Badanie interakcji biomolekularnych między molekularnym chaperonem Hsp90 a jego klientem, kinazą białkową Cdc37, przy użyciu technologii biodetekcji z efektem polowym

FEB to niewymagająca etykiet i ekonomiczna platforma do wykrywania interakcji ______ _______, która oferuje szybkie i dokładne pomiary. Metoda ta umożliwia walidację znanych lub nieznanych interakcji oraz łatwy sposób testowania potencjalnych inhibitorów oddziaływań biomolekularnych. Główną zaletą FEB jest zautomatyzowane, przyjazne dla użytkownika oprogramowanie, które prowadzi użytkownika przez cały eksperyment za pomocą otwartej, ręcznej platformy do pipetowania, umożliwiając użytkownikom pracę z niewielkim lub nawet zerowym szkoleniem.

Technologia FEB oferuje również zastosowania w różnych dziedzinach farmacji, analizie biomolekularnej małych cząsteczek, peptydów i białek, walidacji leków poprzez łatwe przełożenie aktywności biologicznej in vitro na skuteczność in vivo. Będąc początkującym, możesz napotkać wyzwania związane z wyborem odpowiednich stężeń analitu, aby zoptymalizować eksperyment w celu uzyskania wiarygodnej wartości KD. Radzimy zwrócić uwagę na proces funkcjonalizacji chipa i prawidłową wymianę.

Rozpocząć od zmieszania równych objętości roztworu EDC i sulfo-NHS, pipetując w górę iw dół. Umieść chip biosensora dostarczony przez firmę na szklanej szalce Petriego z dopasowaną pokrywką. Sugeruje się, że wszystkie etapy funkcjonalizacji związane z aktywacją chipa są wykonywane na szalce Petriego.

Nałóż 50 mikrolitrów jednomolowego buforu MES na chip biosensora. Inkubować przez minutę w temperaturze pokojowej. Następnie należy odessać bufor i natychmiast nałożyć 50 mikrolitrów roztworu sulfo-NHS EDC na chip czujnika.

Przykryj szalkę Petriego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór EDC sulfo-NHS z chipa i nałożyć 50 mikrolitrów jednomolowego buforu MES. Odessać bufor MES i dwukrotnie przepłukać chip 50 mikrolitrami 1X PBS.

Odessać PBS z chipa i dodać cząsteczkę docelową Hsp90. Przykryj szklaną szalkę Petriego i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać roztwór zawierający cząsteczkę docelową i spłukać trzykrotnie 50 mikrolitrami 1X PBS.

Odessać roztwór 1X PBS z chipa i dodać 50 mikrolitrów jednego roztworu hartowania. Przykryj szklaną szalkę Petriego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zassać jeden roztwór hartowniczy z chipa i dodać 50 mikrolitrów roztworu do gaszenia dwóch.

Przykryj szklaną szalkę Petriego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać roztwór hartowniczy dwa z chipa i przepłukać chip pięć razy za pomocą 50 mikrolitrów 1X PBS, pozostawiając ostatnią kroplę PBS na czujniku. Przygotować serię rozcieńczeń analitu dla Cdc37 w żądanym zakresie stężeń.

Zaprojektuj eksperyment tak, aby obejmował co najmniej osiem różnych stężeń analitu w celu uzyskania wiarygodnej stałej dysocjacji lub wartości KD, i przygotuj te różne rozcieńczenia w tym samym buforze używanym do kalibracji i białka docelowego. Ostrożnie przyłóż chip do instrumentu. Upewnij się, że oprogramowanie jest włączone, a dioda LED zmieni kolor na zielony.

Następnie naciśnij moduł Uruchom eksperyment w zautomatyzowanym oprogramowaniu i wybierz 10 punktów z regeneracją lub dowolny inny żądany protokół. Wypełnij szczegóły, takie jak nazwa operatora, nazwa eksperymentu, data, bufor regeneracyjny, unieruchomiony cel i analit w roztworze. Naciśnij przycisk Rozpocznij eksperyment wyświetlany na oprogramowaniu i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi przez zautomatyzowane oprogramowanie.

Aby przeprowadzić kalibrację przyrządu, należy odessać pozostały roztwór PBS z chipa i nałożyć 50 mikrolitrów bufora kalibracyjnego. Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj pięć minut, aż etap kalibracji zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy określony dla etapu kalibracji z alarmem ostrzegawczym w celu podjęcia dalszych działań.

Następnie wykonaj asocjację analitu, odsysając bufor kalibracyjny z chipa i stosując 50 mikrolitrów o najniższym stężeniu analitu. Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj pięć minut, aż krok kojarzenia zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy kroku asocjacji z alarmem ostrzegawczym, aby kontynuować.

Aby przeprowadzić dysocjację analitu, należy odessać roztwór analitu z chipa i nałożyć 50 mikrolitrów buforu dysocjacyjnego. Naciśnij przycisk kontynuacji. Po upływie czasu trwania kroku dysocjacji oprogramowanie wyświetla punkt końcowy kroku dysocjacji z alarmem ostrzegawczym.

Następnie przeprowadź regenerację chipa, odsysając roztwór dysocjacyjny z chipa i nakładając 50 mikrolitrów bufora regeneracyjnego. Następnie naciśnij przycisk Kontynuuj. Etap regeneracji trwa zwykle około 30 sekund.

Następnie oprogramowanie wyświetla punkt końcowy etapu regeneracji z alarmem ostrzegawczym, który należy podjąć. Na koniec, aby umyć chip, odessać roztwór regeneracyjny z chipa i nałożyć 50 mikrolitrów buforu do płukania. Odessać roztwór z chipa i powtórzyć to pięć razy.

Pozostaw ostatnią kroplę buforu do płukania na chipie. Następnie naciśnij przycisk Kontynuuj i odczekaj 30 sekund, aż czas trwania kroku prania zakończy się na wyświetlaczu oprogramowania. Powtórz kroki dla każdego zastosowanego stężenia analitu.

Pięć etapów kalibracji, asocjacji analitu, dysocjacji, regeneracji i pięciokrotnego mycia stanowi jeden cykl. Naciśnij przycisk Analiza w oprogramowaniu do automatycznej analizy po zakończeniu eksperymentu. Pojawi się okno wyświetlania zawierające wszystkie punkty eksperymentalne.

Upewnij się, że stężenia analitu stosowane w zalecanym protokole są prawidłowe. Naciśnij przycisk Uruchom analizę, aby automatycznie wygenerować wartość KD. Oprogramowanie generuje wykres dopasowania wzgórza, wykreślając stężenia analitu w stosunku do odpowiednich odpowiedzi I, na podstawie których obliczana jest stała dysocjacji w stanie równowagi.

Docelowe białko Hsp90 zostało unieruchomione na chipie, a do pierwszego eksperymentu przygotowano 10 koncentracji białka analitu Cdc37 w zakresie od 25 nanomolowców do 5 000 nanomolowców. Pliki danych wygenerowane z pierwszego eksperymentu zostały pokazane tutaj. Dane eksperymentalne monitorowane w czasie rzeczywistym są pokazane tutaj.

Oś Y odpowiada odpowiedzi I w jednostkach biosensorów, a oś X odpowiada różnym punktom czasowym i stężeniom analitu w eksperymencie. Przedstawiony tutaj obraz graficzny przedstawia wykres dopasowania wzgórza wygenerowany przez oprogramowanie do automatycznej analizy. Oś Y odpowiada odpowiedzi I w jednostkach biosensorów, a oś X odpowiada różnym stężeniom analitu w eksperymencie.

Przedstawiony tutaj obraz graficzny przedstawia wykres asocjacyjny wygenerowany za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Oś Y odpowiada odpowiedzi I na końcu fazy asocjacji, a oś X odpowiada różnym stężeniom analitu Cdc37. W drugim eksperymencie użyto innego zestawu stężeń w zakresie od 0,4 nanomola do 200 nanomolów, a wygenerowane pliki danych pokazano tutaj.

Obrazy graficzne reprezentują termogram ITC interakcji Hsp90 i Cdc37. Pokazano tutaj odpowiednie krzywe wydzielania ciepła uzyskane w wyniku kolejnych wstrzyknięć Cdc37 do Hsp90 o temperaturze 298,15 kelwinów. Użyta tutaj moc różnicowa jest funkcją czasu.

Zintegrowane punkty danych na tym wykresie wyznaczają odpowiednie znormalizowane ciepło w funkcji współczynnika Muellera Hsp90 do Cdc37. Zastosowane tutaj podejście do pipetowania otwartego wymaga, aby użytkownik posiadał podstawowe umiejętności pipetowania ręcznego i uważał, aby nie dotykać końcówką bioczujnika. Powtarzalność taktowania kroku zależy wyłącznie od użytkownika.

Gdy badacz scharakteryzuje interakcję między dwiema biomolekułami, możemy przeprowadzić eksperyment przesiewowy, projektując potencjalne inhibitory lub modulatory ukierunkowane na określoną interakcję biomolekularną za pomocą systemu FEB. Procedura ta może być wykorzystana do identyfikacji, weryfikacji i ilościowego określenia znanych i nowych interakcji między białkami, a także małymi cząsteczkami, w tym lekami i peptydami.