Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Protokół ten może być wykorzystany do usprawnienia izolacji i identyfikacji nicieni Caenorhabditis od natury oraz rejestrowania ważnych danych ekologicznych i środowiskowych związanych ze środowiskiem naturalnym nicieni. Głównymi zaletami tej techniki są jej skalowalność i dokładność, które są możliwe dzięki wykorzystaniu mobilnych platform gromadzenia danych, baz danych w chmurze i ustandaryzowanych funkcji przetwarzania danych. Aby rozpocząć, zidentyfikuj miejsce, w którym chcesz zbadać nicienie Caenorhabditis.

Aby utworzyć projekt Fulcrum, utwórz konto w Fulcrum online, korzystając z bezpłatnej umowy edukacyjnej i dodaj aplikację do pobierania próbek z pola nicieni. Następnie dodaj aplikację do izolacji nicieni. Wydrukuj zestaw etykiet z kodami QR jako etykiety C, aby śledzić kolekcje i etykiety S, aby śledzić izolacje nicieni.

Przymocuj etykiety C do plastikowych toreb Ziploc w celu zapakowania. Zachowaj zestaw etykiet S do użytku w laboratorium. Wybierz pobieranie próbek pola nicieni z menu rozwijanego aplikacji mobilnej Fulcrum i naciśnij plus, aby rozpocząć nowy rekord w projekcie.

Zrób zdjęcie podłoża. Stuknij w pole C-Label i wybierz skanowanie. Zeskanuj kod kreskowy na torbie zbiorczej za pomocą aparatu w urządzeniu mobilnym, a następnie dotknij Gotowe.

Stuknij w pole podłoża i wybierz typ podłoża. Zmierz temperaturę powierzchni podłoża za pomocą termometru bezdotykowego i zapisz wartość w polu temperatury podłoża. Mierz i rejestruj również temperaturę i wilgotność otoczenia.

Zapisz i nagrywaj w Fulcrum, dotykając Zapisz w lewym górnym rogu ekranu. Zbierz łyżkę stołową podłoża bez patyczków lub innych twardych kawałków, odwracając worek zbiorczy jako rękawicę, aby podnieść podłoże, a następnie zamknij worek. Dla każdej torebki Ziploc zwróć uwagę na etykietę C na torbie i przymocuj pasującą etykietę C do wieczka 10-centymetrowej płytki nakrapianej bakteriami OP50.

Przenieś jedną łyżkę stołową próbki z każdego worka zbiorczego na płytki C za pomocą czystej plastikowej łyżki. W aplikacji Fulcrum wybierz izolację nicieni z menu aplikacji. Następnie utwórz nowy rekord izolacji, dotykając ikony plusa w prawym dolnym rogu.

Stuknij w przycisk wyboru, aby znaleźć etykietę C powiązaną z próbką. Stuknij w ikonę wyszukiwania. Następnie dotknij ikony skanowania, aby zeskanować kod QR C-Label.

Poszukaj nicieni na płytce C za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Dotknij robaków na polu próbki, aby zarejestrować obecność nicieni w próbce. Jeśli nicienie nie są obecne, należy sfilmować płytkę C i wyrzucić ją do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.

Jeśli nicienie są obecne, należy wyizolować do pięciu nicieni z płytki C i przenieść każdą z nich na własną płytkę S. Następnie dotknij pola Tabliczki z oznaczeniem S, aby wprowadzić płytę S używaną do tej izolacji. Stuknij w plus w prawym dolnym rogu.

Stuknij w S-Label, a następnie kliknij skanuj, aby otworzyć kamerę urządzenia, a następnie zeskanuj kod QR S-Label na płycie S. Stuknij w przycisk zapisywania w prawym górnym rogu, gdy rekord izolacji ma poprawnie dodane wszystkie informacje, a następnie sparafilmuj płytki S z izolowanymi nicieniami i odłóż je na bok w miejscu przeznaczonym do przechowywania płytek S z nicieniami. Zaloguj się na stronie Fulcrum i wybierz aplikację do izolacji nicieni.

Kliknij eksporter, aby pobrać plik zip, który zawiera plik s_labeled_plates. csv izolacji nicieni. Przejdź do szablonu genotypowania dzikiej izolacji Arkusza Google i skopiuj Arkusz Google.

Umieść etykiety S skopiowane z kolumny s_labeled_plates. csv izolacji nicieni w arkuszu genotypowania. Sprawdź, czy na płytkach S nie ma rozmnażających się zwierząt 48 godzin po izolacji.

Jeśli na tabliczce S znajdują się rozmnażające się zwierzęta, należy wprowadzić jedno z nich w kolumnie proliferacja 48 w arkuszu genotypowania, a następnie przenieść płytkę S do pola oznaczonego jako 48-godzinne pole proliferacji pierwszej. Sprawdź płytki S, które nie rozmnażały się po 48 godzinach od izolacji, ponownie po 168 godzinach od izolacji. Jeśli płytka S jest teraz proliferująca, wprowadź ją w kolumnie proliferacja 168 na arkuszu genotypowania, a następnie przenieś płytkę S do pola oznaczonego jako 168 godzin proliferacji pole pierwsze.

Przefiltruj genotyp w Arkuszu Google, aby uwzględnić tylko etykiety S w jednym polu proliferacji, które mają zostać poddane lizie, a następnie wybierz kolumny S-Label przez węzły lizy. Wydrukuj arkusz lizy dla każdego pudełka do lizy. Przygotować 12-dołkowe probówki paskowe do próbek przeznaczonych do lizy.

Odkręć jedną probówkę z paskiem i dodaj osiem mikrolitrów buforu do lizy do każdej nakrętki za pomocą powtarzalnego pipetera. Wybierz od trzech do pięciu zwierząt z płytek źródłowych do pozycji nasadek wskazanych w arkuszu lizy. Powtórz tę czynność dla maksymalnie ośmiu probówek paskowych i umieść probówki w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Wyjmij zestawy probówek paskowych i uruchom program lizy w termocyklerze. Następnie przechowuj lizaty w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Wyjmij probówki paskowe z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i rozmrozić materiał do lizy na lodzie.

Podczas rozmrażania materiału do lizy przygotuj główne mieszanki ITS2 i SSU w oddzielnych probówkach na lodzie. Dodać dwa mikrolitry lizatu do odpowiedniego dołka w płytce PCR za pomocą wielokanałowej pipety o małej objętości. Uruchom PCR za pomocą odpowiedniego programu termocyklera i zapisz, które etykiety S dają produkty ITS2 lub SSU PCR w arkuszu genotypowania.

Dla każdej próbki, która jest dodatnia ITS2, użyj pozostałego produktu ITS2 PCR do sekwencjonowania Sangera i uzyskaj pliki wyjściowe sekwencji dla każdej etykiety S z platformy sekwencjonowania. Przejdź do witryny NBCI BLAST w przeglądarce internetowej, aby rozpocząć wyszukiwanie BLAST. W przypadku sekwencji S-plate, które BLAST do gatunku Caenorhabditis, wprowadź pełną nazwę rodzaju i gatunku najwyższego trafienia BLAST w kolumnie identyfikatora gatunku.

Nazwij szczepy unikalnymi nazwami, zgodnie z konwencjami nomenklatury Caenorhabditis i wprowadź nazwy szczepów w kolumnie z nazwą szczepu. Aby przetworzyć dane, przejdź do strony internetowej Fulcrum i wyeksportuj surowe dane projektu z bazy danych Fulcrum. Otwórz nowy skrypt R i postępuj zgodnie ze wskazówkami w winiecie easyfulcrum, aby przetworzyć dane kolekcji.

W NBCI BLAST, wyniki dla S-Label S-05554 pokazują, że największym hitem jest Caenorhabditis briggsae. Ponadto niektóre izolowane nicienie wymagają dodatkowego wysiłku w celu genotypu. Na przykład około 2% izolatów nie ulega amplifikacji za pomocą zestawu starterów SSU PCR po pierwszej próbie lizy i muszą być ponownie poddane lizie, aby upewnić się, że materiał do lizy nadaje się do amplifikacji za pomocą zestawu starterów ITS2.

Postępując zgodnie z tą procedurą, naukowcy mogą badać dane ekologiczne i środowiskowe związane z izolatami dzikich nicieni, aby zidentyfikować lokalizacje i cechy substratów, które najprawdopodobniej są siedliskiem określonych gatunków nicieni.