Name: Badanie interakcji biomolekularnych między molekularnym chaperonem Hsp90 a jego klientem, kinazą białkową Cdc37, przy użyciu technologii biodetekcji z efektem polowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj bezetykietową detekcję interakcji białkowych Hsp90 i Cdc37 przy użyciu biosensingu z efektem polowym. Ta metoda umożliwia szybkie i precyzyjne badanie wiązań biomolekularnych w badaniach biofizycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant z Binational Science Foundation (BSF) dla S.K.S. i N.Q.

UWAGA: Rekombinowane białka użyte w tym badaniu, Hsp90 i Cdc37, zostały uzyskane komercyjnie (patrz Tabela Materiałów).
1. Aktywacja chipa
UWAGA: Wszystkie materiały, które mają być użyte w eksperymencie, są wymienione w Tabeli Materiałów. Wszystkie przygotowane roztwory przefiltrować przez sterylny filtr 0,2 μm.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karmodiimidu (EDC), dodając 2 mg EDC do 2,5 ml 1 M buforu kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) (pH = 6,0) w probówce o pojemności 15 ml. Przygotować roztwory N-hydroksysulfosukcynimidu (sulfo-NHS), dodając 6 mg sulfo-NHS do 2,5 ml 1 M buforu MES (pH = 6,0) w oddzielnej probówce o pojemności 15 ml. Podamy 50 μl każdego roztworu w niezależnych probówkach i przechowuj w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Wymieszać równe objętości roztworu sulfo-NHS piasku EDC (50 μl EDC + 50 μl sulfo-NHS), pipetując w górę iw dół (nie wirować). 
	UWAGA: Zmieszany roztwór EDC/sulfo-NHS należy zużyć w ciągu 30 minut, aby utrzymać skuteczne sieciowanie w celu prawidłowej funkcjonalności chipa.</li>
	<li>Umieść chip biosensora (5,7 cm x 2,4 cm; patrz tabela materiałów) dostarczony przez firmę na szklanej szalce Petriego z dopasowaną pokrywką. Sugeruje się, że wszystkie etapy funkcjonalizacji związane z aktywacją chipa są wykonywane na szalce Petriego. Nanieść 50 μl 1 M buforu MES (pH = 6,0) na chip bioczujnika, inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie odessać bufor.</li>
	<li>Natychmiast nanieść 50 μl roztworu EDC/sulfo-NHS na chip czujnika. Przykryj szalkę Petriego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór EDC/sulfo-NHS z chipa.</li>
	<li>Przepłukać chip jednorazowo 50 μl 1 M buforu MES (pH = 6,0); odessać bufor MES.</li>
</ol>
2. Docelowe unieruchomienie białka
<ol>
	<li>Wypłucz chip 2x 50 μl 1x PBS (pH = 7,4). Odessać PBS z chipa i dodać cząsteczkę docelową, Hsp90 (50 μL; 500 nM). 
	UWAGA: Niezgodność bufora może zrujnować cały eksperyment; dlatego przed eksperymentem ważne jest, aby upewnić się, że cząsteczka docelowa znajduje się w tym samym buforze, który jest używany do kalibracji (np. 1x PBS (pH = 7,4)). W razie potrzeby przed eksperymentem należy przeprowadzić wymianę buforu poprzez dializę przez noc. W tym eksperymencie przeprowadzono całonocną dializę dla obu rekombinowanych białek, Hsp90 i Cdc37, przeciwko 1x PBS (pH = 7,4; patrz tabela materiałów) przy prawidłowej wymianie buforu w temperaturze 4 °C. Stężenie materiału docelowego (w tym przypadku Hsp90) może się różnić w zależności od różnych protokołów doświadczalnych i charakteru materiałów docelowych (białko/peptyd/ligandy).</li>
	<li>Przykryj szklaną szalkę Petriego i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór zawierający cząsteczkę docelową i przepłukać 3x 50 μl 1x PBS (pH = 7,4). Odessać 1x roztwór PBS (pH = 7,4) z chipa.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu Quench 1 (3,9 mM alkoholu amino-PEG5 w 1x PBS (pH = 7,4)) do chipa. Przykryć szklaną szalkę Petriego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zassać roztwór Quench 1 z chipa.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu Quench 2 (1 M etanoloaminy (pH = 8,5)) do chipa. Przykryj szklaną szalkę Petriego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór Quench 2 z chipa i przepłukać chip 5x za pomocą 50 μL 1x PBS, pozostawiając ostatnią kroplę PBS na czujniku.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek analitu
<ol>
	<li>Przygotować serię rozcieńczeń analitu dla Cdc37 w żądanym zakresie stężeń. W pierwszym eksperymencie zastosowano następujące stężenia: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1000 nM, 2000 nM, 3000 nM i 5000 nM. W drugim eksperymencie zastosowano inny zestaw stężeń w zakresie od 0,4 nM do 200 nM.</li>
	<li>Zaplanuj eksperyment tak, aby obejmował co najmniej osiem różnych stężeń analitu w celu uzyskania wiarygodnej wartościKD. Przygotować różne rozcieńczenia białka analitu w tym samym buforze, który jest używany do kalibracji i białka docelowego; tutaj jest to 1x PBS (pH = 7,4).</li>
</ol>
4. Wczytywanie aktywowanego chipa biosensora do urządzenia FEB
UWAGA: Urządzenie FEB składa się z czytnika wyposażonego w sygnalizację świetlną LED oraz wkładu do wkładania chipa biosensora.
<ol>
	<li>Po unieruchomieniu białka docelowego należy włożyć aktywowany chip do wkładu urządzenia, który jest podłączony przez USB do komputera. Po włożeniu chipa na czytniku zaświeci się zielona dioda LED wskazująca, że urządzenie FEB jest gotowe do eksperymentu. Zainstaluj zautomatyzowane oprogramowanie (patrz tabela materiałów) dostarczone przez firmę na komputerze, do którego podłączone jest urządzenie FEB, aby monitorować eksperyment krok po kroku, jak opisano poniżej.</li>
</ol>
5. Uruchom eksperyment
<ol>
	<li>Naciśnij moduł Uruchom eksperyment w zautomatyzowanym oprogramowaniu i wybierz 10 punktów z regeneracją lub dowolny inny żądany protokół. Wypełnij następujące dane: nazwę operatora, nazwę eksperymentu, datę (np. Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); bufor regeneracyjny (np. bufor PBS); unieruchomiony cel (np. Hsp90); analitu w roztworze (np. Cdc37). Szczegółowe informacje można znaleźć na rysunku uzupełniającym S1.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Rozpocznij eksperyment wyświetlany na oprogramowaniu i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi przez automatyczne oprogramowanie, jak opisano poniżej. 
	UWAGA: Oprogramowanie jest w pełni zautomatyzowane, przyjazne dla użytkownika i prowadzi użytkownika przez eksperyment krok po kroku. Na ekranie pojawi się wyskakujące okienko z instrukcjami, jak przejść dalej na każdym kroku eksperymentu. Oprogramowanie dostarczy instrukcje dla każdego powtarzalnego kroku kolejno od kalibracji, asocjacji analitu, dysocjacji, regeneracji i płukania (5x) dla każdego stężenia analitu przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Wykonaj kalibrację przyrządu. W tym celu należy odessać pozostały roztwór PBS z chipa i zastosować 50 μl buforu kalibracyjnego (1x PBS; pH = 7,4). Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 5 minut, aż etap kalibracji zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy określony dla etapu kalibracji (5 minut) z alarmem ostrzegawczym w celu podjęcia dalszych działań.</li>
	<li>Następnie wykonaj asocjację analitu. W tym celu należy odessać bufor kalibracyjny z chipa i zastosować 50 μl najniższego stężenia analitu (25 nM Cdc37). Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 5 minut, aż krok asocjacji zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy dla kroku asocjacji (5 minut) z alarmem ostrzegawczym, aby kontynuować.</li>
	<li>Wykonaj dysocjację analitu. W tym celu należy odessać roztwór analitu z chipa i nanieść 50 μl buforu dysocjacyjnego (1x PBS; pH = 7,4). Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 5 minut, aż czas trwania etapu dysocjacji (5 minut) zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy dla etapu dysocjacji (5 minut) z alarmem ostrzegawczym w celu podjęcia dalszych działań.</li>
	<li>Następnie należy przeprowadzić regenerację wiórów. Odessać roztwór dysocjacyjny z chipa i zastosować 50 μl buforu regeneracyjnego (1x PBS; pH = 7,4). Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 30 sekund, aż czas trwania kroku regeneracji (30 s) zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy dla etapu regeneracji (30 s) z alarmem ostrzegawczym w celu podjęcia dalszych działań.</li>
	<li>Na koniec umyj frytkę. Odessać roztwór regeneracyjny z chipa i nałożyć 50 μl buforu do przemywania (1x PBS; pH = 7,4) na chip. Odessać roztwór z chipa i powtórzyć to 5 razy. Pozostaw ostatnią kroplę bufora myjącego na chipie, naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 30 sekund, aż czas trwania kroku prania zakończy się na wyświetlaczu oprogramowania. 
	UWAGA: Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy dla etapu prania (30 s) z alarmem ostrzegawczym, aby kontynuować następny cykl eksperymentu.</li>
	<li>Powtórz kroki dla każdego użytego stężenia analitu; pięć etapów kalibracji, asocjacji analitu, dysocjacji, regeneracji i płukania (5x) stanowi jeden cykl. W przedstawionym tutaj eksperymencie przeprowadziliśmy 10 cykli dla 10 stężeń analitu (w zakresie od 25 nM do 5 000 nM lub od 0,4 nM do 200 nM; <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
6. Analiza
<ol>
	<li>Naciśnij przycisk Analiza widoczny w górnej części oprogramowania do automatycznej analizy po zakończeniu eksperymentu. Pojawi się okno wyświetlania zawierające wszystkie punkty eksperymentalne. W okienku upewnij się, że stężenia analitu użyte w zalecanym protokole są prawidłowe.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Uruchom analizę, aby automatycznie wygenerować wartośćKD. Oprogramowanie generuje wykres dopasowania Hilla, wykreślając stężenia analitu w stosunku do odpowiednich odpowiedzi I, na podstawie których obliczana jest stała dysocjacji w stanie równowagi, wartośćKD.</li>
	<li>Eksportuj nieprzetworzone dane do analizy w innym oprogramowaniu do analizy statystycznej za pomocą oprogramowania do przeglądania/eksportowania danych, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Skopiuj plik R1R utworzony automatycznie po zakończeniu eksperymentu (np. Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) do nowego folderu na pulpicie. Otwórz oprogramowanie do przeglądania/eksportu danych dostarczone przez firmę (patrz rysunek uzupełniający S2A).</li>
		<li>Kliknij Przetwarzanie danych > Przetwarzaj pliki R1R > OK na ekranie głównym oprogramowania do przeglądania/eksportu danych.</li>
		<li>Wybierz folder zawierający pliki R1R utworzone na pulpicie w kroku 6.3.1. i naciśnij przycisk OK. Spowoduje to utworzenie kopii oryginalnych danych R1R w celu przejrzenia i edytowania danych bez zastępowania oryginalnego pliku.</li>
		<li>Naciśnij ikonę przetwarzania danych widoczną na ekranie głównym oprogramowania do przeglądania/eksportu danych. Naciśnij przycisk Załaduj przetworzone pliki R1R > OK. Wybierz ten sam folder utworzony w kroku 6.3.1, który zawiera przetworzone pliki R1R. Naciśnij przycisk OK. Na tym etapie folder zawierający pliki eksperymentu jest gotowy do przejrzenia.</li>
		<li>Na ekranie głównym oprogramowania do przeglądania/eksportu danych naciśnij Analiza danych. Wybierz Kalibracja > Kalibruj edytowane pliki R1R > OK (patrz Rysunek uzupełniający S2B). Ten krok kalibruje wszystkie punkty danych zgodnie z pierwszym krokiem kalibracji w celu utworzenia linii bazowej.</li>
		<li>Na ekranie głównym oprogramowania do przeglądania/eksportu danych naciśnij Analiza danych. Wybierz opcję Przejrzyj i edytuj pliki R1R > OK. Przejrzyj punkty danych, usuń punkty lub dodaj kroki przy użyciu przycisku Usuń/Dodaj krok. Upewnij się, że wszystkie kroki znajdują się we właściwym miejscu, np. krok kalibracji znajduje się na linii bazowej, krok asocjacji jest na szczycie (patrz rysunek uzupełniający S3), a następnie naciśnij przycisk Zapisz, aby zapisać wszystkie wprowadzone zmiany.</li>
		<li>Na ekranie głównym oprogramowania do przeglądania/eksportu danych naciśnij Analiza danych. Wybierz opcję Analizuj/Kreśl dane, wybierz kroki do wyeksportowania (patrz Rysunek uzupełniający S4). Dodaj każdy krok skojarzenia (np. krok 2, krok 7 itd.) po odjęciu kroku kalibracji (np. krok 1, krok 6 itd.) do listy eksportu przed wyeksportowaniem danych.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Eksportuj te dane. Oprogramowanie generuje plik arkusza kalkulacyjnego zawierający I-Response dla każdego punktu danych stężenia analitu z każdego tranzystora (jeśli wszystkie tranzystory działają, będziemy mieli trzy różne wartości I-odpowiedzi dla każdego punktu stężenia). Użyj tego pliku arkusza kalkulacyjnego, aby dalej analizować dane w oprogramowaniu statystycznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy statystycznej. Utwórz tabelę XY z trzema wartościami Y; naciśnij Utwórz. Dane dla tej tabeli (wartości X, Y) są kopiowane z pliku arkusza kalkulacyjnego utworzonego w kroku 6.3.8. Oś x odpowiada stężeniu analitu (w zależności od zastosowanego stężenia), a trzy wartości Y odpowiadają I-Responses, uzyskanym z oprogramowania Data Review/Export dostarczonego przez firmę.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Analizuj te dane. Wybierz analizy XY > regresji nieliniowej (dopasowanie krzywej) > nasycenia wiązania > jednym miejscu > sumy. Oprogramowanie automatycznie przeanalizuje dane, wygeneruje wartośćK D i utworzy wykres punktów danych.</li>
</ol>

<ol><li>Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectures+and+functional+coverage+of+protein-protein+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces.</a> Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).</li>
<li>Berggård, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein%E2%80%93protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li>
<li>Magliery, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-protein+interactions+with+a+green+fluorescent+protein+fragment+reassembly+trap%3A+Scope+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).</li>
<li>Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).</li>
<li>Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+assays%3A+Eliminating+false+positive+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions.</a> Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).</li>
<li>Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection+in+vitro+and+in+cells+by+proximity+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).</li>
<li>Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico-prediction+of+protein%E2%80%93protein+interactions+network+about+MAPKs+and+PP2Cs+reveals+a+novel+docking+site+variants+in+Brachypodium+distachyon%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon.</a> Scientific Reports. 8 (1), 15083(2018).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).</li>
<li>Wang, W., Goodman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+property+of+dietary+phenolic+agents+in+a+human+LDL-oxidation+ex+vivo+model%3A+Interaction+of+protein+binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Research%22%5BJournal%5D)">Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity.</a> Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).</li>
<li>Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).</li>
<li>Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+phosphorylation+inhibitor+of+delta+protein+kinase+C%E2%80%93Pyruvate+dehydrogenase+kinase+protein%E2%80%93protein+interactions%3A+Application+for+myocardial+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).</li>
<li>Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+in+vivo+and+in+vitro+methods+evaluation+of+antioxidant+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharmaceutical+Journal%22%5BJournal%5D)">Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity.</a> Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).</li>
<li>Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fusion+protein+approach+for+efficient+high-throughput+screening+of+small+molecule%E2%80%93mediating+protein-protein+interactions+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals.</a> Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).</li>
<li>Boute, N., Jockers, R., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+resonance+energy+transfer+in+high-throughput+screening%3A+BRET+versus+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).</li>
<li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438(2014).</li>
<li>Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+pharmacology+for+drug+discovery%3A+Methods+for+virtual+ligand+screening+and+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling.</a> British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).</li>
<li>Valerio, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+advanced+in+silico+methods+for+predictive+modeling+and+information+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).</li>
<li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).</li>
<li>Ideker, T., Sharan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+networks+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Protein networks in disease.</a> Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+development+of+protein%E2%80%93protein+interactions+modulators%3A+mechanisms+and+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213(2020).</li>
<li>Jarosz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90%3A+A+global+regulator+of+the+genotype-to-phenotype+map+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers.</a> Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).</li>
<li>Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrocyclic+inhibitors+of+Hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrocyclic inhibitors of Hsp90.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).</li>
<li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP90+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li>
<li>Stewart, A., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-Immunoprecipitation%3A+Isolation+of+protein+signaling+complexes+from+native+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues.</a> Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).</li>
<li>Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions.</a> Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).</li>
<li>Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaketuryt%C4%97%2C+V+%22Carbonic+Anhydrase+as+Drug+Target%22">Carbonic Anhydrase as Drug Target</a>. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).</li>
<li>Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance%2Fmass+spectrometry+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).</li>
<li>Kumaraswamy, S., Tobias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+kinetic+analysis+of+an+antibody%E2%80%93antigen+interaction+using+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).</li>
<li>Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bio-layer+interferometry+for+the+analysis+of+protein%2Fliposome+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).</li>
<li>Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+methods+to+study+the+kinetics+of+protein%E2%80%93protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Molecular+and+Structural+Biology+Methods%22%5BJournal%5D)">Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions.</a> Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).</li>
<li>Frenzel, D., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+titration+series+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Kinetic titration series with biolayer interferometry.</a> PLoS One. 9 (9), 106882(2014).</li>
<li>Vu, C. -A., Chen, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-effect+transistor+biosensors+for+biomedical+applications%3A+Recent+advances+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects.</a> Sensors. 19 (19), 4214(2019).</li>
<li>Bergveld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+evaluation+of+direct+electrical+protein+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A critical evaluation of direct electrical protein detection methods.</a> Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).</li>
<li>Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-effect+sensors+%E2%80%93+from+pH+sensing+to+biosensing%3A+sensitivity+enhancement+using+streptavidin%E2%80%93biotin+as+a+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system.</a> The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).</li>
<li>Goldsmith, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+biosensing+by+foundry-fabricated+graphene+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors.</a> Scientific Reports. 9 (1), 434(2019).</li>
<li>Afsahi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+graphene-based+biosensor+for+early+detection+of+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).</li>
<li>Afsahi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+novel+graphene-enabled+diagnostic+assays+with+improved+signal-to-noise+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Advances%22%5BJournal%5D)">Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio.</a> MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).</li>
<li>Roe, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+Hsp90+regulation+by+the+protein+kinase-specific+cochaperone+p50cdc37%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37.</a> Cell. 116 (1), 87-98 (2004).</li>
<li>Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc37-Hsp90+complexes+are+responsive+to+nucleotide-induced+conformational+changes+and+binding+of+further+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).</li>
<li>Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+interactions%3A+Their+paramount+importance+for+life%5BTitle%5D)+AND+%22Romanian+Reports+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Biophysical interactions: Their paramount importance for life.</a> Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).</li>
<li>Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+profile+of+protein-protein+interaction%3A+Crystal+structure+of+a+lectin-lectin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITC+in+the+post-genomic+era...%3F+Priceless%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ITC in the post-genomic era...? Priceless.</a> Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).</li>
<li>Concepcion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+biomolecular+interactions+using+bioLayer+interferometry+for+kinetic+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).</li>
<li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance%3A+A+laboratory+medicine+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist.+Reviews%22%5BJournal%5D)">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).</li>
<li>Jacob, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+molecules+for+disruption+of+the+MYC+protein-protein+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów, finansowych lub innych.

W tym badaniu oceniono możliwość zastosowania technologii FEB (podejście do charakterystyki kinetycznej w czasie rzeczywistym) w celu określenia interakcji biomolekularnej między Hsp90 i Cdc37. Wstępny eksperyment eksploracyjny (pierwszy eksperyment) sugerował, że wybór odpowiednich stężeń analitu jest krytyczną częścią eksperymentu i że eksperyment powinien być zaprojektowany z uwzględnieniem punktów stężeń powyżej i poniżej wartościKD , które zostały przewidziane na podstawie danych dostępnych w literaturze....

Oddziaływania biomolekularne: 
Białka stanowią kluczowe elementy organizmów i uczestniczą w licznych szlakach molekularnych, takich jak metabolizm komórkowy, struktura komórki, sygnalizacja komórkowa, odpowiedzi immunologiczne, adhezja komórkowa i inne. Podczas gdy niektóre białka pełnią swoje funkcje niezależnie, większość z nich oddziałuje z innymi białkami za pośrednictwem powierzchni wiązania w celu koordynacji właściwej aktywności biologicznej1.
Oddziaływania biomolekularne można klasyfikować głównie na podstawie odrębnych cech strukturalnych i funkcjonalnych zaangażowanych białek2, na przykład w zależności od powierzchni białek, stabilności kompleksu lub trwałości oddziaływań3. Identyfikacja kluczowych białek i ich ról w oddziaływaniach biomolekularnych jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów biochemicznych na poziomie molekularnym4. Obecnie stosuje się różne podejścia do wykrywania tych oddziaływań5: in vitro6, in silico7, w żywych komórkach8, ex vivo9 oraz in vivo10, z których każde posiada własne zalety i wady.
Badania in vivo są przeprowadzane z wykorzystaniem całego organizmu jako narzędzia eksperymentalnego11, natomiast badania ex vivo wykonuje się na ekstraktach tkankowych lub całych organach (np. sercu, mózgu, wątrobie) w kontrolowanym środowisku zewnętrznym, wprowadzając minimalne zmiany w warunkach naturalnych. Najczęstszym zastosowaniem badań in vivo i ex vivo jest ocena farmakokinetyki, farmakodynamiki oraz efektów toksyczności potencjalnych czynników farmakologicznych przed rozpoczęciem badań na ludziach, w celu zapewnienia ich ogólnego bezpieczeństwa i skuteczności12.
Interakcje biomolekularne mogą być wykrywane również wewnątrz żywych komórek. Obrazowanie żywych komórek pozwala nam obserwować dynamiczne interakcje podczas przeprowadzania reakcji konkretnego szlaku biochemicznego13. Co więcej, techniki detekcji, takie jak bioluminescencja lub fluorescencyjny transfer energii, mogą dostarczyć informacji o tym, gdzie i kiedy te interakcje zachodzą wewnątrz komórki14. Chociaż detekcja w żywych komórkach dostarcza kluczowych szczegółów, metodologie te opierają się na optyce i znacznikach, które mogą nie odzwierciedlać naturalnej biologii; są one również mniej kontrolowane niż metody in vitro i wymagają specjalistycznej wiedzy do ich przeprowadzenia15.
Metody obliczeniowe in silico są wykorzystywane przede wszystkim do wielkoskalowego przesiewania cząsteczek docelowych przed przeprowadzeniem eksperymentów in vitro. Do ugruntowanych narzędzi in silico należą m.in. metody predykcji obliczeniowej, komputerowe bazy danych, dokowanie molekularne, ilościowe zależności struktura-aktywność oraz inne podejścia oparte na symulacjach dynamiki molekularnej16. W porównaniu do pracochłonnych technik eksperymentalnych, narzędzia in silico pozwalają na łatwe tworzenie predykcji o wysokiej czułości, lecz z ograniczoną dokładnością wyników prognostycznych17.
In vitro analizy wykonuje się z wykorzystaniem mikroorganizmów lub cząsteczek biologicznych poza ich naturalnym kontekstem biologicznym. Przedstawianie oddziaływań biomolekularnych za pomocą metod in vitro jest kluczowe dla zrozumienia funkcji białek oraz biologii stojącej za złożoną siecią funkcjonowania komórki. Preferowaną metodologię analizy dobiera się w zależności od wewnętrznych właściwości białka, wartości kinetycznych oraz sposobu i intensywności oddziaływań18,19.
Oddziaływanie Hsp90/Cdc37: 
Ścieżka chaperonowo-kinazowa, łącząca Hsp90 i Cdc37, stanowi obiecujący cel terapeutyczny w biologii nowotworów20. Hsp90 odgrywa centralną rolę w kontroli cyklu komórkowego, składaniu białek, przeżywalności komórek i szlakach sygnalizacyjnych. Białka, których funkcje zależą od Hsp90, są dostarczane do Hsp90 w celu utworzenia kompleksu za pośrednictwem ko-chaperonu, takiego jak Cdc37. Kompleks Hsp90/Cdc37 kontroluje fałdowanie większości kinaz białkowych i służy jako centrum dla wielu wewnątrzkomórkowych sieci sygnalizacyjnych21. Ze względu na podwyższoną ekspresję w różnych nowotworach, w tym w ostrej białaczkowej leukemii szpikowej, szpiczaku mnogim i raku wątrobowokomórkowym, jest on obiecującym celem przeciwnowotworowym22,23.
Powszechnie stosowane in vitro techniki detekcji oddziaływań biomolekularnych 
Koimmunoprecypitacja (co-IP) to technika opierająca się na specyficzności antygen-przeciwciało, służąca do identyfikacji biologicznie istotnych oddziaływań24Główną wadą tej metody jest brak możliwości wykrywania oddziaływań o niskim powinowactwie oraz wartości kinetycznych.24Do wyznaczania wartości kinetycznych preferowane są metody biofizyczne, takie jak izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC), rezonans plazmonowy powierzchniowy (SPR), interferometria warstwy biologicznej (BLI) oraz technologia FEB.
ITC jest biofizyczną metodą detekcji opartą na wyznaczaniu energii wiązania wraz z pełną analizą termodynamiczną w celu scharakteryzowania oddziaływań biomolekularnych25. Główną zaletą ITC jest to, że nie wymaga ona żadnego znakowania ani unieruchamiania białka docelowego. Główne trudności związane z ITC to wysokie stężenie białka docelowego wymagane dla jednego eksperymentu oraz trudności w analizie kompleksów niekowalencyjnych ze względu na małe entalpie wiązania26. Zarówno SPR, jak i BLI są bezznakowymi technikami biofizycznymi, które opierają się na unieruchomieniu cząsteczki docelowej na powierzchni sensora, a następnie na kolejnych wtryskach anality do unieruchomionego celu27,28. W SPR mierzone są zmiany współczynnika załamania światła podczas oddziaływań biomolekularnych27; w BLI interferencja światła odbitego jest rejestrowana w czasie rzeczywistym jako zmiana długości fali w funkcji czasu28. Zarówno SPR, jak i BLI dzielą wspólne zalety w postaci wysokiej specyficzności, czułości i możliwości detekcji29. W obu metodach białko docelowe jest unieruchomiane na powierzchniach biosensorów, co może prowadzić do częściowej utraty natywnej konformacji celu, co z kolei utrudnia rozróżnienie między oddziaływaniami specyficznymi a niespecyficznymi30. BLI wykorzystuje drogie, jednorazowe światłowodowe biosensory do unieruchamiania celu, co czyni tę technikę kosztowną31. W porównaniu z tymi ugruntowanymi narzędziami detekcji biomolekularnej, technologia FEB oferuje niezawodną i bezznakową platformę, wykorzystując niskie stężenia nanomolarne do detekcji biomolekularnej w czasie rzeczywistym wraz z charakterystyką kinetyczną. Technologia FEB rozwiązuje również problemy z powstawaniem pęcherzyków powietrza występujące w ITC i jest bardziej efektywna kosztowo w porównaniu do SPR lub BLI.
Biosensory oparte na tranzystorach polowych (FET) stanowią rozwijającą się dziedzinę wykrywania oddziaływań biomolekularnych, oferując różnorodne zastosowania biomedyczne. W systemie FET cele są unieruchamiane na chipach biosensora, a oddziaływania są wykrywane poprzez zmiany konduktancji32. Unikalną cechą, którą należy uwzględnić przy opracowywaniu wydajnego elektronicznego biosensora, są właściwości fizykochemiczne, takie jak charakter półprzewodnikowy i stabilność chemiczna materiału powłoki używanego do wytwarzania powierzchni sensora33. Konwencjonalne materiały, takie jak krzem stosowany w FET, ograniczają czułość sensorów, ponieważ wymagają one warstw tlenku umieszczonych pomiędzy kanałem tranzystora a specyficznym środowiskiem niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania34. Co więcej, tranzystory krzemowe są wrażliwe na środowiska o wysokim zasoleniu, co utrudnia pomiar oddziaływań biologicznych w ich naturalnym środowisku. Jako alternatywę przedstawia się biosensor oparty na grafenie, ponieważ oferuje on doskonałą stabilność chemiczną i pole elektryczne. Ponieważ grafen jest pojedynczą warstwą atomową węgla, jest on jednocześnie niezwykle czuły jako półprzewodnik i chemicznie kompatybilny z roztworami biologicznymi; obie te cechy są pożądane przy tworzeniu kompatybilnych elektronicznych biosensorów35. Wyjątkowy, ultrawysoki potencjał obciążenia biomolekułami oferowany przez biosensory powlekane grafenem prowadzi do rozwoju technologii biosensorów FEB opartych na grafenie.
Zasada technologii FEB: FEB jest bezetykietową techniką detekcji biomolekularnej, która mierzy prąd elektryczny przepływający przez biosensor grafenowy, do którego unieruchomione są docelowe cząsteczki wiążące. Oddziaływania między unieruchomionym białkiem a analitem prowadzą do zmian natężenia prądu monitorowanych w czasie rzeczywistym, co umożliwia dokładne pomiary kinetyczne36.
Instrumentacja: System FEB składa się z chipa sensora z tranzystora polowego z grafenową bramką (gFET) oraz czytnika elektronicznego, który przykłada stałe napięcie przez cały czas trwania eksperymentu (Rycina 1). Analit w formie roztworu nanosi się na białko docelowe unieruchomione na powierzchni biosensora. W momencie zajścia interakcji mierzona i rejestrowana w czasie rzeczywistym jest zmiana natężenia prądu. Wraz ze wzrostem stężenia analitu zwiększa się frakcja związanego analitu, co powoduje większe zmiany natężenia prądu. Przy użyciu oprogramowania do zautomatyzowanej analizy dostarczonego z urządzeniem (Tabela materiałów), mierzona i rejestrowana jest odpowiedź prądowa (I-Response) wyrażona w jednostkach biosensingowych (BU)37. Odpowiedź I-Response definiuje się jako zmianę natężenia prądu (I) przepływającego przez chip biosensora, mierzoną w czasie rzeczywistym podczas interakcji unieruchomionego celu z analitem. Oprogramowanie do zautomatyzowanej analizy FEB może analizować zarówno I-Response, jak i odpowiedź pojemnościową (C-Response) w odpowiedzi na dynamiczne zdarzenia interakcji, gdzie C-Response rejestruje zmiany pojemności (C). Wariacje zarówno w I-Response, jak i C-Response odpowiadają bezpośrednio frakcji związanego analitu i mogą być dalej analizowane w celu wyznaczenia wartości KD. Domyślnym ustawieniem oprogramowania do zautomatyzowanej analizy jest I-Response.
<img alt="Układ biosensora; powierzchnia grafenowa; elektrody; odczytnik elektroniczny; unieruchomiony cel; schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd układu doświadczalnego. (A) Chip oparty na grafenie oraz odczytnik elektroniczny. (B) Przegląd komponentów chipa. Chip jest przymocowany do dwóch elektrod dostarczających prąd do systemu. Powierzchnia chipa pokryta jest grafenem, który po aktywacji może wiązać cel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Metodologia: 
W pierwszej kolejności aktywowany chip biosensora jest wkładany do urządzenia FEB (Rycina 1), a następnie wykonuje się następujące kroki: (1) Kalibracja: Eksperyment rozpoczyna się od kalibracji systemu przy użyciu 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS; pH = 7.4) w celu utworzenia bazowej odpowiedzi równowagowej. (2) Asocjacja: Analit jest wprowadzany na chip, a odpowiedź prądową (I-Response) monitoruje się do momentu osiągnięcia nasycenia wiązania. (3) Dysocjacja: Analit jest dysocjowany przy użyciu 1x PBS. (4) Regeneracja: Pozostałości analitu są usuwane przy użyciu 1x PBS. (5) Płukanie: Wykonuje się łącznie pięć cykli płukania przy użyciu 1x PBS w celu dokładnego usunięcia związanych i niezwiązanych analitów z chipa.
Analiza: 
Analiza danych jest przeprowadzana przy użyciu w pełni zautomatyzowanego oprogramowania dostarczonego wraz z urządzeniem. Oprogramowanie do automatycznej analizy generuje wykres dopasowania wg równania Hilla z wyznaczoną wartością KD. Wykres dopasowania wg równania Hilla opisuje asocjację anality przez białko docelowe w funkcji stężeń anality. Stężenie, przy którym osiągnięto połowiczną odpowiedź maksymalną, jest proporcjonalne do wartości KD. Niska wartość KD oznacza wysoką powinowatość wiązania i na odwrót.
Aby zwalidować dane uzyskane z eksperymentu FEB, wartości I-Responses są wyodrębniane z każdego punktu odczytu dla każdego stężenia analitycznego przy użyciu oprogramowania do przeglądania/eksportu danych i mogą zostać wyeksportowane do innego oprogramowania do analizy statystycznej (patrz Tabela materiałów), zgodnie z poniższym wyjaśnieniem.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie do automatycznej analizy</td><td>Oprogramowanie Agile plus, Cardea (Nanomed)</td><td>NA Numer CAS: NA</td><td>Określany w tekście jako oprogramowanie do automatycznej analizy dostarczone z urządzeniem. Generuje zautomatyzowaną analizę.</td></tr><tr><td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td><td>Oprogramowanie Agile plus, Cardea (Nanomed)</td><td>NA Numer CAS: NA</td><td>biosensor chip</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przeglądu danych</td><td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td><td>NA Numer CAS: NA</td><td>Określany w tekście jako dostarczone oprogramowanie do przeglądu danych. Dostarczany z urządzeniem i umożliwia przeglądanie i eksport punktów danych informacyjnych.</td></tr><tr><td>Worek do dializy</td><td>CelluSep,&nbsp; Produkty filtracji membranowej</td><td>T2-10-15 Numer CAS: NA</td><td>Przewody T2 (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm &Oslash;, 0.32ml/cm, 15m)</td></tr><tr><td>EDC (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiiimid)</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>EDC160322-02 Numer CAS: 25952-53-8</td><td>System</td></tr><tr><td>ITC (kalorymetria miareczkowa izotermiczna)</td> w postaci białego proszku <td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, Wielka Brytania)</td><td>NA Numer CAS: Bufor NA</td><td></td></tr><tr><td>MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy)</td><td>Merck</td><td>M3671-50G Numer CAS: 4432-31-9</td><td></td></tr><tr><td>Chipsy NHS (N-hydroksysulfosuccinimid)</td> w postaci białego proszku <td>Cardea (Nanomed)</td><td>NA Numer CAS: NA</td><td>Chip na bazie grafenu</td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) X 10</td><td>Bio-Lab</td><td>001623237500&nbsp; Numer CAS: 7758-11-4</td><td>Płynny przezroczysty roztwór</td></tr><tr><td>Pipete</td><td>Thermo Scientific</td><td>11855231 Numer CAS: NA</td><td>Finnpipette F3 5-50 &micro; L, żółty</td></tr><tr><td>Quench 1 (3,9 mM amino-PEG5-alcohol w 1 X PBS)</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>0105-001-002-001 Numer CAS: NA</td><td>Płynny, przezroczysty roztwór</td></tr><tr><td>Quench 2 (1 M etanoloamina (pH = 8,5))</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>0105-001-003-001 Numer CAS: NA</td><td>Płynny, przezroczysty roztwór</td></tr><tr><td>Rekombinowane białko Cdc37</td><td>Abcam</td><td>ab256157 Numer CAS: NA</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko Hsp90 beta</td><td>Abcam</td><td>ab80033 Numer CAS: NA</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz kalkulacyjny</td><td>Excel, Microsoft office</td><td>NA Numer CAS: NA</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne</td><td>GraphPad, Prism</td><td>NA Numer CAS: NA</td><td>Określany jako inne oprogramowanie statystyczne. Można również użyć wykresu Sigma, fitonu lub innych programów statystycznych</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>NHS160321-07 Numer CAS: 106627-54-7</td><td>Biały proszek</td></tr><tr><td>Końcówki</td><td>Alex czerwony</td><td>LC 1093-800-000 Numer CAS: NA</td><td>Końcówka 1-200 &mikro; l, luzem, 1 000 szt</td></tr></tbody></table>

badanie interakcji biomolekularnych między molekularnym chaperonem hsp90 a jego klientem, kinazą białkową cdc37, przy użyciu technologii biodetekcji z efektem polowym

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Interakcje biomolekularne odgrywają wszechstronne role w licznych procesach komórkowych, regulując i koordynując funkcjonalnie istotne zdarzenia biologiczne. Biomolekuły, takie jak białka, węglowodany, witaminy, kwasy tłuszczowe, kwasy nukleinowe i enzymy, są podstawowymi elementami budulcowymi istot żywych; Łączą się w złożone sieci w biosystemach, aby zsynchronizować niezliczone wydarzenia życiowe. Białka zazwyczaj wykorzystują złożone sieci interaktomu do wykonywania swoich funkcji; Dlatego obowiązkowa jest ocena takich interakcji, aby rozwikłać ich znaczenie w komórkach zarówno na poziomie komórkowym, jak i organizmu. W tym celu wprowadzamy szybko rozwijającą się technologię, biodetekcję z efektem pola (FEB), w celu określenia określonych interakcji biomolekularnych. FEB to laboratoryjna, bezznacznikowa i niezawodna technika wykrywania biomolekularnego do określania określonych interakcji i wykorzystująca wysokiej jakości bioczujniki elektroniczne. Technologia FEB może monitorować interakcje w zakresie nanomolowym dzięki biokompatybilnym nanomateriałom zastosowanym na powierzchni bioczujnika. Jako dowód słuszności koncepcji, wyjaśniono interakcję białko-białko (PPI) między białkiem szoku cieplnego 90 (Hsp90) a cyklem podziału komórki 37 (Cdc37). Hsp90 jest zależnym od ATP molekularnym chaperonem, który odgrywa istotną rolę w fałdowaniu, stabilności, dojrzewaniu i kontroli jakości wielu białek, regulując w ten sposób wiele ważnych funkcji komórkowych. Cdc37 jest uważany za molekularny białkowy opiekuńczy specyficzny dla kinazy białkowej, ponieważ specyficznie rozpoznaje i rekrutuje kinazy białkowe do Hsp90 w celu regulacji ich dalszych szlaków transdukcji sygnału. W związku z tym Cdc37 jest uważany za współopiekuna Hsp90. Szlak kinazy opiekuńczej (kompleks Hsp90 / Cdc37) jest hiperaktywowany w wielu nowotworach złośliwych, sprzyjając wzrostowi komórek; W związku z tym jest potencjalnym celem terapii przeciwnowotworowej. Niniejsze badania demonstrują skuteczność technologii FEB z wykorzystaniem systemu modelu Hsp90/Cdc37. FEB wykrył silny PPI między tymi dwoma białkami (wartości KD 0,014 μM, 0,053 μM i 0,072 μM w trzech niezależnych eksperymentach). Podsumowując, FEB to bezetykietowa i ekonomiczna platforma do wykrywania PPI, która oferuje szybkie i dokładne pomiary.

Wyniki z eksperymentu 1: 
Białko docelowe Hsp90 (500 nM) unieruchomiono na chipie zgodnie z opisanym powyżej protokołem unieruchamiania celu. W pierwszym eksperymencie przygotowano 10 stężeń białka analitycznego, Cdc37, w zakresie od 25 nM do 5 000 nM, w oparciu o dane dostępne w literaturze (patrz Tabela 1).
Etapy eksperymentu można monitorować w czasie rzeczywistym, obserwując zmiany zachodzące w I-Response (Rysunek 3A). Możn...

Biosensing (FEB) to bezznacznikowa technika wykrywania interakcji biomolekularnych. Mierzy prąd elektryczny przepływający przez bioczujnik grafenowy, do którego unieruchomione są cele wiążące. Do oceny interakcji biomolekularnych między Hsp90 i Cdc37 wykorzystano technologię FEB i wykryto silną interakcję między tymi dwoma białkami.

Badanie interakcji biomolekularnych między molekularnym chaperonem Hsp90 a jego klientem, kinazą białkową Cdc37, przy użyciu technologii biodetekcji z efektem polowym

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEB to niewymagająca etykiet i ekonomiczna platforma do wykrywania interakcji ______ _______, która oferuje szybkie i dokładne pomiary. Metoda ta umożliwia walidację znanych lub nieznanych interakcji oraz łatwy sposób testowania potencjalnych inhibitorów oddziaływań biomolekularnych. Główną zaletą FEB jest zautomatyzowane, przyjazne dla użytkownika oprogramowanie, które prowadzi użytkownika przez cały eksperyment za pomocą otwartej, ręcznej platformy do pipetowania, umożliwiając użytkownikom pracę z niewielkim lub nawet zerowym szkoleniem.Technologia FEB oferuje również zastosowania w różnych dziedzinach farmacji, analizie biomolekularnej małych cząsteczek, peptydów i białek, walidacji leków poprzez łatwe przełożenie aktywności biologicznej in vitro na skuteczność in vivo. Będąc początkującym, możesz napotkać wyzwania związane z wyborem odpowiednich stężeń analitu, aby zoptymalizować eksperyment w celu uzyskania wiarygodnej wartości KD. Radzimy zwrócić uwagę na proces funkcjonalizacji chipa i prawidłową wymianę.Rozpocząć od zmieszania równych objętości roztworu EDC i sulfo-NHS, pipetując w górę iw dół. Umieść chip biosensora dostarczony przez firmę na szklanej szalce Petriego z dopasowaną pokrywką. Sugeruje się, że wszystkie etapy funkcjonalizacji związane z aktywacją chipa są wykonywane na szalce Petriego.Nałóż 50 mikrolitrów jednomolowego buforu MES na chip biosensora. Inkubować przez minutę w temperaturze pokojowej. Następnie należy odessać bufor i natychmiast nałożyć 50 mikrolitrów roztworu sulfo-NHS EDC na chip czujnika.Przykryj szalkę Petriego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór EDC sulfo-NHS z chipa i nałożyć 50 mikrolitrów jednomolowego buforu MES. Odessać bufor MES i dwukrotnie przepłukać chip 50 mikrolitrami 1X PBS.Odessać PBS z chipa i dodać cząsteczkę docelową Hsp90. Przykryj szklaną szalkę Petriego i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać roztwór zawierający cząsteczkę docelową i spłukać trzykrotnie 50 mikrolitrami 1X PBS.Odessać roztwór 1X PBS z chipa i dodać 50 mikrolitrów jednego roztworu hartowania. Przykryj szklaną szalkę Petriego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zassać jeden roztwór hartowniczy z chipa i dodać 50 mikrolitrów roztworu do gaszenia dwóch.Przykryj szklaną szalkę Petriego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać roztwór hartowniczy dwa z chipa i przepłukać chip pięć razy za pomocą 50 mikrolitrów 1X PBS, pozostawiając ostatnią kroplę PBS na czujniku. Przygotować serię rozcieńczeń analitu dla Cdc37 w żądanym zakresie stężeń.Zaprojektuj eksperyment tak, aby obejmował co najmniej osiem różnych stężeń analitu w celu uzyskania wiarygodnej stałej dysocjacji lub wartości KD, i przygotuj te różne rozcieńczenia w tym samym buforze używanym do kalibracji i białka docelowego. Ostrożnie przyłóż chip do instrumentu. Upewnij się, że oprogramowanie jest włączone, a dioda LED zmieni kolor na zielony.Następnie naciśnij moduł Uruchom eksperyment w zautomatyzowanym oprogramowaniu i wybierz 10 punktów z regeneracją lub dowolny inny żądany protokół. Wypełnij szczegóły, takie jak nazwa operatora, nazwa eksperymentu, data, bufor regeneracyjny, unieruchomiony cel i analit w roztworze. Naciśnij przycisk Rozpocznij eksperyment wyświetlany na oprogramowaniu i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi przez zautomatyzowane oprogramowanie.Aby przeprowadzić kalibrację przyrządu, należy odessać pozostały roztwór PBS z chipa i nałożyć 50 mikrolitrów bufora kalibracyjnego. Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj pięć minut, aż etap kalibracji zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy określony dla etapu kalibracji z alarmem ostrzegawczym w celu podjęcia dalszych działań.Następnie wykonaj asocjację analitu, odsysając bufor kalibracyjny z chipa i stosując 50 mikrolitrów o najniższym stężeniu analitu. Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj pięć minut, aż krok kojarzenia zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy kroku asocjacji z alarmem ostrzegawczym, aby kontynuować.Aby przeprowadzić dysocjację analitu, należy odessać roztwór analitu z chipa i nałożyć 50 mikrolitrów buforu dysocjacyjnego. Naciśnij przycisk kontynuacji. Po upływie czasu trwania kroku dysocjacji oprogramowanie wyświetla punkt końcowy kroku dysocjacji z alarmem ostrzegawczym.Następnie przeprowadź regenerację chipa, odsysając roztwór dysocjacyjny z chipa i nakładając 50 mikrolitrów bufora regeneracyjnego. Następnie naciśnij przycisk Kontynuuj. Etap regeneracji trwa zwykle około 30 sekund.Następnie oprogramowanie wyświetla punkt końcowy etapu regeneracji z alarmem ostrzegawczym, który należy podjąć. Na koniec, aby umyć chip, odessać roztwór regeneracyjny z chipa i nałożyć 50 mikrolitrów buforu do płukania. Odessać roztwór z chipa i powtórzyć to pięć razy.Pozostaw ostatnią kroplę buforu do płukania na chipie. Następnie naciśnij przycisk Kontynuuj i odczekaj 30 sekund, aż czas trwania kroku prania zakończy się na wyświetlaczu oprogramowania. Powtórz kroki dla każdego zastosowanego stężenia analitu.Pięć etapów kalibracji, asocjacji analitu, dysocjacji, regeneracji i pięciokrotnego mycia stanowi jeden cykl. Naciśnij przycisk Analiza w oprogramowaniu do automatycznej analizy po zakończeniu eksperymentu. Pojawi się okno wyświetlania zawierające wszystkie punkty eksperymentalne.Upewnij się, że stężenia analitu stosowane w zalecanym protokole są prawidłowe. Naciśnij przycisk Uruchom analizę, aby automatycznie wygenerować wartość KD. Oprogramowanie generuje wykres dopasowania wzgórza, wykreślając stężenia analitu w stosunku do odpowiednich odpowiedzi I, na podstawie których obliczana jest stała dysocjacji w stanie równowagi.Docelowe białko Hsp90 zostało unieruchomione na chipie, a do pierwszego eksperymentu przygotowano 10 koncentracji białka analitu Cdc37 w zakresie od 25 nanomolowców do 5 000 nanomolowców. Pliki danych wygenerowane z pierwszego eksperymentu zostały pokazane tutaj. Dane eksperymentalne monitorowane w czasie rzeczywistym są pokazane tutaj.Oś Y odpowiada odpowiedzi I w jednostkach biosensorów, a oś X odpowiada różnym punktom czasowym i stężeniom analitu w eksperymencie. Przedstawiony tutaj obraz graficzny przedstawia wykres dopasowania wzgórza wygenerowany przez oprogramowanie do automatycznej analizy. Oś Y odpowiada odpowiedzi I w jednostkach biosensorów, a oś X odpowiada różnym stężeniom analitu w eksperymencie.Przedstawiony tutaj obraz graficzny przedstawia wykres asocjacyjny wygenerowany za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Oś Y odpowiada odpowiedzi I na końcu fazy asocjacji, a oś X odpowiada różnym stężeniom analitu Cdc37. W drugim eksperymencie użyto innego zestawu stężeń w zakresie od 0,4 nanomola do 200 nanomolów, a wygenerowane pliki danych pokazano tutaj.Obrazy graficzne reprezentują termogram ITC interakcji Hsp90 i Cdc37. Pokazano tutaj odpowiednie krzywe wydzielania ciepła uzyskane w wyniku kolejnych wstrzyknięć Cdc37 do Hsp90 o temperaturze 298,15 kelwinów. Użyta tutaj moc różnicowa jest funkcją czasu.Zintegrowane punkty danych na tym wykresie wyznaczają odpowiednie znormalizowane ciepło w funkcji współczynnika Muellera Hsp90 do Cdc37. Zastosowane tutaj podejście do pipetowania otwartego wymaga, aby użytkownik posiadał podstawowe umiejętności pipetowania ręcznego i uważał, aby nie dotykać końcówką bioczujnika. Powtarzalność taktowania kroku zależy wyłącznie od użytkownika.Gdy badacz scharakteryzuje interakcję między dwiema biomolekułami, możemy przeprowadzić eksperyment przesiewowy, projektując potencjalne inhibitory lub modulatory ukierunkowane na określoną interakcję biomolekularną za pomocą systemu FEB. Procedura ta może być wykorzystana do identyfikacji, weryfikacji i ilościowego określenia znanych i nowych interakcji między białkami, a także małymi cząsteczkami, w tym lekami i peptydami.

exploring-biomolecular-interaction-between-molecular-chaperone-hsp90

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie pokazujemy test jednorodności zbliżeniowej ze wzmocnioną luminescencją - test zbliżeniowy oparty na koralikach. Wykorzystuje kulki akceptora i dawcy o jednorodnej wielkości, unieruchomione dwoma białkami, które mają tendencję do oddziaływania w celu przesiewania potencjalnych małych cząsteczek hamujących interakcje białek.

Amplifikowany luminescencyjny test jednorodny zbliżeniowy: Test zbliżeniowy oparty na kulkach do badania przesiewowego małych cząsteczek hamujących interakcje białko-białko

W tym filmie opisujemy technologię biodetekcji z efektem polowym (FEB) do wykrywania i ilościowego określania interakcji białko-białko. Białka docelowe unieruchomione na biosensorze grafenu oddziałują z białkami analitu w roztworze, powodując zmiany prądu elektrycznego w systemie FEB. Ta zmiana w odpowiedzi elektrycznej wskazuje na powinowactwo wiązania między białkami.

Biodetekcja polowa oparta na biosensorach grafenowych do wykrywania interakcji białko-białko

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

To badanie opisuje techniki biofizyczne, biochemiczne i molekularne do scharakteryzowania aktywności opiekuńczej Escherichia coli HdeB w warunkach kwaśnego pH. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane do innych opiekuńczych chroniących przed kwasami, takich jak HdeA, i mogą być modyfikowane tak, aby działały w przypadku innych białek opiekuńczych i warunków stresu.

Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Ten protokół przedstawia technikę badania interakcji białko-białko za pomocą koralików donorowych połączonych z glutationem z ko-chaperonami z motywem TPR i koralikami akceptorowymi sprzężonymi z peptydem pochodzącym z Hsp90. Wykorzystaliśmy tę technikę do badań przesiewowych małych cząsteczek w celu zakłócenia interakcji Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52 i zidentyfikowaliśmy silne i selektywne inhibitory interakcji Hsp90-FKBP51.

Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek

Ten protokół demonstruje aktywność białka szoku cieplnego 70 (Hsp70). Komórki E. coli dnaK756 służą jako model dla testu, ponieważ zawierają natywny, funkcjonalnie upośledzony Hsp70, co czyni je podatnymi na stres cieplny. Heterologiczne wprowadzenie funkcjonalnego Hsp70 ratuje niedobór wzrostu komórek.

Test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj bezetykietową detekcję interakcji białkowych Hsp90 i Cdc37 przy użyciu biosensingu z efektem polowym. Ta metoda umożliwia szybkie i precyzyjne badanie wiązań biomolekularnych w badaniach biofizycznych.

Badanie interakcji biomolekularnych między molekularnym chaperonem Hsp90 a jego klientem, kinazą białkową Cdc37, przy użyciu technologii biodetekcji z efektem polowym (Wideo) | JoVE Journal

Badanie interakcji biomolekularnych między molekularnym chaperonem Hsp90 a jego klientem, kinazą białkową Cdc37, przy użyciu technologii biodetekcji z efektem polowym

Przeglądaj więcej filmów