od pierwszego położenia płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Przejdź do drugiej pozycji płytki 24-dołkowej i powtórz kroki od 3.3 do 3.5.</li>
	<li>Umieść pokrywkę na talerzu, gdy wszystkie studzienki mają włożone dyski liściowe i filtry aspiratora do nosa. Przyklej taśmą prawy górny róg, aby ułatwić orientację płytki w ciemności w celu obrazowania.</li>
	<li>Uszczelnij płytki półprzezroczystą, elastyczną folią i zawiń płytkę w folię aluminiową. Napisz numery działek i identyfikatory tabliczki na folii aluminiowej.</li>
	<li>Umieść płytki w ciemnym pudełku lub szafce na co najmniej 30 minut, aby umożliwić rozluźnienie pierwszych dwóch faz NPQ (qE, qT, qZ). Należy zastosować dłuższy, ciemny okres inkubacji wynoszący 1 godzinę przed obrazowaniem, jeśli interesujące są długoterminowe fazy NPQ.</li>
	<li>Przygotuj dodatkową atrapę płytki do ustawiania ostrości podczas analizy. Aby to zrobić, umieść krążek liściowy w każdym z rogów świeżej 96-dołkowej płytki i jeden pośrodku. Zabezpiecz dyski liściowe filtrami do nosa, tak jak w przypadku poprzednich płytek. Uszczelnij płytkę i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej (24 °C), ~50% wilgotności względnej.</li>
</ol>
4. Pomiar niefotochemicznego wygaszania za pomocą kamery fluorescencyjnej chlorofilu
<ol>
	<li>Włącz imager i otwórz oprogramowanie do obrazowania. Kliknij Ustawienia > Protokół, aby otworzyć okno wprowadzania kroków w eksperymentalnym protokole PAM. Dane techniczne maszyny znajdują się w tabeli uzupełniającej 3.</li>
	<li>Ustaw program tak, aby rozpoczynał się od impulsu nasycającego, aby zmierzyć maksymalną wydajność kwantową fotosyntezy przystosowanej do ciemności, wprowadzając 20 s w polu: Po opóźnieniu. Kliknij pole Zastosuj impuls i wprowadź 1 w polu: Tyle razy.</li>
	<li>Ustaw impuls PPFD na 6152, długość impulsu na 800 ms i zaznacz pole Wykonaj obrazy F' i Fm' ze wszystkimi impulsami. Kliknij przycisk Wstaw po, aby dodać drugi krok do protokołu.</li>
	<li>Wprowadź 30 s w polu: Po opóźnieniu. Wybierz opcję Zmień aktynikę i wpisz 50 w polu: Actinic PPFD, aby ustawić natężenie światła w komorze na 50 PPFD.</li>
	<li>Kliknij przycisk Wstaw po, aby dodać nowy krok do protokołu. Wprowadź 150 s w polu: Po upływie czasu wybierz Zastosuj impuls i wprowadź 4 w polu: Ta liczba razy, aby zastosować impulsy pomiarowe co 150 s, 4 razy z rzędu, gdy światło aktyniczne jest utrzymywane na poziomie 50 PPFD.</li>
	<li>Pełne informacje o protokole znajdują się w Tabeli 1, należy wykonać kroki 4.2 i 4.3, aby zmienić natężenie światła, a kroki 4.4 i 4.5, aby przejść do cykli impulsów nasycenia. Dostosuj opóźnienie i natężenie światła dla każdego kroku zgodnie z wartościami podanymi w Tabeli 1. Zapisz protokół jako plik .pcl w znanej lokalizacji.</li>
	<li>Wyłącz światło, umieść atrapę płytki na stoliku na próbkę i ustaw wysokość stolika na próbkę tak, aby krążki liściowe znajdowały się 140 mm nad podstawą przyrządu. Używana jest atrapa płytki, ponieważ światło będzie wielokrotnie migać na płytę podczas ustawiania ostrości; Będzie to wymagało adaptacji wszystkich mierzonych próbek do ponownego zaciemnienia i może spowodować fotouszkodzenia.</li>
	<li>Kliknij ikonę Połącz/Rozłącz z kamerą termowizora i kamerą sprzętową, aby uruchomić kamerę. Kliknij symbol ostrości (fluorescencji) reprezentowany przez czerwoną ikonę dwustronnej strzałki z dwiema zielonymi liniami u podstawy. Dostosuj obiektyw i ekspozycję, aby ustawić ostrość na płycie.</li>
	<li>Kliknij ponownie ikonę Ostrość (fluorescencja), aby wyłączyć światło. Pracując w ciemności, zastąp atrapę płytki płytką do analizy.</li>
	<li>Kliknij ikonę kamery obrazu mapy. Dostosuj ekspozycję obrazu, otwierając lub zamykając przysłonę, aż pasek w wyskakującym okienku znajdzie się w zielonej strefie.</li>
	<li>Klikaj przycisk Spróbuj ponownie po każdej regulacji przysłony, aż ekspozycja zostanie prawidłowo wyregulowana, a instrument wykona zdjęcie. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz Zastosuj izolację obrazu, aby zablokować sygnały tła. Skoncentrowany obszar liścia będzie wyświetlany w kolorze szarym, a tło w kolorze niebieskim.</li>
	<li>Wybierz interesujący obszar/piksele, aby uwzględnić tylko dyski liści, dostosowując histogram i poziom gamma z menu rozwijanego modyfikuj obraz, klikając obraz prawym przyciskiem myszy.</li>
	<li>Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Usuń wysokie i niskie cięcia (mapa kolorów), aby usunąć jasnoniebieski podświetlony obszar. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz Usuń zabłąkane (ciężkie), aby usunąć wszystkie piksele, które nie stykają się z co najmniej trzema innymi pikselami. 
	UWAGA: Wszystkie obszary na obrazie, które pojawiają się jako odizolowane wyspy, zostaną przeanalizowane oddzielnie i uwzględnione w końcowych danych wyjściowych. Izolacja obrazu i usuwanie zabłąkanych pikseli zapewnia czyste, zrozumiałe dane.</li>
	<li>Kliknij ikonę Uruchom protokół, aby uruchomić program, u dołu ekranu pojawi się licznik czasu informujący, ile czasu pozostało do działania protokołu.</li>
	<li>Poczekaj, aż protokół zostanie zakończony, kliknij Plik > Zapisz jako i zapisz dane jako plik .igr. Zamknij okno, klikając czerwony krzyżyk w prawym górnym rogu okna, zanim zaczniesz uruchamiać kolejną płytkę próbną.</li>
	<li>Otwórz nowy plik dla następnej próbki, wybierając opcję Plik > Nowy i powtarzaj kroki od 4.10 do 4.15, aż wszystkie płytki zostaną zmierzone. 
	UWAGA: Zaleca się mierzenie płytek w okresie 4 godzin lub krótszym, aby zminimalizować potencjalny wpływ regulacji okołodobowej na wyniki</li>
</ol>
5. Przetwarzanie danych fluorescencyjnych chlorofilu
<ol>
	<li>Otwórz plik .igr w oprogramowaniu do obrazowania. Wyeksportuj dane, klikając Plik > Eksportuj do folderu, aby utworzyć nowy folder ze wszystkimi niezbędnymi plikami.</li>
	<li>Skopiuj następujące trzy pliki MATLAB do folderu wynikowego: MapAndLabelDiscs.m (plik uzupełniający 1), ProcessFoFm.m (plik uzupełniający 2) i ProcessNPQdata.m (plik uzupełniający 3) oraz plik R: create_file_to_process. R (plik uzupełniający 4).</li>
	<li>Otwórz MapAndLabelDiscs.m (plik uzupełniający 1) w programie MATLAB i uruchom. Zapisz mapę ponumerowanych dysków liści wygenerowanych w oknie podręcznym jako plik .png, aby później sprawdzić numerację dysków liści</li>.
	<li>Otwórz plik ProcessFoFm.m (Plik uzupełniający 2) w programie MATLAB i uruchom, aby obliczyć wartości Fo i F m dla każdego dysku liścia. Uruchom ProcessNPQdata.m (plik uzupełniający 3), aby obliczyć wartości NPQ w każdym punkcie czasowym.</li>
	<li>Otwórz plik create_file_to_process. R (Plik uzupełniający 4) w Rstudio i dodaj datę do kodu w wierszu 5. Dodaj numer rejestracyjny do wiersza 8 w create_file_to_process.R.</li>
	<li>Uruchom create_file_to_process. R, aby skonsolidować wartości Fv/Fm i dane NPQ w jednym pliku, którego nazwa pochodzi od danych z przyrostkiem -cf-summary.csv. Sprawdź numerację dysków liści w pliku cf-summary z kroku 5.5, korzystając z pliku .png z kroku 5.3. Dodatkowe informacje dotyczące numeru działki i przystąpienia.</li>
	<li>Otwórz skrypt języka R CF-data-processing_2.R (plik uzupełniający 5) i zmień wiersz 13 na ścieżkę katalogu roboczego. Zmień wiersz 16 w CF-data-processing_2.R na nazwę pliku z kroku 5.5.</li>
	<li>Zmień wiersz 48 w CF-data-processing_2.R na nazwę pliku wyjściowego. Uruchom skrypt CF-data-processing_2.R, aby ponownie sformatować dane do dopasowania krzywej.</li>
	<li>Otwórz skrypt MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (Plik uzupełniający 6) w programie MATLAB i zmień wiersz 5 na nazwę pliku wyjściowego z kroku 5.8. Zmień wiersz 85 w MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m na nową nazwę pliku wyjściowego. Uruchom skrypt MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m, aby obliczyć parametry relaksacji NPQ.</li>
</ol>

<ol><li>Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlankenship%2C+RE+%22Molecular+Mechanisms+of+Photosynthesis%22">Molecular Mechanisms of Photosynthesis</a>. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2021).</li>
<li>Murchie, E. H., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+photoprotection+to+improve+plant+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis.</a> Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).</li>
<li>Horton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+light+harvesting+and+photoprotection%3A+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).</li>
<li>Slattery, R. A., Ort, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthesis%3A+photosynthetic+efficiency+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Biological+Chemistry+III+%28Third+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement.</a> Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).</li>
<li>Zhu, X. -G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+reversibility+of+photosystem+II+thermal+energy+dissipation+on+transfer+from+high+to+low+light+may+cause+large+losses+in+carbon+gain+by+crop+canopies%3A+a+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis.</a> Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).</li>
<li>Kromdijk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+photosynthesis+and+crop+productivity+by+accelerating+recovery+from+photoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection.</a> Science. 354 (6314), 857-861 (2016).</li>
<li>Maxwell, K., Johnson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence-a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence-a practical guide.</a> Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).</li>
<li>Murchie, E. H., Lawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence+analysis%3A+a+guide+to+good+practice+and+understanding+some+new+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).</li>
<li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence%3A+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).</li>
<li>Bilger, W., Björkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+xanthophyll+cycle+in+photoprotection+elucidated+by+measurements+of+light-induced+absorbance+changes%2C+fluorescence+and+photosynthesis+in+leaves+of+Hedera+canariensis%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis.</a> Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).</li>
<li>Li, X. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pigment-binding+protein+essential+for+regulation+of+photosynthetic+light+harvesting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting.</a> Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).</li>
<li>Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHOTOPROTECTION+REVISITED%3A+genetic+and+molecular+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+and+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).</li>
<li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonphotochemical+Chlorophyll+fluorescence+quenching%3A+mechanism+and+effectiveness+in+protecting+plants+from+photodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage.</a> Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li>
<li>Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+intact+chloroplasts+and+algae.+Resolution+into+two+components%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).</li>
<li>Nilkens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+slowly+inducible+zeaxanthin-dependent+component+of+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+generated+under+steady-state+conditions+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).</li>
<li>Krause, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinhibition+of+photosynthesis.+An+evaluation+of+damaging+and+protective+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms.</a> Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).</li>
<li>Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin-like%2F%CE%B2-propeller+protein+maintains+the+efficiency+of+light+harvesting+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).</li>
<li>Demmig, B., Björkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effect+of+excessive+light+on+chlorophyll+fluorescence+%2877K%29+and+photon+yield+of+O2+evolution+in+leaves+of+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants.</a> Planta. 171 (2), 171-184 (1987).</li>
<li>Malnoë, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plastid+lipocalin+LCNP+is+required+for+sustained+photoprotective+energy+dissipation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).</li>
<li>Amstutz, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atypical+short-chain+dehydrogenase-reductase+functions+in+the+relaxation+of+photoprotective+qH+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis.</a> Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).</li>
<li>Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+a+slowly+reversible+fluorescence+decay+component+in+the+Arabidopsis+npq4+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221(2014).</li>
<li>Chekanov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-photochemical+quenching+in+the+cells+of+the+carotenogenic+chlorophyte+Haematococcus+lacustris+under+favorable+conditions+and+under+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).</li>
<li>Allorent, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+strategy+to+cope+with+high+light+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii.</a> The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).</li>
<li>Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+analysis+of+non-photochemical+chlorophyll+fluorescence+quenching+curves%3A+I.+Theoretical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).</li>
<li>Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+noninvasive+screening+for+perturbations+of+metabolism+and+plant+growth+using+chlorophyll+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging.</a> Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).</li>
<li>Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+imaging+of+chlorophyll+fluorescence+using+modulated+light%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light.</a> Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).</li>
<li>Kuhlgert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultispeQ+Beta%3A+a+tool+for+large-scale+plant+phenotyping+connected+to+the+open+PhotosynQ+network%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network.</a> Royal Society Open Science. 3 (10), 160592(2016).</li>
<li>Cruz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+environmental+photosynthetic+imaging+reveals+emergent+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes.</a> Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).</li>
<li>McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+procedure+utilising+chlorophyll+fluorescence+imaging+to+phenotype+dynamic+photosynthesis+and+photoprotection+in+leaves+under+controlled+gaseous+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions.</a> Plant Methods. 15 (1), 109(2019).</li>
<li>Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+non-invasive+procedure+for+quantitative+assessment+of+drought+survival+using+chlorophyll+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence.</a> Plant Methods. 4 (1), 27(2008).</li>
<li>Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaf+and+plant+age+affects+photosynthetic+performance+and+photoprotective+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity.</a> Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).</li>
<li>Niyogi, K. K., Truong, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+flexible+non-photochemical+quenching+mechanisms+that+regulate+light+harvesting+in+oxygenic+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis.</a> Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).</li>
<li>Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+light+energy+distribution+upon+state+transitions%3A+an+in+vivo+photoacoustic+study+of+the+wild+type+and+photosynthesis+mutants+from+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).</li>
<li>Quick, W. P., Stitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+examination+of+factors+contributing+to+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+barley+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).</li>
<li>Horton, P., Hague, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+induction+of+chlorophyll+fluorescence+in+isolated+barley+protoplasts.+IV.+Resolution+of+non-photochemical+quenching%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów

Staranny wybór i obchodzenie się z dyskami liściowymi ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych pomiarów NPQ. Po pierwsze, uszkodzenie tkanki, takie jak nieostrożne obchodzenie się z pęsetą, wprowadzi stres, co spowoduje niskie wartości maksymalnej wydajności kwantowej fotosyntezy. Rośliny niezestresowane zazwyczaj mają wartości Fv/Fm wynoszące około 0,8318, przy czym znaczne spadki wskazują na zmniejszenie wydajności fotosyntezy9</s...

Fotosynteza składa się z absorpcji światła, pierwotnego transferu elektronów, stabilizacji energii oraz syntezy i transportu produktów fotosyntezy1. Zrozumienie każdego kroku ma kluczowe znaczenie dla ukierunkowania wysiłków na rzecz zwiększenia wydajności fotosyntezy upraw. Światło wpływa na tempo fotosyntezy, co wymaga zrównoważenia podaży energii w postaci fotonów z zapotrzebowaniem na redukujące równoważniki. Gdy podaż przewyższa popyt, na przykład przy silnym oświetleniu lub podczas zmniejszonego wiązania CO2 spowodowanego zamknięciem aparatów szparkowych, nagromadzenie mocy redukcyjnej zwiększa prawdopodobieństwo powstania reaktywnych form tlenu, które mogą uszkodzić aparat fotosyntetyczny i zakłócić transport elektronów. Dlatego, aby zapobiec uszkodzeniom, rośliny rozwinęły kilka mechanizmów fotoochronnych, w tym detoksykację reaktywnych form tlenu i niefotochemiczne wygaszanie wzbudzonych stanów chlorofilu (NPQ)2.
Utrzymanie wysokiego tempa fotosyntezy jest wyzwaniem w środowisku polowym. Zmiany sezonowe i dobowe, wraz z fluktuacjami środowiskowymi, takimi jak ruchy liści wywołane wiatrem i przejściowe zachmurzenie, powodują zmiany w ilości i intensywności światła odbieranego przez rośliny do fotosyntezy3. NPQ rozprasza nadmiar energii świetlnej i może pomóc w zapobieganiu uszkodzeniom fotologicznym, jednocześnie pozwalając na utrzymanie tempa fotosyntezy przy high-light4. Jednak przedłużone NPQ podczas przechodzenia między silnym a słabym oświetleniem nadal rozprasza energię, która mogłaby być wykorzystana do redukcji emisji dwutlenku węgla5. W rezultacie, przyspieszenie relaksacji NPQ może zwiększyć wydajność fotosyntezy6, co sprawia, że relaksacja NPQ staje się atrakcyjnym celem dla poprawy upraw.
Analiza fluorescencji chlorofilu (PAM) z modulacją amplitudy impulsów może być użyta do obliczenia NPQ na podstawie mierzalnych parametrów (Tabela Uzupełniająca 1 i Tabela Uzupełniająca 2)7,8,9. Niniejszy artykuł koncentruje się na określeniu współczynników relaksacji NPQ w roślinach uprawianych na polu w celu badania przesiewowego naturalnej zmienności plazmy zarodkowej. Jednak analiza fluorometrii chlorofilu PAM może być również wykorzystywana do wielu różnych celów, stosowana do gatunków od glonów po rośliny wyższe, i jest recenzowana gdzie indziej7,8,9.
W liściu lub komórce przystosowanej do ciemności, centra reakcji fotosystemu II (PSII) są otwarte na odbiór elektronów i nie ma NPQ. Włączenie światła pomiarowego o niskim natężeniu wywołuje fluorescencję chlorofilu, unikając jednocześnie transportu elektronów przez PSII. Zarejestrowana minimalna fluorescencja w tym stanie przystosowanym do ciemności jest opisana przez parametr Fo. Zastosowanie impulsu świetlnego o dużej intensywności do przystosowanego do ciemności liścia może szybko zmniejszyć pierwszą stabilną pulę akceptorów elektronów chinonów związanych z miejscem chinonu A. To tymczasowo blokuje zdolność przenoszenia elektronów w centrach reakcji PSII, o których mówi się, że są zamknięte i niezdolne do odbierania elektronów z rozszczepienia wody. Używając krótkiego czasu trwania impulsu, nie ma wystarczająco dużo czasu na stymulację NPQ. Uzyskana fluorescencja chlorofilu jest równoważna maksymalnej wartości możliwej do uzyskania przy braku NPQ, czyli maksymalnej fluorescencji, Fm. Różnica między minimalną i maksymalną fluorescencją jest określana jako fluorescencja zmienna, Fv. Maksymalną fotochemiczną wydajność kwantową fotosystemu II (FV/FM) oblicza się na podstawie tych dwóch parametrów za pomocą następującego równania:
Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm
To może dostarczyć ważnego wskaźnika funkcji fotosystemu i stresu. Włączenie światła aktynicznego (fotosyntetycznego) stymuluje wygaszanie niefotochemiczne, a późniejsze zastosowanie nasycającego błysku pozwala na pomiar maksymalnej fluorescencji dostosowanej do światła, Fm'. Porównując różnicę między maksymalną fluorescencją przystosowaną do ciemności i światła, NPQ można obliczyć zgodnie z równaniem Sterna-Volmera10:
NPQ = Fm/Fm' - 1
W wyższych zakładach NPQ zostało opisane jako składające się z co najmniej pięciu różnych składników, w tym qE, qT, qZ, qI i qH. Dokładne mechanizmy związane z NPQ nie są w pełni poznane; jednak qE jest uważany za główny składnik NPQ w większości roślin. Stwierdzono, że kluczowymi czynnikami dla pełnego zaangażowania qE są nagromadzenie gradientu protonów w poprzek błony tylakoidowej, aktywność podjednostki fotosystemu II S11,12 oraz odepsydowane ksantofile, antheraksantyna, luteina, a w szczególności zeaksantyna13. qE rozluźnia najszybciej ze wszystkich składowych NPQ (< 2 min)14, a odwracalna aktywacja qE jest zatem szczególnie ważna dla adaptacji do zmieniających się natężeń światła. Druga, wolniejsza faza relaksacji NPQ (~2-30 min) obejmuje zarówno qT, związaną z przejściami stanów, jak i qZ, polegającą na wzajemnej konwersji zeaksantyny do violaxanthin15. Powolne rozluźnianie (> 30 min) NPQ może obejmować zarówno wygaszanie fotoinhibitorów (qI)16, jak i procesy niezależne od fotouszkodzeń17,18, takie jak qH, które jest ciągłym wygaszaniem w obwodowych czułkach PSII, w którym pośredniczy białko lipokaliny plastydowej19,20.
NPQ wzrasta podczas ekspozycji na silne światło. Późniejsze przejście do słabego oświetlenia może spowodować obniżenie NPQ. Zanik szybkich, pośrednich i powolnych faz relaksu można uchwycić w parametrach funkcji dwuwykładniczej15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
Teoretyczne podstawy funkcji dwuwykładniczej opierają się na założeniu wykorzystania pierwszego rzędu hipotetycznych czynników gaszących, w tym qE (Aq1), połączonej relaksacji qZ i qT (Aq2), z odpowiednimi stałymi czasowymi τq1 i τq2, oraz długoterminowego NPQ, który obejmuje qI i niezależne procesy fotouszkodzeń (Aq3). W związku z tym funkcja dwuwykładnicza zapewnia bardziej realistyczną reprezentację wielu połączonych procesów biologicznych zaangażowanych w wygaszanie fluorescencji chlorofilu w porównaniu z prostszym równaniem Hilla, które nie ma podstaw teoretycznych24.
NPQ można mierzyć za pomocą różnych dostępnych na rynku fluorometrów PAM25,26, od prostych urządzeń przenośnych27 do bardziej zaawansowanych systemów zamkniętych28. Jednak ograniczeniem niektórych z tych podejść jest stosunkowo niska przepustowość, co sprawia, że badanie przesiewowe dużych kolekcji roślin jest trudne bez wielu urządzeń i zespołu badaczy. Aby rozwiązać ten problem, McAusland i in. opracowali procedurę opartą na wyciętej tkance liści i wykorzystali ją do zidentyfikowania różnic we fluorescencji chlorofilu między dwiema odmianami pszenicy29. Atrakcyjność tego podejścia polega na tym, że obrazowanie dysków liściowych, pobranych z wielu roślin za pomocą jednego urządzenia, może ułatwić badanie przesiewowe setek genotypów w ciągu jednego dnia. Umożliwia to ocenę zmienności relaksacji NPQ w ramach badań asocjacyjnych całego genomu lub w celu przeprowadzenia badań przesiewowych populacji hodowlanych, które mogą zwiększyć wydajność fotosyntezy upraw i ostatecznie plon.
Opierając się na wynikach McAusland et al.29, używamy analizy fluorescencji chlorofilu PAM dysków liściowych do wysokoprzepustowego badania przesiewowego wskaźników relaksacji NPQ w Glycine max (G. max; soja). Protokół ten wykorzystuje klasę CF Imager<sup="xref">25, która jest porównywalna z innymi dostępnymi na rynku systemami zamkniętymi PAM, takimi jak popularny FluorCam26. Dzięki ciemnemu pomieszczeniu do adaptacji próbek, użytkownicy mogą obrazować 96-dołkowe płytki, szalki Petriego i małe rośliny. Kluczową zaletą tego podejścia jest wzrost przepustowości zapewnianej przez zastosowanie dysków liściowych w porównaniu z sekwencyjną analizą pojedynczych roślin. W niniejszym artykule przedstawiono reprezentatywne wyniki oraz metodę pobierania próbek, pomiarów i analiz NPQ w roślinach uprawianych na polu.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Fisher Scientific FB012929</td><td></td><td>Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012931</td><td>Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone</td></tr><tr><td>Ameryki Folia aluminiowa</td><td>Antylia Scientific</td><td>&nbsp; 61018-56</td><td>Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki</td></tr><tr><td>marker</td><td>Sharpie</td><td>SAN30001</td><td>Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki</td></tr><tr><td>CF imager</td><td>Technologica Ltd.</td><td>Nie dotyczy</td><td>fluorescencji chlorofilu Kraj pochodzenia: Wielka Brytania</td></tr><tr><td>Borowiec, 7mm</td><td>Humboldt Mfg Co</td><td>H9665</td><td>Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki</td></tr><tr><td>FluorImager V2.305 Software</td><td>Technologica Ltd.</td><td>Nie dotyczy</td><td>oprogramowania do obrazowania Kraj pochodzenia: Wielka Brytania</td></tr><tr><td>iHank-Nose 100-pak wysokiej jakości filtrów higienicznych do aspiratora do nosa</td><td>Amazon</td><td>&nbsp; B07P6XCTGV</td><td>Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki</td></tr><tr><td>Znaczniki</td> John <td>Henry Company</td><td>KN0151</td><td>Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki</td></tr><tr><td>Nożyczki do papieru</td><td>VWR</td><td>82027-596</td><td>Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis Company Inc.</td><td>&nbsp; S3-594-6</td><td>Półprzezroczysta elastyczna folia Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone</td></tr><tr><td>Ameryki Korki z litej gumy</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-130M</td><td>Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa analiza niefotochemicznego hartowania w uprawach przy użyciu fluorometrii chlorofilu z modulacją amplitudy impulsów

High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry

Fotosynteza nie jest zoptymalizowana w nowoczesnych odmianach roślin uprawnych, dlatego daje możliwość poprawy. Przyspieszenie rozluźnienia niefotochemicznego wygaszania (NPQ) okazało się skuteczną strategią zwiększania wydajności fotosyntezy. Jednak potencjał hodowlany w celu poprawy NPQ i pełnego zrozumienia genetycznych podstaw rozluźnienia NPQ jest niewystarczający ze względu na ograniczenia związane z nadmiernym próbkowaniem i gromadzeniem danych z roślin uprawianych na polu. Opierając się na poprzednich raportach, przedstawiamy wysokoprzepustowy test do analizy współczynników relaksacji NPQ w Glycine max (soja) przy użyciu fluorometrii chlorofilu z modulacją amplitudy impulsów (PAM). Próbki krążków liściowych z nasion soi uprawianych na polu są pobierane przed transportem do laboratorium, gdzie relaksacja NPQ jest mierzona w zamkniętym fluorometrze PAM. Parametry relaksacji NPQ są obliczane poprzez dopasowanie funkcji dwuwykładniczej do zmierzonych wartości NPQ po przejściu od wysokiego do słabego oświetlenia. Za pomocą tej metody możliwe jest przetestowanie setek genotypów w ciągu jednego dnia. Procedura ta ma potencjał do badań przesiewowych paneli mutantów i różnorodności pod kątem zmienności relaksacji NPQ, a zatem może być stosowana zarówno do podstawowych, jak i stosowanych pytań badawczych.

Rysunek 1A przedstawia typowy pomiar NPQ u soi uprawianej w warunkach polowych. Rośliny hodowano w Urbana, IL (szerokość geograficzna 40,084604°, długość geograficzna -88,227952°) latem 2021 roku, a nasiona wysiano 5 czerwca 2021 roku. Próbki krążków liściowych pobrano 30 dni po wysiewaniu nasion, a pomiary wykonano zgodnie z załączonym protokołem (Tabela 1). Wartości Fv/Fm oraz NPQ obliczono dla każdego krążka liściowego (Tabela uzupełniająca 4</st...

Protokół wprowadza wysokoprzepustową metodę pomiaru relaksacji niefotochemicznego wygaszania za pomocą modulowanej amplitudą impulsów fluorometrii chlorofilu. Metodę tę stosuje się do Glycine max uprawianej na polu i można ją dostosować do innych gatunków w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem różnorodności genetycznej lub populacji hodowlanych.

Wysokoprzepustowa analiza niefotochemicznego hartowania w uprawach przy użyciu fluorometrii chlorofilu z modulacją amplitudy impulsów

Photosynthesis is not optimized in modern crop varieties, and therefore provides an opportunity for improvement. Speeding up the relaxation of ...

Metoda ta może zapewnić wgląd w zmienność genetyczną w niefotochemicznym hartowaniu dostępnym w panelach różnorodności genetycznej lub populacjach hodowlanych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania przesiewowego dużej liczby genotypów pod kątem zmienności w niefotochemicznym hartowaniu w ciągu jednego dnia. Protokół jest przedstawiony dla glicyny max lub soi, ale może być dostosowany do analizy innych przestrzeni roślinnych, z których można pobrać talerze podnoszące.Dla kogoś, kto wykonuje protokół po raz pierwszy, kluczowe jest obchodzenie się z tarczą podnoszącą, aby zapobiec uszkodzeniu lub przesyceniu gąbek wodą. Na początek pobierz próbki roślin na polu 30 dni po wykiełkowaniu. Napełnij 1/3 poziomu wody destylowanej we wszystkich studzienkach 24-dołkowej płytki.Na wieczku i boku płytki należy oznaczyć kontrpróby, z których należy pobrać próbki. Przytrzymaj najmłodszy, w pełni rozwinięty liść znajdujący się na szczycie rośliny przy gumowym korku. Wciśnij świdrowiec korkowy Humboldta numer dwa przez liść i przekręć, aby przeciąć krążek, omijając środkowe żebro.Kolejno zbierz pięć krążków z tego samego liścia w celu uzyskania replik technicznych. Wypchnij krążki liściowe z omacnicy korkowej do pojedynczego dołka na 24-dołkowej płytce za pomocą bawełnianego wacika i powtórz to dla innej rośliny o tym samym genotypie. Sprawdź, czy wszystkie krążki liściowe unoszą się w wodzie.Jeśli nie, delikatnie przesuń krążki liściowe przyklejone do boku studni do pozycji pływającej za pomocą bawełnianego wacika. Przejdź do dysków z próbkowaniem z poniższego wykresu. Umieść pokrywkę i uszczelnij półprzezroczystą elastyczną folią.po zakończeniu pobierania próbek na całej płytce 24-dołkowej. Przechowuj talerz z dala od bezpośredniego światła słonecznego w torbie, pudełku lub pustej lodówce. W czystej przestrzeni laboratoryjnej postukaj w pokrywę zapieczętowanej płytki, aby usunąć krążki liściowe przyklejone do pokrywy podczas transportu.Rozwiń folię i zdejmij pokrywkę. Przenieść krążek liściowy z pierwszego położenia płytki 24-dołkowej na świeżą płytkę 96-dołkową z krążkiem liściowym skierowanym płasko w dół na dnie studzienki. Przetnij filtr aspiratora do nosa na pół.Zanurz powstały filtr do połowy w wodzie i przetrzyj ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Włóż filtr do studzienki z tarczą liściową, aby utrzymać wilgotność. Wziąć drugi krążek liściowy z pierwszej pozycji płytki 24-dołkowej i umieścić go stroną zadrukowaną do dołu w następnej dostępnej pozycji płytki 96-dołkowej.Zanurz pozostałą połowę wytworzonego filtra nosowego w wodzie i przetrzyj go ręcznikiem papierowym przed włożeniem go do studzienki z drugim krążkiem liściowym. Przyklej taśmą prawy górny róg, aby ułatwić orientację płytki w ciemności w celu obrazowania. Uszczelnij płyty półprzezroczystą elastyczną folią i zawiń płytę w folię aluminiową.Napisz numery działek i identyfikatory tabliczki na folii aluminiowej. Umieść płytki w ciemnym pudełku lub szafce na co najmniej 30 minut, aby rozluźnić pierwsze dwie fazy hartowania niefotochemicznego. Stosować przedłużony okres inkubacji w ciemności, wynoszący jedną godzinę przed obrazowaniem, jeśli interesujące są długoterminowe fazy hartowania niefotochemicznego.Przygotować dodatkową atrapę płytki do ogniskowania podczas analizy, umieszczając krążek liściowy w każdym rogu świeżej płytki 96-dołkowej i jeden pośrodku. Zabezpiecz krążki liściowe filtrami do nosa, tak jak w przypadku poprzednich płytek, uszczelnij płytkę i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej i wilgotności względnej 50%. Włącz imager i otwórz oprogramowanie do obrazowania.Kliknij Ustawienia, a następnie Protokół, aby otworzyć okno do wprowadzania kroków w eksperymentalnym protokole PAM. Ustaw specyfikację techniczną maszyny podaną w rękopisie. Ustaw program tak, aby rozpoczynał się od impulsu nasycającego, aby zmierzyć maksymalną wydajność kwantową fotosyntezy przystosowanej do ciemności, wprowadzając 20 sekund w polu o nazwie Po opóźnieniu.Kliknij pole Zastosuj impuls i wprowadź 1 w polu zatytułowanym Tyle razy. Ustaw impuls PPFD na 6, 152, długość impulsu na 800 milisekund i zaznacz pole Wykonaj zdjęcia F prime i FM prime ze wszystkimi impulsami. Zaznacz opcję Wstaw po, aby dodać drugi krok do protokołu.Wprowadź 30 sekund w polu zatytułowanym Po opóźnieniu. Następnie należy wybrać opcję Zmień aktynikę i w polu zatytułowanym Actinic PPFD wprowadzić wartość 50, aby ustawić natężenie światła w komorze na 50 PPFD. Kliknij Wstaw po, aby dodać nowy krok do protokołu i wprowadź 150 sekund w polu zatytułowanym Po opóźnieniu.Wybierz opcję Zastosuj impuls i wprowadź 4 w polu zatytułowanym Ta liczba razy, aby zastosować impulsy pomiarowe co 150 sekund cztery razy z rzędu, gdy światło aktyniczne jest utrzymywane na poziomie 50 PPFD. Dostosuj opóźnienie i natężenie światła dla każdego kroku zgodnie z wartościami podanymi w manuskrypcie przed zapisaniem protokołu jako pliku pcl w żądanej lokalizacji. Wyłącz światło i umieść atrapę płytki ekranem do dołu na stoliku na próbkę, tak aby powierzchnia adaksjalna liścia była skierowana w górę w kierunku detektora, a gąbka była skierowana w dół w kierunku platformy.Ustaw wysokość stolika próbki tak, aby tarcze liściowe znajdowały się 140 milimetrów nad podstawą urządzenia. Kliknij ikonę połącz/rozłącz z kamerą imager i kamerą sprzętową, aby uruchomić kamerę. Kliknij symbol fluorescencji ostrości, reprezentowany przez czerwoną, dwustronną ikonę strzałki z dwiema zielonymi liniami u podstawy, a następnie dostosuj obiektyw i ekspozycję, aby ustawić ostrość na płycie.Kliknij ponownie ikonę fluorescencji ostrości, aby wyłączyć światło. Pracując w ciemności, zastąp atrapę płytki płytką do analizy. Umieść go ekranem do dołu z taśmą na zewnątrz używaną do orientacji w prawym górnym rogu i kliknij ikonę kamery obrazu mapy.Dostosuj ekspozycję obrazu, otwierając lub zamykając przysłonę, aż pasek w wyskakującym okienku znajdzie się w zielonej strefie. Klikaj przycisk Spróbuj ponownie po każdej regulacji przysłony, aż ekspozycja zostanie prawidłowo wyregulowana, a instrument wykona zdjęcie. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Zastosuj izolację obrazu, aby zablokować sygnały tła.Skoncentrowany obszar liścia będzie wyświetlany w kolorze szarym, a tło w kolorze niebieskim. Wybierz obszar lub piksele, które mają obejmować tylko dyski liści, dostosowując histogram i poziom gamma z menu rozwijanego Modyfikuj obraz, klikając obraz prawym przyciskiem myszy. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz Usuń wysokie i niskie cięcia, aby usunąć jasnoniebieskie podświetlone obszary.Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz Usuń zabłąkane, aby usunąć wszystkie piksele, które nie dotykają ostatnich trzech pozostałych pikseli. Wszystkie obszary na obrazie, które pojawiają się jako izolowane wyspy, zostaną przeanalizowane oddzielnie i uwzględnione w końcowych danych wyjściowych. Kliknij ikonę uruchamiania protokołu, aby uruchomić program.U dołu ekranu pojawi się licznik czasu informujący o tym, ile czasu pozostało do działania protokołu. Poczekaj, aż protokół zostanie zakończony. Kliknij Plik i Zapisz jako, aby zapisać dane jako plik igr.Zamknij okno, klikając czerwony krzyżyk w prawym górnym rogu okna przed rozpoczęciem kolejnej płytki próbki. Aby wyeksportować dane fluorescencji chlorofilu, otwórz plik igr w oprogramowaniu do obrazowania i kliknij Plik, a następnie Eksportuj do folderu, aby utworzyć nowy folder ze wszystkimi niezbędnymi plikami. Typowy pomiar niefotochemicznego hartowania w soi uprawianej na polu wykazał, że po początkowym błysku nasycenia w celu określenia Fv/Fm, gdy krążki liści były wystawione na działanie słabego światła 50 mikromoli na metr na sekundę, niefotochemiczne hartowanie było mniejsze niż jeden.Co więcej, po przeniesieniu do wysokiego oświetlenia wynoszącego 2 000 mikromoli na metr na sekundę, niefotochemiczne wygaszanie wzrastało do maksymalnej wartości czterech po 15 minutach. Nieudany pomiar wykazał minimalny wzrost niefotochemicznego wygaszania po przeniesieniu do wysokiego światła. Orientacja płytek w imagerze oraz jasno zdefiniowany plan pobierania próbek i posiewu krążków liściowych są niezbędne do zapewnienia, że dane są powiązane z prawidłowym genotypem.Protokół ten może określić ilościowo wpływ zmiennych środowiskowych, takich jak susza i linienie, na hartowanie niefotochemiczne lub ocenić hartowanie niefotochemiczne na różnych poziomach koron drzew w celu udoskonalenia modeli upraw.

high-throughput-analysis-non-photochemical-quenching-crops-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Celem tej procedury jest wykazanie powtarzalności i zdolności adaptacyjnych stosowania formatu płytki do mikroglonów do badań przesiewowych. Ten szybki ekran łączy fluorometrię WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) w celu pomiaru wydajności fotosyntezy jako wskaźnika zdrowia Photosystem II (PSII) z kokulturami bakterii i glonów o małej objętości.

Test biologiczny o małej objętości do oceny wspólnej hodowli bakterii i fitoplanktonu przy użyciu fluorometrii z modulacją amplitudy WATER-Pulse-Amplitude (WATER-PAM)

Tutaj prezentujemy protokół do badania zachowań związanych ze wzrostem roślin, a zwłaszcza fenotypów w powtarzalny sposób. Pokazujemy, jak zapewnić zmienne, a jednocześnie stabilne warunki oświetleniowe. Prawidłowe analizy zależą od wystarczającej liczby prób i prawidłowych ocen statystycznych.

Analiza zachowania wzrostu Arabidopsis thaliana w różnych jakościach światła

Opisujemy nowe techniczne podejście do badania reakcji fotosyntezy u wyższych roślin, obejmujące jednoczesne pomiary fluorescencji chlorofilu a i reflektancji liści za pomocą PAM i radiometru spektralnego do wykrywania sygnałów z tego samego obszaru liści u Arabidopsis.

Ocena zachowań fotosyntetycznych poprzez jednoczesne pomiary współczynnika odbicia liści i analizy fluorescencji chlorofilu

Opisujemy podejście do pomiaru zmian w wydajności fotosyntezy w roślinach po traktowaniu niskim poziomemCO2 za pomocą fluorescencji chlorofilu.

Ocena efektywności fotosyntezy w mutantach fotooddechowych za pomocą analizy fluorescencji chlorofilu

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

Niniejszy manuskrypt opisuje niedestrukcyjne, wysokoprzepustowe podejście do autonomicznych pomiarów terenowych o wydajności kwantowej fotosystemu II, odbiciu spektralnym oraz architekturze roślin, umożliwiając wielkoskalowe fenotypowanie fotosyntezy korony w próbach polowych agronomicznych i hodowlanych.

Wysokoprzepustowe, terenowe badania wydajności fotosyntetycznej roślin uprawnych z wykorzystaniem autonomicznego robota

Zespoły genomowe oparte na technologiach masowego równoległego sekwencjonowania DNA są zazwyczaj silnie pofragmentowane. Opracowanie fizycznych map chromosomowych może potencjalnie usprawnić składanie genomów. W niniejszej pracy prezentujemy innowacyjne podejścia do przygotowania chromosomów, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz obrazowania, które znacząco zwiększają wydajność tworzenia map fizycznych.

Wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów z wykorzystaniem zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ

Wysokoprzepustowa selektywna acylacja hydroksylowa 2' analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) wykorzystuje nowatorską technologię sondowania chemicznego, odwrotną transkrypcję, elektroforezę kapilarną i oprogramowanie do przewidywania struktury drugorzędowej do określenia struktur RNA od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2+ jest bardzo ważna w fizjologii plemników, a barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+ stanowią wszechstronne narzędzie do ich badania. Eksperymenty populacyjne (fluorometria i fluorometria zatrzymanego przepływu) oraz eksperymenty z pojedynczymi komórkami (cytometria przepływowa i obrazowanie pojedynczych komórek) są wykorzystywane do śledzenia zmian czasoprzestrzennych [Ca2+] w plemnikach ludzkich.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Metoda "cut-open Vaseline gap" służy do uzyskiwania niskoszumowych zapisów prądów jonowych i bramkujących z zależnych od napięcia kanałów jonowych wyrażonych w oocytach Xenopus z wysoką rozdzielczością kinetyki szybkich kanałów. Przy niewielkich modyfikacjach fluorometria cęgów napięciowych może być sprzężona z protokołem rozcięcia oocytów.

Technika zacisku napięciowego z otwartą szczeliną wazelinową Xenopus z fluorometrią

Poznaj metodę wysokoprzepustowej analizy niefotochemicznego hartowania w uprawach Glycine max przy użyciu fluorometrii PAM. Technika umożliwia szybkie badanie zróżnicowania genetycznego w ciągu jednego dnia.

Wysokoprzepustowa analiza niefotochemicznego hartowania w uprawach przy użyciu fluorometrii chlorofilu z modulacją amplitudy impulsów (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowa analiza niefotochemicznego hartowania w uprawach przy użyciu fluorometrii chlorofilu z modulacją amplitudy impulsów

Przeglądaj więcej filmów