Name: Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj skalowalną metodę izolacji i identyfikacji nicieni Caenorhabditis w środowisku naturalnym przy użyciu aplikacji mobilnej Fulcrum oraz chmurowych baz danych. To podejście usprawnia badania ekologiczne i molekularne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez fundusze start-up z Northwestern University oraz National Science Foundation CAREER Award (IOS-1751035), obie przyznane E.C.A.

<ol><li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Sivasundar, A., Hey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+from+natural+populations+with+RNAI+reveals+high+outcrossing+and+population+structure+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Sampling from natural populations with RNAI reveals high outcrossing and population structure in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology: CB. 15 (17), 1598-1602 (2005).</li>
<li>Kiontke, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogeny+and+molecular+barcodes+for+Caenorhabditis%2C+with+numerous+new+species+from+rotting+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits.</a> BMC Evolutionary Biology. 11, 339(2011).</li>
<li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+life+in+compost%3A+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li>
<li>Richaud, A., Zhang, G., Lee, D., Lee, J., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+coexistence+pattern+of+selfing+genotypes+in+Caenorhabditis+elegans+natural+metapopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The local coexistence pattern of selfing genotypes in Caenorhabditis elegans natural metapopulations.</a> Genetics. 208 (2), 807-821 (2018).</li>
<li>Ferrari, C., Salle, R., Callemeyn-Torre, N., Jovelin, R., Cutter, A. D., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephemeral-habitat+colonization+and+neotropical+species+richness+of+Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ephemeral-habitat colonization and neotropical species richness of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 17 (1), 43(2017).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sampling+of+Hawaiian+Caenorhabditis+elegans+reveals+high+genetic+diversity+and+admixture+with+global+populations%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations.</a> eLife. 8, 50465(2019).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Noble, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selfing+is+the+safest+sex+for+Caenorhabditis+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Selfing is the safest sex for Caenorhabditis tropicalis.</a> eLife. 10, 62587(2021).</li>
<li>Cutter, A. D., Morran, L. T., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Males%2C+Outcrossing%2C+and+Sexual+Selection+in+Caenorhabditis+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Males, Outcrossing, and Sexual Selection in Caenorhabditis Nematodes.</a> Genetics. 213 (1), 27-57 (2019).</li>
<li>Petersen, C., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+we+need+more+ecology+for+genetic+models+such+as+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Why we need more ecology for genetic models such as C. elegans.</a> Trends in Genetics: TIG. 31 (3), 120-127 (2015).</li>
<li>Haber, M., Schüngel, M., Putz, A., Müller, S., Hasert, B., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites%3A+evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2005).</li>
<li>Barrière, A., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+C.+elegans+and+Related+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Isolation of C. elegans and Related Nematodes.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19764/ (2018).</li>
<li>Poullet, N., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+and+isolation+of+C.+elegans+from+the+natural+habitat%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sampling and isolation of C. elegans from the natural habitat.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, 221-229 (2015).</li>
<li>Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((easyFulcrum%3A+An+R+package+to+process+and+analyze+ecological+sampling+data+generated+using+the+Fulcrum+mobile+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application.</a> PloS one. 16 (10), 0254293(2021).</li>
<li>Mobile data collection & workflow automation in NCAP. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/">https://www.fulcrumapp.com/</a> (2021).</li>
<li>Nematode Isolation Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation</a> (2021).</li>
<li>Nematode Field Sampling Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling</a> (2021).</li>
<li>JOVE wild_isolate-genotyping-template. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit">https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit</a> (2021).</li>
<li>Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch">https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch</a> (2021).</li>
<li>easyFulcrum. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html">http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</a> (2021).</li>
<li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+the+neuropeptide+receptor+npr-1+is+a+major+determinant+of+Caenorhabditis+elegans+growth+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in the neuropeptide receptor npr-1 is a major determinant of Caenorhabditis elegans growth and physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156(2014).</li>
<li>Tuli, M. A., Daul, A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Caenorhabditis+Nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Caenorhabditis Nomenclature.</a> WormBook. , (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Maintenance+of+C.+Elegant%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Maintenance of C. Elegant.</a> WormBook. , (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Ten protokół zawiera krytyczne kroki, które należy wykonywać z ostrożnością. Na przykład ważne jest, aby zespoły terenowe i izolacyjne starannie wybrały odpowiedni projekt pobierania w aplikacji przed pobraniem próbek z terenu lub wyizolowaniem nicieni z próbek w laboratorium. W przypadku wybrania niewłaściwego projektu windykacji, błędne rekordy danych najlepiej poprawić w bazie danych Fulcrum za pomocą narzędzi do edycji rekordów online. Ten proces może być żmudny w przypadku wielu zagubionych rekordów. Jednak baza danych zachowuje wszelkie zmiany w rekordach, dzięki czemu możliwa jest pełna inspekcja rekordów kolekcji i izolacji. Inne krytyczne etapy tego protokołu obejmują obchodzenie się z próbkami z terenu i nicieniami wyizolowanymi z tych próbek. Aby zapewnić przetrwanie nicieni Caenorhabditis na etapie pobierania próbek i transportu, temperatura próbek powinna być utrzymywana w zakresie od 4 °C do 25 °C. Temperatury powyżej 25 °C mogą powodować bezpłodność C. elegans14. Upewnij się, że próbki są przenoszone z worków do pobierania na płytki w ciągu pięciu dni, gdy tylko jest to możliwe, aby zminimalizować straty nicieni. Po wyizolowaniu nicieni bardzo ważne jest, aby zostały one zgenotypowane i kriokonserwowane, zanim zginą. Trudno jest znaleźć żywe nicienie na płytkach S, które mają więcej niż dwa do trzech tygodni, ponieważ zanieczyszczenie grzybami i bakteriami może sprawić, że płytki S staną się niegościnne.
Protokół ten można łatwo modyfikować, aby uwzględnić różne typy danych, które badacze mogą chcieć zbierać w terenie. Na przykład, łatwo jest dostosować aplikację "Próbkowanie pól nicieni" za pomocą nowych pól wprowadzania danych za pomocą internetowego interfejsu użytkownika Fulcrum do edycji aplikacji. Co więcej, pakiet do analizy danych, easyFulcrum, może dostosować się do tych zmian podczas przetwarzania nowych danych15. Inną modyfikacją, która może być atrakcyjna dla użytkowników, jest użycie innej metody pobierania próbek w terenie. Zamiast pobierać próbki z dyskretnych substratów, badacze mogą chcieć pobrać próbki z większych obszarów zawierających wiele typów substratów. Te większe próbki najlepiej przetwarzać w laboratorium przy użyciu metod ekstrakcji lejkowej lub tacowejBaermanna 13. Co ważne, stosowanie etykiet C i S nadal ma zastosowanie do tych technik i dlatego są one kompatybilne z aplikacjami mobilnymi.
Podstawowe ograniczenia tego protokołu dotyczą czasu postępowania z nicieniami przed izolacją w laboratorium. Po pierwsze, czas opóźnienia między pobraniem próbki a izolacją nicieni uniemożliwia zarejestrowanie etapów rozwojowych nicieni na danej próbce w momencie pobrania. Po drugie, częstotliwość występowania samców i krzyżowanie się w naturze są kluczowymi kwestiami ewolucyjnymi dla samodzielności nicieni Caenorhabditis 10. Ta metoda nie jest dobrze dopasowana do odpowiedzi na te pytania, ponieważ nicienie prawdopodobnie przeszły przez wiele pokoleń przed izolacją. Opóźniona izolacja oznacza, że bezpośrednie dowody na występowanie samców w przyrodzie są niemożliwe. Co więcej, wielopokoleniowe opóźnienie na etapach genotypowania oznacza, że genomowe dowody krzyżowania (heterozygotyczność) zostaną zerodowane, zanim będzie można zsekwencjonować szczep nicienia. Aby zidentyfikować heterozygotyczność w przyrodzie, do sekwencjonowania wykorzystuje się potomstwo wyprodukowane przez nicienie bezpośrednio odizolowane od natury2. Innym potencjalnym ograniczeniem tego protokołu jest to, że jest on stronniczy w kierunku identyfikacji samoistnego Caenorhabditis. Dzieje się tak, ponieważ izolowane nicienie gatunków samozaszczepiających mają większą szansę na rozmnażanie się niż obowiązkowe krzyżówki, które będą się rozmnażać tylko wtedy, gdy zapłodniona samica zostanie odizolowana.
Ta metoda zbierania opiera się na istniejących protokołach zbiórki13,14. Głównym osiągnięciem tej techniki jest wykorzystanie technologii mobilnej i dostosowanego oprogramowania w celu ułatwienia organizacji ogromnych ilości danych ekologicznych i molekularnych związanych z projektami gromadzenia na dużą skalę. Dane ekologiczne wygenerowane za pomocą tego protokołu gromadzenia mogą być wykorzystane do odpowiedzi na nierozstrzygnięte kwestie dotyczące naturalnych populacji gatunków Caenorhabditis. Na przykład dane wygenerowane tą metodą zostały wykorzystane do odkrycia niszowych preferencji dla tego gatunku na Wyspach Hawajskich. Co więcej, sekwencjonując genomy nicieni krioprezerwowanych, naukowcy mogą zbadać, w jaki sposób wzorce zmienności genetycznej są skorelowane z danymi ekologicznymi. Badania tego rodzaju mogą odkryć oznaki lokalnej adaptacji w populacjach Caenorhabditis i dostarczyć ważnych informacji na temat znaczenia zmienności genetycznej w kontekstach naturalnych8. Aby uzyskać funkcjonalne zrozumienie wielu genów nicieni Caenorhabditis, prawdopodobnie konieczne będą badania ekologiczne11. Nawet w przypadku C. elegans duża część genów nie ma funkcjonalnych adnotacji, mimo że jest to pierwsze zwierzę wielokomórkowe, które zostało zsekwencjonowane i jedno z najdokładniej przebadanych zwierząt na Ziemi. Niniejszy protokół zbierania został opracowany, aby pomóc wypełnić tę lukę w wiedzy poprzez ułatwienie zbierania dzikich nicieni Caenorhabditis oraz badania ich ekologii i naturalnej różnorodności genetycznej.

Ostatnie dwie dekady przyniosły wzrost zainteresowania ekologią nicieni Caenorhabditis. Z tych badań wiemy, że wolno żyjące gatunki Caenorhabditis mogą być izolowane z efemerycznych mikrosiedlisk zarówno w regionach umiarkowanych, jak i tropikalnych, gdzie żywią się zakwitami mikrobiologicznymi związanymi z rozkładającym się materiałem roślinnym, czasami w sympatrii1,2,3,4,5,6,7,8. Dowiedzieliśmy się również, że zbieżna ewolucja samozapłodnienia wystąpiła w rodzaju trzykrotnie, a samozapłodnienie jest dominującym sposobem rozmnażania C. briggsae, C. elegans i C. tropicalis9,10. Wśród tych osobników C. elegans jest jednym z najczęściej badanych zwierząt na Ziemi i został wykorzystany przez naukowców do dokonania krytycznych postępów w biologii. Co ważne, inne gatunki Caenorhabditis mają wiele wspólnych zalet eksperymentalnych C. elegans i szybko się naprzód w badaniach porównawczych nad tym rodzajem. Jednak tajemnicza natura tych nicieni żyjących na wolności utrudnia badanie ich ekologii i naturalnej różnorodności, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologicznych funkcji ich genów i sposobów, w jakie ewolucja ukształtowała różnorodność genetyczną wśród gatunków10,11.
Największym wyzwaniem dla badania ekologii nicieni Caenorhabditis na wolności jest ich mały rozmiar; dorosłe nicienie często mają 1 mm długości lub mniej. Wyzwanie to wymaga, aby naukowcy pobrali próbki substratów ze środowiska naturalnego i podjęli próbę oddzielenia interesujących nicieni od substratów w laboratorium bez możliwości obserwacji zwierząt na wolności. Ponieważ nawet wyszkoleni eksperci mają trudności z odróżnieniem nicieni Caenorhabditis od innych wolno żyjących nicieni pod mikroskopem, nicienie są zwykle usuwane z podłoża, izolowane i pozostawiane do namnażania się, zanim zostaną zidentyfikowane na podstawie tożsamości sekwencji przy użyciu ustalonych molekularnych kodów kreskowych3,12,13,14. Czas i wysiłek wymagany do przetworzenia każdego nicienia w ten sposób stanowi wyzwanie organizacyjne, ponieważ naukowcy muszą być w stanie prześledzić tożsamość każdego nicienia wyizolowanego w laboratorium z powrotem do dokładnego substratu i powiązanych danych ekologicznych pobranych w terenie. W tym miejscu opisujemy krok po kroku proces skutecznego zbierania i identyfikowania samozaszczepiających się nicieni Caenorhabditis w terenie i wiernego łączenia tych izolatów z powiązanymi z nimi danymi przestrzennymi i ekologicznymi na dużą skalę.
Ta metoda zbierania zwiększa skalę i dokładność badań ekologicznych dzięki wykorzystaniu mobilnych platform zbierania danych, baz danych w chmurze i środowiska oprogramowania R. Fulcrum to konfigurowalna platforma gromadzenia danych, która współpracuje z większością urządzeń mobilnych i umożliwia użytkownikom tworzenie niestandardowych aplikacji do gromadzenia i organizowania danych opartych na lokalizacji (https://www.fulcrumapp.com). Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z niestandardowych aplikacji do gromadzenia danych w celu organizowania przestrzennie wyraźnych danych ekologicznych z terenu i dokładnego powiązania tych danych z tożsamością nicieni wyizolowanych w laboratorium. Protokół wyjaśnia również, jak skutecznie identyfikować nicienie Caenorhabditis za pomocą ustalonych molekularnych kodów kreskowych. Dane z tych metod mogą być przetwarzane w prosty i powtarzalny sposób za pomocą dołączonego pakietu oprogramowania R easyFulcrum15 w celu zbadania ekologii i różnorodności genetycznej naturalnych populacji Caenorhabditis.

<table><tbody><tr><td>Etykiety samoprzylepne</td><td>Avery</td><td>61533</td><td>Drukowanie etykiet C i etykiet</td></tr><tr><td>S Agarose</td><td>Thomas Scientific</td><td>C748D75</td><td>przygotowanie żelu agarozowego</td></tr><tr><td>Plecak</td><td></td><td></td><td>Plecak dla każdego członka zespołu do przechowywania sprzętu, próbek, jedzenia i wody na cały dzień.</td></tr><tr><td>Pudełka kartonowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS261</td><td>Przechowywanie płytek S</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Liza neamtody, SSU i ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Worki zbiorcze</td><td>Zip-lock</td><td>NA</td><td>Kolekcja podłoży</td></tr><tr><td>Cyfrowy miernik temperatury/wilgotności</td><td>Preciva</td><td>HT-86</td><td>Pomiar temperatury i wilgotności otoczenia</td></tr><tr><td>Luneta sekcyjna</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Izolacja nicieni, liza</td></tr><tr><td>Zbiorniki jednorazowego</td> użytku <td>USA Scientific</td><td>1306-1010</td><td>Porcjowanie głównych mieszanek PCR i ładowanie drabinki DNA barwnika</td></tr><tr><td>, 1 KB plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td>Wizualizacja produktów SSU i ITS2 PCR</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB4430-2</td><td>PCR master mix component</td></tr><tr><td>easyFulcrum R pakiet</td><td>NA</td><td>NA NA</td><td>Pakiet R do przetwarzania danych o pobieraniu http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</td></tr><tr><td>roztworu EDTA (0,5 M pH 8,0)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Patrz tabela uzupełniająca 3, aby zapoznać się z przepisem</td></tr><tr><td>Etanol (95%)</td><td>NA</td><td></td><td>NA Posiewanie próbek, sterylizacja łyżką</td></tr><tr><td>Roztwór bromku etydyny (10 mg/ml)</td><td>VWR</td><td>97064-602</td><td>Wizualizacja produktów</td></tr> <tr><td>PCR SSU i ITS2Zewnętrzna ładowarka do urządzeń mobilnych</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Zewnętrzna ładowarka i ładujący do iPhone'a lub Androida</td></tr><tr><td>Kolba (500 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB501500</td><td>preparat żelu agarozowego</td></tr><tr><td>Żywność</td><td>NA</td><td></td><td>NA Zapakuj odpowiednio</td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy żelowej</td><td>Thermo Scientific</td><td>B2</td><td>Wizualizacja produktów SSU i ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Żel Zasilacz do elektroforezy</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Wizualizacja produktów SSU i ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Barwnik w żelu, 6x</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td>Wizualizacja produktów do PCR SSU i ITS2</td></tr><tr><td>Zestaw starterów ITS2</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA1687 = starter do przodu CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC, oECA202 = starter odwrotny GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC</td></tr><tr><td>Starter sekwencjonowania ITS2</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA306 = starter do przodu CACTTTCAAGCAACCCGAC</td></tr><tr><td>Bufor do lizy</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Liza nicieni, patrz protokół dla przepisu</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>NA</td><td>NA</td><td>przygotowanie żelu agarozowego</td></tr><tr><td>Urządzenie mobilne</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Naładowany telefon w trybie samolotowym. Pozycje GPS w aplikacji Fulcrum są niedokładne w porównaniu z pozycjami GPS wyodrębnionymi ze zdjęć. To ustawienie zapewnia mniejsze zużycie energii i dokładniejsze pomiary GPS.</td></tr><tr><td>Płytki NGMA, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>C-plates, patrz Andersen et al. 2014 dla protokołu płytki NGMA.</td></tr><tr><td>Płytki NGMA, 3,5 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5662-7102Q</td><td>S-plates, patrz Andersen et al. 2014 dla protokołu płytki NGMA.</td></tr><tr><td>Bezdotykowy termometr na podczerwień</td><td>Etekcity</td><td>B00837ZGRY</td><td>Pomiar temperatury podłoża</td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Ręczniki papierowe do pochłaniania nadmiaru wilgoci w próbce zapakowanej w worki.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Folia samoprzylepna do PCR</td> do uszczelniania płytek <td>VWR</td><td>60941-126</td><td>Folia samoprzylepna do PCR</td></tr><tr><td>Bufor PCR (10x)</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB3702-7</td><td>Płytki PCR do PCR z mieszanką mieszaną (</td></tr><tr><td>96-dołkowa)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1149K04</td><td>Ołówek do PCR SSU i ITS2</td></tr><tr><td></td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Łyżki plastikowe</td><td>NA</td><td></td><td>NA Pobieranie próbek</td></tr><tr><td>Platynowy pick</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Izolacja nicieni, liza</td></tr><tr><td>Wstępnie oznakowane torby do zbierania strunowego</td><td>NA</td><td>NA Pakiety</td><td>plastikowych torebek z zamkiem błyskawicznym wstępnie oznaczone kodami kreskowymi C-label. Każda paczka powinna zawierać 25 torebek z kodami kreskowymi owiniętych gumką recepturki.</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma</td><td>3115879001</td><td>Liza nicieni, dodana do bufora do lizy tuż przed użyciem</td></tr><tr><td>Oprogramowanie R</td><td>NA</td><td></td><td>NA Oprogramowanie R: Język i środowisko do obliczeń statystycznych https://www.R-project.org/</td></tr> <tr><td>Miękka torba chłodząca i okład z lodu</td><td>Chłodziarki i wkłady chłodzące NA NA Collection, aby utrzymać próbki w chłodzie, gdy temperatura otoczenia przekracza 25 stopni Celsjusza.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zapasowe baterie</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Dodatkowe baterie do sprzętu do pobierania próbek</td></tr><tr><td>Zestaw starterów SSU</td><td>NA</td><td>NIE OECA1271 = starter do przodu TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = starter wsteczny CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA</td><td></td></tr><tr><td>Nasadki do probówek paskowych (12-dołkowe)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V29</td> Probówki paskowe do <td>lizy nicieni</td></tr><tr><td>(12-dołkowe)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V31</td><td>Liza nicieni</td></tr><tr><td>Bufor TAE (1x)</td> <td>NA</td><td>NA</td><td>Wizualizacja produktów PCR SSU i ITS2. Zobacz tabelę uzupełniającą 3, aby zapoznać się z przepisem</td></tr><tr><td>Polimeraza Taq</td><td>Thomas Scientific</td><td>C775Y45</td><td>Składnik mieszanki głównej PCR</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Liza neamtody, SSU i ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Woda</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Opakowanie odpowiednio</td></tr></tbody></table>

wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni caenorhabditis

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych organizmów modelowych w biologii, ale dopiero od niedawna badacze skupili się na jego naturalnej ekologii. Stosunkowo skąpe informacje na temat C. elegans w jego naturalnym kontekście wynikają z wyzwań związanych z identyfikacją małego nicienia w naturze. Pomimo tych wyzwań, rosnące skupienie się na ekologii C. elegans spowodowało bogactwo nowych informacji na temat jego życia poza laboratorium. Zintensyfikowane poszukiwania C. elegans w naturze przyczyniły się do odkrycia wielu nowych gatunków Caenorhabditis i ujawniły, że nicienie kongeneryczne często współżyją na wolności, gdzie żywią się zakwitami mikrobiologicznymi związanymi z gnijącym materiałem roślinnym. Identyfikacja nowych gatunków ujawniła również, że androdiopienny system godowy samców i samozapładniających się hermafrodytów wyewoluował trzy razy niezależnie w obrębie Caenorhabditis. Pozostałe dwa gatunki samozarodkowe, C. briggsae i C. tropicalis, dzielą eksperymentalne zalety C. elegans i umożliwiły badania porównawcze nad mechanistycznymi podstawami ważnych cech, w tym samozapłodnienia. Pomimo tych postępów wiele pozostaje do nauczenia się na temat ekologii i naturalnej różnorodności tych ważnych gatunków. Na przykład, wciąż brakuje nam informacji funkcjonalnych dla wielu ich genów, które można osiągnąć tylko poprzez zrozumienie ich naturalnej ekologii. Aby ułatwić badania ekologiczne nad samoistnymi nicieniami Caenorhabditis, opracowaliśmy wysoce skalowalną metodę zbierania nicieni ze środowiska naturalnego. Nasza metoda wykorzystuje mobilne platformy gromadzenia danych, bazy danych w chmurze i środowisko oprogramowania R, aby zwiększyć zdolność badaczy do zbierania nicieni z dzikiej przyrody, rejestrowania powiązanych danych ekologicznych i identyfikowania dzikich nicieni za pomocą molekularnych kodów kreskowych.

Niniejszy protokół był wykorzystywany do pobierania nicieni z rodzaju Caenorhabditis z wielu lokalizacji, w tym z Hawajów i Kalifornii. Skuteczność izolacji nicieni Caenorhabditis różni się w zależności od miejsca poboru, klimatu, doświadczenia w pobieraniu próbek oraz analizowanych rodzajów podłoża. Protokół ten służył do szeroko zakrojonego próbkowania na wyspach Hawajów, gdzie w ciągu wielu lat i pór roku przeprowadzono dziewięć projektów kolekcjonerskich. Skuteczność izolacji samozapylnych gatunków Caenorhabditis jest niemal identyczna dla C. briggsae (162 z 4 506 próbek, 3,6%) i C. elegans (163 z 4 506 próbek, 3,6%), a znacznie niższa dla C. tropicalis (26 z 4 506 próbek, 0,58%)8. Każdy z samozapylnych gatunków jest bardziej liczny w podłożach z gnijących owoców i kwiatów w porównaniu do innych kategorii podłoży. Należy pobierać próbki z gnijących owoców i kwiatów, jeśli badacz dąży do maksymalizacji skuteczności izolacji, a nie do charakterystyki preferencji podłoża. Należy jednak pamiętać, że skuteczność zależy od jakości wybranego podłoża. Na przykład wśród podłoży z owoców i kwiatów te, które są zbyt suche, mokre lub świeże, prawdopodobnie nie dostarczą nicieni Caenorhabditis.
Skalowalność tego protokołu pobierania jest widoczna w liczbie próbek, które pojedyncza para badaczy może zebrać z terenu. Przykładowo, w październiku 2018 roku para badaczy stosująca ten protokół była w stanie zebrać łącznie ponad 1 000 próbek w ciągu 7 dni z wielu lokalizacji na dwóch hawajskich wyspach. Zespół terenowy wysłał próbki nocnym transportem do laboratorium, gdzie zespół ośmiu badaczy izolował ponad 2 000 nicieni z próbek na bieżąco po ich otrzymaniu. Kluczową zaletą tego protokołu jest minimalizacja kosztów związanych z pobieraniem próbek w odległych lokalizacjach poprzez ograniczenie ilości sprzętu i personelu wymaganego w terenie. Dzięki zastosowaniu tego protokołu niewielki zespół terenowy może skupić się na pobieraniu próbek, podczas gdy zespół izolujący może przetwarzać je w swojej macierzystej instytucji, korzystając z delikatnego i ciężkiego sprzętu, takiego jak mikroskopy stereoskopowe i płytki agarowe do izolacji nicieni. Ponadto wdrożenie mobilnej aplikacji do zbierania danych pozwala na bezpośrednie powiązanie wszystkich danych terenowych związanych z próbkami z etykietą C, co umożliwia zespołowi izolującemu niezależną od zespołu terenowego pracę podczas przetwarzania próbek.
Badacze stosujący ten protokół pobierania próbek muszą wziąć pod uwagę nakład pracy wymagany do izolacji nicieni przed rozpoczęciem projektu kolekcjonerskiego. Etapy izolacji i identyfikacji są etapami ograniczającymi szybkość procesu, a niewielki zespół pobierający próbki może szybko przeciążyć osoby odpowiedzialne za izolację liczbą próbek. Co więcej, przestrzeń laboratoryjna niezbędna do przetworzenia wielu kolekcji może kolidować z prowadzonymi badaniami (Rysunek 3). Ponadto niektóre izolowane nicienie wymagają dodatkowego nakładu pracy w celu genotypowania. Na przykład około 2% izolatów nie ulega amplifikacji przy użyciu zestawu starterów SSU PCR po pierwszej próbie lizy i musi zostać poddanych ponownej lizie, aby upewnić się, że materiał po lizie nadaje się do amplifikacji z zestawem starterów ITS2 (Rysunek 8). Ponadto około 3% izolatów nie daje wysokiej jakości sekwencji po pierwszej rundzie sekwencjonowania metodą Sangera. W przypadku tych izolatów często wymagana jest kolejna runda lizy, PCR ITS2 oraz sekwencjonowania metodą Sangera, co może zwiększyć czas pracy zespołu izolacyjnego. Co ważne, sama tożsamość sekwencji nie jest wystarczającym dowodem do uzasadnienia uznania gatunku za nowy gatunek Caenorhabditis (Rysunek 7). Aby właściwie uzasadnić uznanie izolatu za nowy gatunek Caenorhabditis, należy podjąć dodatkowe starania w celu przeprowadzenia eksperymentów krzyżowych i ustanowienia okazu typowego13. Preferowany, choć nie jest wymagany, jest również formalny opis morfologiczny okazu typowego3. Wszystkie te rozważania sugerują, że badacze przyjmujący ten protokół pobierania próbek skorzystają z testów próbnych etapów izolacji i identyfikacji, aby upewnić się, że zasoby zostały właściwie przydzielone przed rozpoczęciem projektu kolekcjonerskiego. Co istotne, nawet niewielkie projekty kolekcjonerskie mogą odnieść korzyści z tego protokołu, ponieważ proces ten jest wysoce powtarzalny, a dane mogą być łatwo audytowane w celach kontroli jakości pomiędzy grupami laboratoryjnymi.
<img alt="Owoce, kwiaty, ściółka liściowa w badaniu ekosystemu leśnego, ukazujące różnorodne stadia rozkładu roślin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przykłady podłoża. (A) W centrum obrazu pokazano idealnie zgniły owoc (1), który jest niemal nierozpoznawalny. Obok widoczny jest owoc w mniejszym stopniu rozłożony; należy unikać pobierania próbek ze świeżo opadłych owoców (2). (B) Na górze pokazano idealnie rozłożony kwiat (3). Należy unikać pobierania próbek ze świeżo opadłych kwiatów (4). (C) Ciemna ściółka liściowa pod górną warstwą suchych liści jest idealna podczas pobierania próbek w poszukiwaniu samookreślających się nicieni Caenorhabditis (5). Należy unikać pobierania próbek z suchej ściółki liściowej (6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Aplikacja do pobierania próbek nicieni w terenie; projekt interfejsu do wprowadzania danych z rekordami i warunkami terenowymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Mobilna aplikacja Nematode Field Sampling. (A) Ekran początkowy po otwarciu aplikacji Nematode Field Sampling na urządzeniu Apple w programie Fulcrum. Czerwona strzałka w prawym dolnym rogu wskazuje przycisk + służący do tworzenia nowego rekordu pobierania. (B) Przykład nowego rekordu pobierania wyświetlonego na urządzeniu Apple. Czerwona strzałka wskazuje pole „Project” u góry ekranu rekordu pobierania. Podczas pobierania próbek w terenie należy upewnić się, że wybrano właściwy projekt. Pole projektu będzie domyślnie ustawione na ostatnio używany projekt podczas tworzenia kolejnych rekordów pobierania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Konfiguracja laboratoryjna z przechowywaniem próbek biologicznych, szalkami Petri do eksperymentu mikrobiologicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Worki do pobierania i płytki do pobierania zorganizowane przed wysiewaniem próbek.Na tym rysunku po lewej stronie widoczne są próbki w workach do pobierania oznaczonych literą C. Każdy worek do pobierania ma przypisaną odpowiadającą mu płytkę 10 cm również oznaczoną literą C, znajdującą się na górze. Po prawej stronie znajdują się płytki do pobierania 10 cm zawierające materiał z próbek po przeniesieniu go z worków do pobierania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Szalka Petri z próbką gleby do analizy mikrobiologicznej, ustawienie eksperymentu, badania laboratoryjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Płytka kolekcjonerska (płytka C) z prawidłowo przeniesioną próbką. 10 cm płytka C z rozkładającymi się owocami umieszczonymi na krawędzi trawnika bakteryjnego. Do pokrywki płytki przytwierdzona jest etykieta C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Interfejs aplikacji do izolacji nicieni, ekrany wprowadzania danych; rejestry próbkowania i proces wyboru projektu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Mobilna aplikacja do izolacji nicieni. (A) Ekran wyboru aplikacji w mobilnej aplikacji Fulcrum. Czerwona strzałka wskazuje aplikację Nematode Isolation. (B) Ekran początkowy po otwarciu aplikacji Nematode Isolation na urządzeniu Apple w systemie Fulcrum. Czerwona strzałka w prawym dolnym rogu wskazuje przycisk + służący do tworzenia nowego rekordu izolacji. (C) Przykład nowego rekordu izolacji wyświetlonego na urządzeniu Apple. Czerwona strzałka wskazuje pole „Project” na górze ekranu rekordu izolacji. Należy upewnić się, że podczas izolacji wybrano właściwy projekt. Pole projektu domyślnie będzie wskazywać ostatni użyty projekt przy tworzeniu kolejnych rekordów izolacji. (D) Po dotknięciu pola Select pod etykietą C, użytkownicy dotykają przycisku wyszukiwania (czerwona strzałka), aby znaleźć etykietę C, z której izolują nicienie. (E) Po wybraniu etykiety C, użytkownicy fotografują płytkę C za pomocą aparatu w urządzeniu. (F) Następnie użytkownicy wprowadzają informację, czy na płytce C znajdują się nicienie. Jeśli istnieją nicienie do wyizolowania, do rekordu izolacji dodawane są etykiety S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat wyników BLASTN; dopasowanie sekwencji DNA, szczegóły zapytania, parametry filtrowania, wyniki dopasowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Strona wyników NCBI BLAST. (1) Menu rozwijane służące do wyświetlania wyników BLAST dla wszystkich sekwencji. (2) Opis aktualnie wybranej sekwencji z menu rozwijanego. W tym przypadku pokazano wyniki dla etykiety S-05554. (3) Pokazano najlepsze dopasowanie BLAST dla S-05554. Fioletowy tekst wskazuje, że kliknięto łącze do wizualizacji tego dopasowania. Należy dokładnie sprawdzić dopasowania wzrokowo w celu zidentyfikowania potencjalnie nowych gatunków Caenorhabditis, patrz krok 9.8 powyżej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki dopasowania sekwencji DNA; schemat porównawczy; przegląd dopasowania genów; analiza podobieństwa sekwencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Przykłady wizualizacji dopasowania NCBI BLAST. (A) Przykład sekwencji zapytania ITS2 izolatu dopasowanej do sekwencji obiektu C. kamaaina. (1) Procent tożsamości dopasowania (89%), który jest niski dla najlepszego trafienia w BLAST. (2) Niedopasowanie między sekwencją zapytania a sekwencją obiektu (G na A). (3) Luka o długości czterech par zasad w sekwencji obiektu utworzona przez algorytm dopasowania; luki w zapytaniu lub obiekcie wskazują na słabe dopasowanie. (4) Uogólniony region w centrum dopasowania z wieloma niedopasowaniami i lukami. Region tego typu sugeruje, że sekwencja zapytania może pochodzić od nowego gatunku Caenorhabditis. Przedstawiono rzeczywisty przykład dopasowania nowego gatunku, C. oiwi, odkrytego w 2017 roku. (B) Przykład dobrego dopasowania między sekwencją zapytania ITS2 izolatu a sekwencją obiektu. (5) Procent tożsamości dopasowania (99%), co zazwyczaj oznacza, że sekwencja zapytania pochodzi od izolatu tego samego gatunku co obiekt. (6) Centralny region dopasowania z idealną tożsamością. Region tego typu sugeruje, że izolat zapytania prawdopodobnie należy do tego samego gatunku co obiekt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy żelowej PCR, fragmenty DNA, drabina 500 bp i 2 kb, analiza SSU i ITS2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Produkty PCR SSU i ITS2. Górny żel przedstawia produkty PCR uzyskane przy użyciu zestawu starterów SSU dla 12 reprezentatywnych próbek. Po lewej stronie, w celach referencyjnych, naniesiono drabinę DNA. Produkty PCR SSU dla nicieni Caenorhabditis mają długość około 500 bp. Próbki 2-12 uległy amplifikacji z zestawem starterów SSU, natomiast próbka pierwsza nie. Brak amplikonu SSU o długości 500 bp dla próbki pierwszej sugeruje, że materiał po lizie był słabej jakości i próbka musi zostać poddana ponownej lizie. Dolny żel przedstawia produkty PCR uzyskane przy użyciu zestawu starterów ITS2 dla tych samych 12 próbek, które widnieją na górnym żelu. Drabina i próbki znajdują się w tej samej orientacji na obu żelach. Sześć z 12 próbek nie uległo amplifikacji z zestawem starterów ITS2. Próbki z prążkami SSU i ITS2 zostały poddane sekwencjonowaniu metodą Sangera i zidentyfikowane na podstawie podobieństwa sekwencji przy użyciu algorytmu NCBI BLAST. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1: Etykiety C. Plik PDF zawierający 2500 unikalnych etykiet C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/C-labels.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Etykiety S. Plik PDF zawierający 5000 unikalnych etykiet S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/S-labels.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Materiały terenowe. Lista pakowa materiałów używanych w terenie do pobierania próbek nicieni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Składy mieszanin PCR i warunki termocyklerowe. Tabela zawierająca składy mieszanin PCR i warunki termocyklerowe dla PCR regionów ITS2 oraz SSU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 3: Przepisy na bufory do elektroforezy. Przepis na 0,5 M roztwór kwasu etylendiaminotetraoctowego (EDTA) o pH 8,0 oraz roztwór buforu TRIS-octan-EDTA (TAE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_3.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół może być używany do przeprowadzania badań ekologicznych na dużą skalę nicieni Caenorhabditis. Podstawową zaletą tej metody jest sprawna organizacja i analiza danych ekologicznych i molekularnych związanych z nicieniami zebranymi z natury.

Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Protokół ten może być wykorzystany do usprawnienia izolacji i identyfikacji nicieni Caenorhabditis od natury oraz rejestrowania ważnych danych ekologicznych i środowiskowych związanych ze środowiskiem naturalnym nicieni. Głównymi zaletami tej techniki są jej skalowalność i dokładność, które są możliwe dzięki wykorzystaniu mobilnych platform gromadzenia danych, baz danych w chmurze i ustandaryzowanych funkcji przetwarzania danych. Aby rozpocząć, zidentyfikuj miejsce, w którym chcesz zbadać nicienie Caenorhabditis.Aby utworzyć projekt Fulcrum, utwórz konto w Fulcrum online, korzystając z bezpłatnej umowy edukacyjnej i dodaj aplikację do pobierania próbek z pola nicieni. Następnie dodaj aplikację do izolacji nicieni. Wydrukuj zestaw etykiet z kodami QR jako etykiety C, aby śledzić kolekcje i etykiety S, aby śledzić izolacje nicieni.Przymocuj etykiety C do plastikowych toreb Ziploc w celu zapakowania. Zachowaj zestaw etykiet S do użytku w laboratorium. Wybierz pobieranie próbek pola nicieni z menu rozwijanego aplikacji mobilnej Fulcrum i naciśnij plus, aby rozpocząć nowy rekord w projekcie.Zrób zdjęcie podłoża. Stuknij w pole C-Label i wybierz skanowanie. Zeskanuj kod kreskowy na torbie zbiorczej za pomocą aparatu w urządzeniu mobilnym, a następnie dotknij Gotowe.Stuknij w pole podłoża i wybierz typ podłoża. Zmierz temperaturę powierzchni podłoża za pomocą termometru bezdotykowego i zapisz wartość w polu temperatury podłoża. Mierz i rejestruj również temperaturę i wilgotność otoczenia.Zapisz i nagrywaj w Fulcrum, dotykając Zapisz w lewym górnym rogu ekranu. Zbierz łyżkę stołową podłoża bez patyczków lub innych twardych kawałków, odwracając worek zbiorczy jako rękawicę, aby podnieść podłoże, a następnie zamknij worek. Dla każdej torebki Ziploc zwróć uwagę na etykietę C na torbie i przymocuj pasującą etykietę C do wieczka 10-centymetrowej płytki nakrapianej bakteriami OP50.Przenieś jedną łyżkę stołową próbki z każdego worka zbiorczego na płytki C za pomocą czystej plastikowej łyżki. W aplikacji Fulcrum wybierz izolację nicieni z menu aplikacji. Następnie utwórz nowy rekord izolacji, dotykając ikony plusa w prawym dolnym rogu.Stuknij w przycisk wyboru, aby znaleźć etykietę C powiązaną z próbką. Stuknij w ikonę wyszukiwania. Następnie dotknij ikony skanowania, aby zeskanować kod QR C-Label.Poszukaj nicieni na płytce C za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Dotknij robaków na polu próbki, aby zarejestrować obecność nicieni w próbce. Jeśli nicienie nie są obecne, należy sfilmować płytkę C i wyrzucić ją do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.Jeśli nicienie są obecne, należy wyizolować do pięciu nicieni z płytki C i przenieść każdą z nich na własną płytkę S. Następnie dotknij pola Tabliczki z oznaczeniem S, aby wprowadzić płytę S używaną do tej izolacji. Stuknij w plus w prawym dolnym rogu.Stuknij w S-Label, a następnie kliknij skanuj, aby otworzyć kamerę urządzenia, a następnie zeskanuj kod QR S-Label na płycie S. Stuknij w przycisk zapisywania w prawym górnym rogu, gdy rekord izolacji ma poprawnie dodane wszystkie informacje, a następnie sparafilmuj płytki S z izolowanymi nicieniami i odłóż je na bok w miejscu przeznaczonym do przechowywania płytek S z nicieniami. Zaloguj się na stronie Fulcrum i wybierz aplikację do izolacji nicieni.Kliknij eksporter, aby pobrać plik zip, który zawiera plik s_labeled_plates. csv izolacji nicieni. Przejdź do szablonu genotypowania dzikiej izolacji Arkusza Google i skopiuj Arkusz Google.Umieść etykiety S skopiowane z kolumny s_labeled_plates. csv izolacji nicieni w arkuszu genotypowania. Sprawdź, czy na płytkach S nie ma rozmnażających się zwierząt 48 godzin po izolacji.Jeśli na tabliczce S znajdują się rozmnażające się zwierzęta, należy wprowadzić jedno z nich w kolumnie proliferacja 48 w arkuszu genotypowania, a następnie przenieść płytkę S do pola oznaczonego jako 48-godzinne pole proliferacji pierwszej. Sprawdź płytki S, które nie rozmnażały się po 48 godzinach od izolacji, ponownie po 168 godzinach od izolacji. Jeśli płytka S jest teraz proliferująca, wprowadź ją w kolumnie proliferacja 168 na arkuszu genotypowania, a następnie przenieś płytkę S do pola oznaczonego jako 168 godzin proliferacji pole pierwsze.Przefiltruj genotyp w Arkuszu Google, aby uwzględnić tylko etykiety S w jednym polu proliferacji, które mają zostać poddane lizie, a następnie wybierz kolumny S-Label przez węzły lizy. Wydrukuj arkusz lizy dla każdego pudełka do lizy. Przygotować 12-dołkowe probówki paskowe do próbek przeznaczonych do lizy.Odkręć jedną probówkę z paskiem i dodaj osiem mikrolitrów buforu do lizy do każdej nakrętki za pomocą powtarzalnego pipetera. Wybierz od trzech do pięciu zwierząt z płytek źródłowych do pozycji nasadek wskazanych w arkuszu lizy. Powtórz tę czynność dla maksymalnie ośmiu probówek paskowych i umieść probówki w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Wyjmij zestawy probówek paskowych i uruchom program lizy w termocyklerze. Następnie przechowuj lizaty w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Wyjmij probówki paskowe z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i rozmrozić materiał do lizy na lodzie.Podczas rozmrażania materiału do lizy przygotuj główne mieszanki ITS2 i SSU w oddzielnych probówkach na lodzie. Dodać dwa mikrolitry lizatu do odpowiedniego dołka w płytce PCR za pomocą wielokanałowej pipety o małej objętości. Uruchom PCR za pomocą odpowiedniego programu termocyklera i zapisz, które etykiety S dają produkty ITS2 lub SSU PCR w arkuszu genotypowania.Dla każdej próbki, która jest dodatnia ITS2, użyj pozostałego produktu ITS2 PCR do sekwencjonowania Sangera i uzyskaj pliki wyjściowe sekwencji dla każdej etykiety S z platformy sekwencjonowania. Przejdź do witryny NBCI BLAST w przeglądarce internetowej, aby rozpocząć wyszukiwanie BLAST. W przypadku sekwencji S-plate, które BLAST do gatunku Caenorhabditis, wprowadź pełną nazwę rodzaju i gatunku najwyższego trafienia BLAST w kolumnie identyfikatora gatunku.Nazwij szczepy unikalnymi nazwami, zgodnie z konwencjami nomenklatury Caenorhabditis i wprowadź nazwy szczepów w kolumnie z nazwą szczepu. Aby przetworzyć dane, przejdź do strony internetowej Fulcrum i wyeksportuj surowe dane projektu z bazy danych Fulcrum. Otwórz nowy skrypt R i postępuj zgodnie ze wskazówkami w winiecie easyfulcrum, aby przetworzyć dane kolekcji.W NBCI BLAST, wyniki dla S-Label S-05554 pokazują, że największym hitem jest Caenorhabditis briggsae. Ponadto niektóre izolowane nicienie wymagają dodatkowego wysiłku w celu genotypu. Na przykład około 2% izolatów nie ulega amplifikacji za pomocą zestawu starterów SSU PCR po pierwszej próbie lizy i muszą być ponownie poddane lizie, aby upewnić się, że materiał do lizy nadaje się do amplifikacji za pomocą zestawu starterów ITS2.Postępując zgodnie z tą procedurą, naukowcy mogą badać dane ekologiczne i środowiskowe związane z izolatami dzikich nicieni, aby zidentyfikować lokalizacje i cechy substratów, które najprawdopodobniej są siedliskiem określonych gatunków nicieni.

a-highly-scalable-approach-to-perform-ecological-surveys-selfing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokazujemy metodę wytwarzania rozwojowo zsynchronizowanej populacji bezpłodnych dorosłych C. elegans. Przykładowy protokół synchronizuje robaki w celu zbadania wskaźników zużycia tlenu u żywych zwierząt.

Synchronizacja nicieni: metoda uzyskiwania populacji robaków w identycznych stadiach rozwoju

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

Obecny protokół zawiera metodologię sortowania i czyszczenia populacji Caenorhabditis elegans  w zależności od wieku.Wykorzystuje proste, niedrogie i wydajne narzędzie wykonane na zamówienie w celu uzyskania dużej eksperymentalnej populacji nicieni do badań.

Zapalenie jelita grubego (Caenorhabditis) Sito: niezaawansowany technologicznie instrument i metodologia sortowania małych organizmów wielokomórkowych

Opisujemy protokoły korzystania z platformy śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP), która umożliwia wysokoprzepustową charakterystykę fenotypową dużych populacji Caenorhabditis elegans. Protokoły te mogą być wykorzystywane do charakteryzowania subtelnych zmian behawioralnych w zmutowanych szczepach lub w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne w wysoce skalowalny sposób.

Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

Aby wykorzystać Caenorhabditis elegans (C. elegans) w badaniach omiki, potrzebna jest metoda generowania dużych populacji robaków, gdzie pojedyncza próbka może być mierzona na różnych platformach do analiz porównawczych. Przedstawiono tutaj metodę hodowli populacji C. elegans na płytkach hodowlowych na dużą skalę (LSCP) oraz dokumentowania wzrostu populacji.

Kultura i analiza populacji dużoskalowych o mieszanym stadium Caenorhabditis elegans

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Ten protokół przedstawia metodę efektywnego wydobywania żywych nicieni z naturalnych substratów w terenie.

Szybka izolacja dzikich nicieni za pomocą lejka Baermanna

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

Poznaj skalowalną metodę izolacji i identyfikacji nicieni Caenorhabditis w środowisku naturalnym przy użyciu aplikacji mobilnej Fulcrum oraz chmurowych baz danych. To podejście usprawnia badania ekologiczne i molekularne.

Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Przeglądaj więcej filmów