Name: Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Poznaj metodę reporterową do analizy dojrzewania mikroRNA w komórkach ssaków. Protokół wykorzystuje transfekcję plazmidów i pomiar aktywności lucyferazy do badania wpływu białek wiążących RNA na biogenezę mikroRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy są wdzięczni E. Makeyevowi (Nanyang Technological University, Singapur) za komórki HeLa-Cre oraz plazmidy pRD-RIPE i pCAGGS-Cre. Dziękujemy Ednie Kimurze, Carolinie Purcell Goes, Giseli Ramos, Lucii Rossetti Lopes i Anselmo Moriscotowi za ich wsparcie.

Przegląd opisanego tutaj protokołu jest przedstawiony w Rysunek 1.
1. Budowa plazmidu
<ol>
	<li>pCAGGS-Cre: Ten plazmid został dostarczony przez Dr. E. Makeyev21.</li>
	<li>pRD-miR-17-92:
	<ol>
		<li>Amplifikuj pre-miR-17-92 metodą PCR przy użyciu 0,5 μM każdego specyficznego startera (tabela materiałów), 150 ng cDNA, 1 mM dNTP, 1x bufor Taq PCR i 5 U polimerazy DNA Taq o wysokiej wierności. Wykonaj reakcję PCR bez użycia matrycy (użyj wody zamiast cDNA), aby sprawdzić, czy DNA nie jest zanieczyszczone.</li>
		<li>Zliżuj produkt PCR do pRD-RIPE (uprzejmie dostarczony przez Dr. E. Makeyev, Nanyang Technological University, Singapur) 21 wewnątrz intronu między miejscami restrykcyjnymi EcoRI i EcoRV za pomocą ligazy DNA, tworząc pRD-miR-17-92. Potwierdź integralność sekwencji za pomocą sekwencjonowania Sangera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pmiRGLO-RAP-IB
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu otoczone miejscami restrykcyjnymi XhoI/XbaI i z jednym miejscem restrykcyjnym NotI wewnątrz. Zmieszać równomolowe ilości starterów do przodu i do tyłu i inkubować mieszaninę w temperaturze 90 °C przez 5 minut, a następnie przenieść do temperatury 37 °C na 15 minut. Jako kontrole użyj starterów z zaszyfrowanymi sekwencjami docelowymi (Tabela materiałów).</li>
		<li>Rozszczepić wyżarzone fragmenty za pomocą enzymów restrykcyjnych XhoI/XbaI i podlikulować je za sekwencją luc2 do pmiR-GLO, tworząc konstrukcje reporterowe pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) i pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). Potwierdź podwiązanie za pomocą NotI cleavage. 
		UWAGA: Upewnij się, że zwisy powstałe po wyżarzaniu gruntu są komplementarne do wektora po reakcji rozszczepienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pFLAG-HuR
	<ol>
		<li>Aby wygenerować plazmid z nadekspresją HuR, amplifikuj sekwencję HuR za pomocą określonych starterów. Wymieszaj 300 ng cDNA, 0,5 μM każdego specyficznego startera, 1 mM mieszanki dNTP, 1x bufor PCR i 5 U polimerazy DNA Taq o wysokiej wierności.</li>
		<li>Związać produkt PCR z pGEM-T i potwierdzić integralność sekwencji DNA za pomocą sekwencjonowania Sangera. Usuń fragment HuR z pGEM-T i sklonuj go do wektora ekspresji ssaków pFLAG-CMV-3, aby wygenerować wektor pFLAG-HuR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
UWAGA: Linia komórkowa HeLa-Cre była prezentem od Dr. E. Makeyev21, a komórka brodawkowatego raka tarczycy (BCPAP) została dzięki uprzejmości Dr. Massimo Santoro (Uniwersytet "Federico II", Neapol, Włochy). Komórka HeLa, komórka brodawkowatego raka tarczycy (BCPAP) i HEK-293T zostały wykorzystane do nadekspresji HuR.
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki w DMEM/wysokim poziomie glukozy uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą, 1 mM pirogronianu sodu, 200 mM L-glutaminy i 1x penicyliną-streptomycyną (100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny) na 100 mm szalkach Petriego, chyba że wskazano inaczej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotną atmosferą (5%CO2).</li>
	<li>Inkubować przylegające komórki z trypsyną/EDTA (0,5% mieszanina roztworu) w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut. Pozwól im oderwać się od płytki (okres inkubacji może się różnić w zależności od typu komórki).</li>
	<li>Wykonaj transfekcję odczynnikiem do transfekcji na bazie lipidów zgodnie z instrukcjami producenta. Upewnij się, że kultury komórkowe są w około 70% zlewne. Stosować podobne ilości DNA dla wszystkich kombinacji transfekcji, jak opisano poniżej, dodając odpowiednie DNA. Przeprowadzanie eksperymentów transfekcji w powtórzeniach.
	<ol>
		<li>Zmieszać 200 ng DNA i 1,25 μl odczynnika do transfekcji w 100 μl pożywki. Dodaj mieszaninę transfekcji do komórek. Inkubować komórki z mieszaninami transfekcji przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie zastąp pożywkę pożywką zawierającą 10% FBS i inkubuj przez kolejne 24 godziny przed dodaniem antybiotyków do selekcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Nadekspresja HuR
<ol>
	<li>Transfekcja pFLAG-HuR i pusta pFLAG do HeLa. Selekcjonuj komórki, zwiększając stężenie genetycyny (G418) (1 μg/ml) ze 100 μg/ml do 1000 μg/ml, tworząc stabilne linie komórkowe.</li>
	<li>Potwierdź nadekspresję za pomocą ilościowej PCR przy użyciu specyficznych starterów dla mRNA HuR, jak opisano w kroku 7.</li>
</ol>
4. Całkowita izolacja RNA
<ol>
	<li>Użyj świeżo pobranych komórek. Trypsynizuj 70% zlewających się kultur komórkowych (do tego testu użyto komórek HeLa-Cre), jak opisano w kroku 2.2.</li>
	<li>Zebrać osad komórkowy przez odwirowanie przez 5 minut w temperaturze 500 x g w temperaturze 4 °C i przemyć go 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami); powtórzyć wirowanie.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml 1x PBS i przenieść go do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zważyć osad z suchymi komórkami i odpowiednio dostosować objętość i rozmiar probówek. 1 mg komórek daje około 1 μg całkowitego RNA.</li>
	<li>W kapturze dodaj 500-1000 μl fenolu/chloroformu do osadu komórkowego (najlepiej 750 μl na 0,25 g komórek) i homogenizuj go, pipetując w górę iw dół i mieszając z wirem.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej (20 °C do 25 °C), aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksów nukleoproteinowych.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 200 μl chloroformu na 1 ml użytego fenolu:chloroformu. Szczelnie zakryj probówki z próbkami.</li>
	<li>Mieszać energicznie przez 15 s (ręcznie lub krótko wirując z mniejszą prędkością) i inkubować w temperaturze pokojowej (20 °C do 25 °C) przez 2 minuty do 3 minut.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Sprawdzić, czy nie ma dolnej czerwonej fazy fenolowo-chloroformowej, fazy pośredniej i bezbarwnej górnej fazy wodnej. RNA pozostaje w górnej fazie wodnej. W okapie zbierz fazę wodną, unikając kontaktu z fazą pośrednią, i przenieś do świeżej probówki.</li>
	<li>Wytrącić RNA, mieszając fazę wodną z 400 μl izopropanolu klasy cząsteczkowej (stosunek 1:1 do zastosowanego fenolu/chloroformu) i 2 μl glikogenu w każdej probówce (pomoże to uwidocznić obecność osadu).</li>
	<li>Mieszać energicznie ręcznie lub homogenizować końcówką przez ~10 s. Inkubować przez 15 minut lub przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 12 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć osad RNA, dodając 3 objętości 100% etanolu (około 1 ml, rozcieńczony wodą DEPC) i wymieszać próbkę przez wirowanie, aż osadek zostanie uwolniony i zacznie unosić się od dna.</li>
	<li>Wirować przy 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyj osad RNA 1x, dodając 1 ml 75% etanolu i wymieszaj próbkę przez wirowanie, aż osadek zostanie uwolniony i unosi się od dna. Powtórzyć wirowanie zgodnie z opisem w kroku 4.17.</li>
	<li>Wykonaj dodatkowe 5-sekundowe wirowanie wirowania, aby zebrać resztki cieczy z boku probówki i usunąć resztki cieczy za pomocą pipety, nie naruszając osadu.</li>
	<li>Krótko wysuszyć osad RNA na powietrzu, otwierając nakrętkę probówki w temperaturze pokojowej na 3-5 minut i rozpuścić osad RNA w 20-50 μl wody uzdatnionej DEPC bez RNaz. Inkubować RNA przez 10 minut w temperaturze 55-60 °C, aby ułatwić ponowne zawieszenie osadu.</li>
</ol>
5. Oznaczanie całkowitego stężenia i jakości RNA
<ol>
	<li>Oznaczyć stężenie RNA, mierząc absorbancję przy 260 nm i 280 nm za pomocą spektrofotometru. Uzyskaj pełne dane spektralne przed użyciem próbek w dalszych zastosowaniach.</li>
	<li>Kontroluj jakość RNA, rozpuszczając 800-1000 ng na 1,5% żelu agarozowym przy użyciu 0,5-krotnego buforu TBE (45 mM zasady Tris, 45 mM kwasu borowego, 1 mM EDTA). Całkowite RNA rozdziela się na dwa pasma odnoszące się do 28S i 18S rRNA.
	<ol>
		<li>Przygotuj wszystkie odczynniki i umyj cały sprzęt używany do uruchamiania żelu wodą uzdatnioną przez DEPC. Woda uzdatniona przez DEPC jest przygotowywana w okapie przez dodanie 1 ml dietylopirowęglanu do 1000 ml ultraczystej wody. Inkubować przez ~2 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 37 °C i sterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 10 miesięcy. 
		UWAGA: Elektroforeza całkowitych RNA ssaków prowadzi do rozdzielenia 28S i 18S rRNA w stosunku około 2:1. Paski powinny być nienaruszone i widoczne jako dwie ostre taśmy. Zdegradowane RNA spowoduje rozmyte prążki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Odwrotna transkrypcja
<ol>
	<li>Ustaw reakcję odwrotnej transkrypcji przy użyciu 1 μg całkowitego RNA.</li>
	<li>Przeprowadzić odwrotną transkrypcję (RT) przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy (patrz tabela materiałów) i 50 ng/μl losowych starterów dekamerowych.
	<ol>
		<li>Wymieszać RNA, losowe startery i 1 mM dNTP mix (10 mM) w 10 μl. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut i na lodzie przez 1 min. Dodać następujące odczynniki: 1x bufor RT, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U inhibitora RNazy i 200 U odwrotnej transkryptazy.</li>
		<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze 25 °C i przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C (temperatury mogą ulec zmianie, jeśli stosowane są różne enzymy). Reakcję należy zakończyć inkubacją w temperaturze 85 °C przez 5 minut. cDNA można przechowywać w temperaturze −20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Ilościowy PCR
<ol>
	<li>Aby zebrać reakcję w końcowej objętości 15 μl, wymieszaj 3 μl cDNA (100 ng/μl), 3,2 pmol każdego startera, 6 μl mieszanki głównej zawierającej dNTP i enzym oraz 2,8 μl ultraczystej wody. 
	UWAGA: Użyj starterów dla endogennych genów konstytutywnych jako kontroli (geny porządkowe), aby znormalizować poziomy ekspresji mRNA i miRNA HuR. β-aktyna i snRNA U6 (RNU6B) są dostępnymi opcjami normalizacji odpowiednio mRNA i miRNA, ale inne geny mogą być również odpowiednie w zależności od przypadku.</li>
	<li>Określ ilościowo poziomy wyrażenia za pomocą metody delta-delta Ct (2-ΔΔCt)20.</li>
</ol>
8. Test reporterowy
<ol>
	<li>Komórki użyte do testu
	<ol>
		<li>Transfekować plazmidy w komórkach HeLa-Cre w następujący sposób. Transfekcja z pTK-Renilla (40 ng), a następnie pRD-miR-17-92, generowanie HeLa-Cre-miR-17-92 i selekcja za pomocą 1 μg/ml puromycyny.</li>
		<li>Transfect HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla oddzielnie z pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR lub pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR. Wybierać za pomocą penicyliny (100 j./ml) i streptomycyny (100 μg/ml). Te transfekcje generują Luc-RAP-1-B i Luc-scrambled.</li>
		<li>Transfekcja komórek za pomocą pFLAG-HuR lub pustego pFLAG (krok 3).</li>
		<li>Przejdź do hodowli komórkowej, jak opisano w kroku 2.2, z HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-scrambled, HeLa-Cre miR-17-92-HuR i HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc do około 80% konfluencji. Indukować 1 μl doksycykliny (1 μg/ml) przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Utrzymuj również wszystkie komórki bez doksycykliny jako kontrole, przez ten sam okres. 
		UWAGA: Końcowe stężenie doksycykliny zależy od wybranej linii komórkowej. Nadmiar doksycykliny może być toksyczny dla komórek ssaków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test luminescencyjny
	<ol>
		<li>Aby określić ilościowo i porównać różne intensywności luminescencji, użyj zestawu do testów reporterowych z podwójną lucyferazy. Rozmrozić roztwory testowe lucyferazy i pozostawić je w temperaturze pokojowej przed rozpoczęciem testu.</li>
		<li>Przygotuj mieszankę Stop i Glo (niebieskie probówki), mieszając 200 μl substratu w 10 ml buforu do oznaczania lucyferazy II. Przygotować mieszaninę LAR II (probówki z zieloną nakrętką), mieszając 10 ml buforu II do testu lucyferazy II z bursztynową fiolką z substratem do oznaczania lucyferazy II i dobrze wstrząsnąć.</li>
		<li>Przenieść roztwory do 15 ml probówek wirówkowych wcześniej zidentyfikowanych i chronionych przed światłem. 
		UWAGA: Alternatywnie roztwory można wcześniej przygotować w podwielokrotnościach o pojemności 1-2 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C, chroniąc przed światłem w folii aluminiowej.</li>
		<li>Wykonaj odczyty luminescencji za pomocą sprzętu takiego jak Synergy; zmierz wyrażoną lucyferazy jako względne jednostki światła (RLU).</li>
		<li>Eksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy statystycznej.</li>
		<li>Wykonaj normalizację aktywności lucyferazy świetlika przez kontrolną Renilla (lucyferaza/Renilla) i wykreśl to jako względne jednostki światła (RLU) na grafice. Powtórz to dla grup z indukcją doksycykliny i bez niej.</li>
		<li>Obliczyć średnią i błąd standardowy średniej (SEM). Wykonaj test t-Studenta lub dwukierunkową ANOVA, a następnie test końcowy Tukeya, aby umożliwić porównanie grup. Analizy te są dostępne w pakiecie takim jak GraphPad Prism. Różnice przy wartościach p < 0,05 są uważane za znaczące.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing+by+the+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNA splicing by the spliceosome.</a> Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).</li>
<li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spliceosome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Spliceosome structure and function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707(2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+structure+of+the+human+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An atomic structure of the human spliceosome.</a> Cell. 169 (5), 918-929 (2017).</li>
<li>Staley, J. P., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+devices+of+the+spliceosome%3A+Motors%2C+clocks%2C+springs%2C+and+things%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things.</a> Cell. 92 (3), 315-326 (1998).</li>
<li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing%3A+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).</li>
<li>Mukherjee, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+regulatory+mapping+indicates+that+the+RNA-binding+protein+HuR+couples+pre-mRNA+processing+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability.</a> Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).</li>
<li>Pandit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+SR+protein+cooperation+and+competition+in+regulated+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing.</a> Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).</li>
<li>Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antigen+R+%28HuR%29+facilitates+miR-19+synthesis+and+affects+cellular+kinetics+in+papillary+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).</li>
<li>Westholm, J. O., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirtrons%3A+MicroRNA+biogenesis+via+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing.</a> Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).</li>
<li>Michlewski, G., Cáceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+control+of+miRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional control of miRNA biogenesis.</a> RNA. 25 (1), 1-16 (2019).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+Target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li>
<li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncomirs+-+MicroRNAs+with+a+role+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li>
<li>Lin, S., Gregory, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+biogenesis+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA biogenesis pathways in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).</li>
<li>Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirtrons%2C+an+emerging+class+of+atypical+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).</li>
<li>Alarcon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HNRNPA2B1+is+a+mediator+of+m%286%29A-dependent+nuclear+RNA+processing+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events.</a> Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).</li>
<li>Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR18a+and+miR19a+recruit+specific+proteins+for+splicing+in+thyroid+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li>
<li>Olive, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-19+is+a+key+oncogenic+component+of+mir-17-92%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92.</a> Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+platform+for+short+hairpin+RNA+interference+and+transgenesis+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).</li>
<li>Huelga, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genome-wide+analysis+reveals+cooperative+regulation+of+alternative+splicing+by+hnRNP+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins.</a> Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).</li>
<li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2%2FASF+is+a+proto-oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).</li>
<li>Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+gene+constraints+and+genomic+context+impact+the+expression+and+evolution+of+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11438(2016).</li>
<li>Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosha+promotes+splicing+of+a+pre-microRNA-like+alternative+exon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon.</a> PLoS Genetics. 10 (5), 1004312(2014).</li>
<li>Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+HuR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of HuR function.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li>
<li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li>
<li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li>
<li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Splicing pre-mRNA jest ważnym procesem regulacji ekspresji genów, a jego kontrola może wywołać silny wpływ na modyfikacje fenotypowe komórek22,23. Ponad 70% miRNA jest transkrybowanych z intronów u ludzi i postawiliśmy hipotezę, że ich przetwarzanie i dojrzewanie może być ułatwione przez splicing białek regulatorowych24,25. Opracowaliśmy metodę analizy przetwarzania i funkcji intronicznego miRNA w hodowan...

Splicing prekursorowych mRNA jest ważnym procesem regulacji ekspresji genów u eukariontów1. Usunięcie intronów i połączenie eksonów w dojrzałym RNA jest katalizowane przez spliceosom, 2-megadaltonowy kompleks rybonukleoprotein składający się z 5 snRNA (U1, U2, U4, U5 i U6) wraz z ponad 100 białkami2,3. Reakcja splicingu zachodzi kotranskrypcyjnie, a spliceosom jest składowany na każdym nowym intronie, kierując się rozpoznaniem konserwatywnych miejsc splicingu na granicach egzon-intron i w obrębie klasy intron<sup='xref'>4. Różne introny mogą mieć różne szybkości splicingu pomimo niezwykłej konserwacji kompleksu spliceosomów i jego składników. Oprócz różnic w zachowaniu miejsca splicingu, sekwencje regulatorowe rozmieszczone na intronach i eksonach mogą kierować białkami wiążącymi RNA (RBP) i stymulować lub hamować splicing5,6. HuR jest powszechnie wyrażanym RBP i jest ważnym czynnikiem kontrolującym stabilność mRNA7. Poprzednie wyniki naszej grupy wykazały, że HuR może wiązać się z intronami zawierającymi miRNA, co wskazuje, że białko to może być ważnym czynnikiem ułatwiającym przetwarzanie i dojrzewanie miRNA, prowadząc również do generowania alternatywnych izoform splicingu6,8,9.
Wiele mikroRNA (miRNA) jest kodowanych z sekwencji intronowych. Podczas gdy niektóre są częścią intronu, inne są znane jako "mirtrony" i są tworzone przez całą klasę intron<sup='xref'>10,11. miRNA to krótkie, niekodujące RNA, o długości od 18 do 24 nukleotydów12. Ich dojrzała sekwencja wykazuje częściową lub całkowitą komplementarność z sekwencjami docelowymi w mRNA, wpływając w ten sposób na szybkość translacji i/lub rozpadu mRNA. Kombinacje miRNA i celów prowadzą komórkę do różnych wyników. Kilka miRNA może napędzać komórki do fenotypów pro- lub przeciwnowotworowych13. Onkogenne miRNA zwykle celują w mRNA, które wywołują charakterystykę supresyjną, prowadzącą do zwiększonej proliferacji komórek, migracji i inwazji14. Z drugiej strony, miRNA supresyjne nowotwory mogą celować w onkogenne mRNA lub mRNA związane ze zwiększoną proliferacją komórek. 
Przetwarzanie i dojrzewanie miRNA jest również zależne od ich pochodzenia. Większość intronowych miRNA jest przetwarzana przy udziale mikroprocesora, utworzonego przez rybonukleazę Drosha i kofaktory białkowe12. Mirtrony są przetwarzane z aktywnością spliceosomu niezależnie od klasy Drosha<sup='xref'>15. Biorąc pod uwagę wysoką częstotliwość miRNA znajdujących się w intronach, postawiliśmy hipotezę, że białka wiążące RNA zaangażowane w splicing mogą również ułatwiać przetwarzanie i dojrzewanie tych miRNA. Warto zauważyć, że RBP hnRNP A2/B1 został już powiązany z mikroprocesorem i biogenezą miRNA16. 
Wcześniej informowaliśmy, że kilka białek wiążących RNA, takich jak hnRNPs i HuR, jest powiązanych z intronowymi miRNA za pomocą spektrometrii mas17. Związek HuR (ELAVL1) z miRNA z klastra intronowego miR-17-92 został potwierdzony za pomocą immunoprecypitacji i analizy in silico9. miR-17-92 to intronowy klaster miRNA składający się z sześciu miRNA o zwiększonej ekspresji w różnych nowotworach18,19. Klaster ten jest również znany jako "oncomiR-1" i składa się z miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b i miR-92a. miR-19a i miR-19b są jednymi z najbardziej onkogennych miRNA tego cluster19. Zwiększona ekspresja HuR stymuluje syntezę miR-19a i miR-19b9. Ponieważ regiony intronowe otaczające ten klaster są związane z HuR, opracowaliśmy metodę badania, czy to białko może regulować ekspresję i dojrzewanie miR-19a i miR-19b. Jednym z ważnych przewidywań naszej hipotezy było to, że jako białko regulatorowe, HuR może ułatwiać biogenezę miRNA, prowadząc do zmian fenotypowych. Jedną z możliwości było to, że miRNA były przetwarzane przez stymulację HuR, ale nie byłyby dojrzałe i funkcjonalne, a zatem działanie białka nie miałoby bezpośredniego wpływu na fenotyp. Dlatego opracowaliśmy test reporterowy splicingu, aby zbadać, czy RBP, taki jak HuR, może wpływać na biogenezę i dojrzewanie intronowego miRNA. Potwierdzając przetwarzanie i dojrzewanie miRNA, nasz test pokazuje interakcję z sekwencją docelową oraz generowanie dojrzałego i funkcjonalnego miRNA. W naszym teście łączymy ekspresję intronowego klastra miRNA z plazmidem lucyferazy, aby sprawdzić wiązanie celu miRNA w hodowanych komórkach.

<table><tbody><tr><td><silny>Rekombinowany DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS-Cre (plazmid kodujący Cre)</td><td></td><td></td><td>Miły prezent od E. Makeyeva z Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pFLAG-HuR</td><td></td><td></td><td>Wygenerowany podczas tej pracy</td></tr><tr><td>pmiRGLO-RAP-IB</td><td></td><td></td><td>Wygenerowany podczas tej pracy</td></tr><tr><td>pmiRGLO-scrambled</td><td></td><td></td><td>Wygenerowany podczas ta praca</td></tr><tr><td>pRD-miR-17-92</td><td></td><td></td><td>Wygenerowane podczas tej pracy</td></tr><tr><td>pRD-RIPE-donor</td><td></td><td></td><td>Miły prezent od E. Makeyev z Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-B-aktyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>anty-HuR</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>mAb&nbsp; 12582</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680CW Kozia anty-mysia IgG</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Koza anty-królicza IgG</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>929-70020</td><td></td></tr><tr><td>Modele eksperymentalne: Linie komórkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Cre</td><td></td><td></td><td>Miły prezent od E. Makeyeva z Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92</td><td></td><td></td><td>Wygenerowane podczas tej pracy</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td><td></td><td></td><td>Wygenerowane podczas tej pracy</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td><td></td><td></td><td>Wygenerowane podczas tej pracy</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-luc</td><td></td><td></td><td>Wygenerowane podczas tej pracy</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-scrambled</td><td></td><td></td><td>Wygenerowane podczas tej pracy</td></tr><tr><td>Chemicals i peptydy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/wysoka glukoza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>BioBasic</td><td>MB719150</td><td></td></tr><tr><td>System oznaczania lucyferazy Dual-Glo</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0271</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0301</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E859-EG</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pFLAG-CMV&trade;-3 Wektor ekspresji</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6783</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polimeraza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10966-030</td><td></td></tr><tr><td>pmiR-GLO</td><td>Promega</td><td>E1330</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>752899</td> SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol-LS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna/EDTA 10X</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Promega</td><td>R616A</td><td></td></tr><tr><td><silne>oligonukleotydy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forward RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT</td><td></td></tr><tr><td>reverse RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>forward scrambled pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAT</td><td></td></tr><tr><td>reverse scrambled pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>forward HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC</td><td></td></tr><tr><td>reverse HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG</td><td></td></tr><tr><td>forward pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG</td><td></td></tr><tr><td>reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG</td><td></td></tr><tr><td>forward snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td><td></td></tr><tr><td>odwrotny snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG</td><td></td></tr><tr><td>naprzód B-aktyna qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td><td></td></tr><tr><td>odwrotny B-aktyna qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td><td></td></tr><tr><td>naprzód HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td><td></td></tr><tr><td>odwrotny HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td><td></td></tr><tr><td>forward pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAAGTG</td><td></td></tr><tr><td>reverse pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG</td><td></td></tr><tr><td>Software and algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 8 dla Mac OS X</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td>https://www.graphpad.com</tr><tr><td>ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia</td><td>http://imagej.nih.gov/ij</td><td></td></tr></tbody></table>

test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikrorna w komórkach ssaków

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

MikroRNA (miRNA) to krótkie cząsteczki RNA, które są szeroko rozpowszechnione u eukariontów. Większość miRNA jest transkrybowana z intronów, a ich dojrzewanie obejmuje różne białka wiążące RNA w jądrze. Dojrzałe miRNA często pośredniczą w wyciszaniu genów, co stało się ważnym narzędziem do zrozumienia zdarzeń potranskrypcyjnych. Poza tym może być badana jako obiecująca metodologia terapii genowych. Obecnie brakuje jednak bezpośrednich metod oceny ekspresji miRNA w hodowlach komórek ssaków. W tym miejscu opisujemy skuteczną i prostą metodę, która pomaga w określaniu biogenezy i dojrzewania miRNA poprzez potwierdzenie jego interakcji z sekwencjami docelowymi. Ponadto system ten umożliwia oddzielenie dojrzewania egzogennego miRNA od jego endogennej aktywności za pomocą promotora indukowanego doksycykliną, zdolnego do kontrolowania pierwotnej transkrypcji miRNA (pri-miRNA) z wysoką wydajnością i niskimi kosztami. Narzędzie to umożliwia również modulację za pomocą białek wiążących RNA w oddzielnym plazmidzie. Oprócz stosowania z wieloma różnymi miRNA i ich odpowiednimi celami, może być dostosowany do różnych linii komórkowych, pod warunkiem, że są one podatne na transfekcję.

Nasza początkowa hipoteza zakładała, że HuR może ułatwiać biogenezę intronowych miRNA poprzez wiązanie się z sekwencją pre-miRNA. Zatem związek między ekspresją HuR a biogenezą klastra miR-17-92 mógłby wskazywać na nowy mechanizm regulujący dojrzewanie tych miRNA. Nadekspresja HuR po transfekcji pFLAG-HuR została potwierdzona w trzech różnych liniach komórkowych: HeLa, BCPAP oraz HEK-293T (Rysunek 2). Jako kontrole wykorzystano komórki nietransfekowane oraz komórki transfekowane pus...

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Nasz protokół dotyczy wpływu białek wiążących regulatorowe RNA na biogenezę i dojrzewanie mikroRNA, bezpośrednio z hodowli komórkowych. Opisana przez nas metoda może być wykonywana przy użyciu zwykłych odczynników do hodowli komórkowych i jest stosunkowo szybka. Metoda ta może być ważna w badaniu fenotypowych efektów mikroRNA i ich celów w różnych typach komórek eukariotycznych.Można użyć komórek normalnych lub podobnych do choroby. Ważne jest, aby wybrać linie komórkowe podatne na transfekcję, przeprowadzić odpowiednie kontrole transfekcji i indukcji, aby zaobserwować zmiany w powinowactwie do celu poprzez aktywność lucyferazy. Na początek utrzymuj komórki w DMEM, uzupełnij wysoki poziom glukozy na 100 milimetrach szalkach Petriego i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze z kontrolowaną atmosferą z 5% dwutlenkiem węgla.Aby odłączyć przylegające komórki, inkubuj je z roztworem trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Aby wykonać transfekcję, wymieszaj 200 nanogramów DNA i 1,25 mikrolitra odczynnika do transfekcji w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej i dodaj mieszaninę transfekcji do komórek. Następnie inkubowa

a-reporter-assay-to-analyze-intronic-microrna-maturation-mammalian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszej pracy opisujemy test wykorzystujący mikroiniekcję w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu dokładnego pomiaru kinetyki eksportu mRNA z jądra w somatycznych komórkach ssaków.

Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

MikroRNA (miRNA) są istotnymi regulatorami ekspresji genów i wykazano, że odgrywają one rolę w licznych procesach biologicznych. Aby lepiej zrozumieć interakcje miRNA-UTR, stworzyliśmy obejmującą cały genom kolekcję reporterów lucyferazy 3' UTR, połączonych z nowym genem lucyferazy i odczynnikiem analitycznym, systemem LightSwitch.

Identyfikacja celów ludzkich mikroRNA za pomocą systemu testowego LightSwitch Luciferase z wykorzystaniem konstruktów reporterowych 3'UTR oraz mimiku mikroRNA w komórkach adherentnych

W tym filmie pokazujemy, że w obecności inhibitora fosfodiestru, cykl komórkowy oocytów zostaje zatrzymany w profazie-I, podczas której transkrybowane mRNA są przechowywane w przypadku braku translacji. Po uwolnieniu inhibitora dojrzewanie oocytów zostaje wznowione, a komórki wchodzą w metafazę. Sygnał reporterowego mRNA połączonego z docelowym genem w metafazie-I wskazuje na aktywację maszynerii translacyjnej i ekspresji białka.

Test reporterowy pojedynczej komórki jajowej in vitro: technika badania docelowej regulacji translacji mRNA podczas dojrzewania oocytów in vitro

Genetyczny test reporterowy jest dobrze znanym i potężnym narzędziem do analizowania relacji między sekwencjami DNA a ich aktywnością regulacyjną genów. Sprzężenie potencjalnych elementów regulatorowych z genami reporterowymi, które przenoszą identyfikujące znaczniki sekwencji, umożliwia masową równoległość tych testów.

Masowo równoległe testy reporterowe w hodowanych komórkach ssaków

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Tutaj proponujemy strategię badania wpływu interesującego czynnika transkrypcyjnego na transkryptom mikroRNA, korzystając z publicznie dostępnych danych, zasobów obliczeniowych i danych o wysokiej przepustowości z macierzy mikroRNA po transfekcji komórek z małą spinką do włosów (sh)RNA ukierunkowaną na interesujący czynnik transkrypcyjny.

Opisywanie zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikroRNA

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

mikro-RNA (miRNA) to krótkie i wysoce homologiczne sekwencje RNA, służące jako posttranskrypcyjne regulatory informacyjnych RNA (mRNA). Obecne metody wykrywania miRNA różnią się czułością i swoistością. Opisujemy protokół, który łączy hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu jednoczesnego wykrywania cząsteczek miRNA i białka na odcinkach tkanki serca myszy.

Specyficzne tkankowo profilowanie ekspresji miRNA w wycinkach serca myszy przy użyciu hybrydyzacji in situ

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

Ten protokół opisuje test reporterowy do badania regulacji translacji mRNA w pojedynczych oocytach podczas dojrzewania in vitro.

Definiowanie programu translacji mRNA matki podczas dojrzewania in vitro przy użyciu testu reporterowego pojedynczego oocytu

Ten protokół opisuje test reporterowy minigenu do monitorowania wpływu mutacji miejsca 5'-splicingu na splicing i rozwija supresorowe U1 snRNA w celu ratowania indukowanego mutacjami hamowania splicingu. Konstrukty reporterowe i supresorowe U1 snRNA ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a splicing jest analizowany przez wydłużenie startera lub RT-PCR.

Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

Poznaj metodę reporterową do analizy dojrzewania mikroRNA w komórkach ssaków. Protokół wykorzystuje transfekcję plazmidów i pomiar aktywności lucyferazy do badania wpływu białek wiążących RNA na biogenezę mikroRNA.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów