Izolacja i charakterystyka komórek odpornościowych z mikropreparowanych splotów naczyniówkowych myszy

Protokół ten może być przydatny do odpowiedzi na pytania dotyczące roli splotów naczyniówkowych i obwodowych komórek odpornościowych w regulacji mózgu w różnych kontekstach w modelach mysich. Protokół ten pozwala na dogłębną analizę ilościową i jakościową unikalnych populacji komórek odpornościowych w splotach naczyniówkowych myszy. Rozwarstwienie splotów naczyniówkowych może być na początku trudne ze względu na ich niewielkie rozmiary i przezroczysty kolor.

Zalecamy najpierw poćwiczenie na zwierzętach bez perfuzji. Aby rozpocząć, umieść mózg wypreparowany z czarnej sześcioma mysi grzbietową stroną do góry na szalce Petriego i umieść szalkę poniżej celów pętli lornetki. Utrzymując mózg na miejscu za pomocą kleszczy, włóż dwa końce innej pary kleszczy w dół przez linię środkową między półkulami.

Za pomocą kleszczy odciągnij korę z modzelem i hipokampem od przegrody, odsłaniając komorę boczną i część trzeciej komory. Zidentyfikuj boczny splot naczyniówkowy jako długą zasłonę wyściełającą komorę boczną i rozszerzającą się na obu końcach. Następnie za pomocą dwóch końców cienkich kleszczy zbierz boczny splot naczyniówkowy.

Uważaj, aby zebrać trójkątną tylną część ukrytą przez tylny fałd hipokampa. Następnie odciągnij korę z ciałem modzelowatym i hipokampem przeciwległej półkuli od przegrody, aby odsłonić całą trzecią komorę i przeciwległą komorę boczną. Za pomocą cienkich kleszczyków zbierz trzeci splot naczyniówkowy zidentyfikowany jako krótka struktura o ziarnistym wyglądzie powierzchni.

Następnie zbierz drugi boczny splot naczyniówkowy. Następnie włóż dwa końce kleszczy między móżdżek a śródmózgowie i odłącz móżdżek od mostu i rdzenia, aby odsłonić czwartą komorę. Następnie zidentyfikuj czwarty splot naczyniówkowy jako długą kulistą strukturę o ziarnistym aspekcie powierzchni, która wyściela czwartą komorę od bocznego prawego końca do lewego końca między móżdżkiem a rdzeniem.

Za pomocą cienkich kleszczy zbierz czwarty splot naczyniówkowy. Po inkubacji wszystkich zebranych splotów naczyniówkowych z kolagenazą dożylną, delikatnie pipetuj w górę iw dół około 10 razy, aby sfinalizować dysocjację. Następnie napełnij probówkę do 1,5 mililitra buforem MACS, aby zatrzymać aktywność kolagenazy dożylnej.

Następnie odwirować komórki i wyrzucić supernatant przed umyciem komórek 1,5 mililitra buforu MACS. Po dodaniu odpowiednich kulek kompensacyjnych i roztworów przeciwciał próbki należy inkubować na lodzie przez 30 do 45 minut, chroniąc je przed ekspozycją na światło. Następnie napełnij probówki 1,5 mililitra buforu MACS i odwiruj komórki i kulki kompensacyjne.

Po ponownym zawieszeniu ogniw i koralikach kompensacyjnych w 500 mikrolitrach bufora MACS, przefiltruj komórki przez sitko o wielkości 70 mikronów. Po włączeniu cytometru przepływowego i oprogramowania wybierz obszar rozproszenia do przodu kontra obszar rozproszenia bocznego i bramkę dla komórek na podstawie rozmiaru. Następnie utwórz bramkę potomną dla pojedynczych komórek z obszarem rozproszenia do przodu w stosunku do wysokości rozproszenia do przodu.

Następnie utwórz bramkę potomną dla żywych komórek z DAPI w porównaniu z obszarem rozproszenia do przodu, aby wykluczyć komórki dodatnie DAPI. Następnie utwórz bramkę potomną dla komórek odpornościowych CD45 dodatnich z CD45 w stosunku do obszaru rozproszenia do przodu. Teraz utwórz bramkę potomną z komórek CD45 dodatnich i wybierz F480 w porównaniu z CD11b, aby zidentyfikować populacje CD11b dodatnie F480 i CD11b dodatnie F480

Następnie utwórz bramkę potomną dla komórek dodatnich F480 CD11b i wybierz CX3CR1 w porównaniu z IA-IE, aby zidentyfikować zarówno makrofagi związane z granicą dodatnie IA-IE CX3CR1, jak i makrofagi ujemne IA-IE CX3CR1. Następnie utwórz bramkę potomną dla makrofagów CD11b dodatnich F480 dodatnich CX3CR1 dodatnich IA-IE i wybierz F480 w porównaniu z CD11b, aby zidentyfikować zarówno makrofagi episplotu Kolmera o wysokiej zawartości F480 o wysokiej zawartości F480 CX3CR1, jak i makrofagi związane z granicą CD11b dodatnie F480 o wysokim poziomie CX3CR1 dodatnie IA-IE. Następnie z populacji CD11b dodatniej F480, bramka dla Ly6C kontra IA-IE.

Wybierz zarówno populację IA-IE dodatnią Ly6C, jak i IA-IE ujemne komórki Ly6C-dodatnie, które odpowiadają głównie monocytom lub neutrofilom. Na koniec utwórz bramkę potomną dla CD11b dodatniej F480 ujemnej populacji Ly6C IA-IE dodatniej i wybierz CD11b kontra CX3CR1. Następnie zidentyfikuj zarówno populacje CD11b o wysokim poziomie CX3CR1, jak i CD11b dodatnie CX3CR1 ujemne.

W przypadku bramkowania limfocytów T, po wykluczeniu komórek DAPI dodatnich, jak opisano wcześniej, utwórz bramkę potomną dla komórek odpornościowych CD45 dodatnich z CD45 w porównaniu z FSC-A, a następnie utwórz bramkę potomną z komórek CD45 dodatnich i wybierz TCR beta w porównaniu z CD11b. Wyklucz komórki szpikowe CD11b dodatnie i wybierz populację komórek T TCR dodatnich CD11b. Na koniec utwórz bramkę potomną dla populacji TCR beta dodatniej CD11b ujemnej i wybierz CD4 kontra CD8a.

Zidentyfikuj zarówno limfocyty T CD8 ujemne, jak i CD4-dodatnie oraz limfocyty T CD8-dodatnie CD4. Zademonstrowane tutaj analizy cytometrii przepływowej z powodzeniem ujawniły główne podzbiory limfocytów szpikowych i limfocytów T oraz ich względną całkowitą liczbę na mysz w wysoce powtarzalny sposób. Analiza cytometrii przepływowej komórek szpikowych pokazuje, że splot naczyniówkowy jest wypełniony przez makrofagi związane z CD11b dodatnim CX3CR1 dodatnim F480 o wysokiej granicy, reprezentujące 80% komórek odpornościowych CD45 dodatnich w splocie naczyniówkowym.

Zidentyfikowano również populację makrofagów episplotu Kolmera o wysokiej zawartości F480 i dodatniej CX3CR1 z ujemnym wynikiem IA-IE. Wśród komórek odpornościowych CD11b dodatnich F480 scharakteryzowano dwie różne populacje komórek Ly6C ujemnych IA-IE i prawdopodobnie odpowiadają komórkom dendrytycznym. Analiza i strategia bramkowania limfocytów T podkreśliła obecność niewielkiej populacji komórek beta dodatnich CD45 CD11b ujemnych TCR.

Wśród nich około 30-50 CD8 ujemnych CD4 dodatnich i CD8-dodatnich CD4 ujemnych limfocytów T na mysz wypełniało splot naczyniówkowy w warunkach fizjologicznych. Ważne jest, aby kontrolować jakość perfuzji, ponieważ każde zanieczyszczenie krwi może zatrzeć skład immunologiczny splotu naczyniówkowego. Po tej metodzie można posortować wybrane populacje komórek w celu dalszej analizy, takiej jak sekwencjonowanie masowe lub jednokomórkowe RNA.