Name: Model gryzoni indukowany przez TNBS do badania patogennej roli stresu mechanicznego w chorobie Leśniowskiego-Crohna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Odkryj model TNBS u szczurów do badania roli stresu mechanicznego w chorobie Leśniowskiego-Crohna. Protokół umożliwia analizę zmian mechanicznych w różnych segmentach jelita.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częściowo wspierana przez granty od NIH (R01 DK124611 do XZS) i Departamentu Obrony USA (W81XWH-20-1-0681 do XZS). Prace histologiczne wykonano przy pomocy Pracowni Patologii Chirurgicznej UTMB.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnym komitetem ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania przy University of Texas Medical Branch (#0907051C). Do badania wykorzystano samce lub samice szczurów Sprague-Dawley w wieku ~8-9 tygodni.
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Pościć szczury przez 24 godziny i leczyć je środkiem przeczyszczającym (środek do czyszczenia jelit, patrz tabela materiałów) przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia znieczulij szczury za pomocą systemu anestezjologicznego (patrz tabela materiałów), wystawiając je na działanie 2% izofluranu wraz z 1 l/min tlenu podczas podawania TNBS. Sprawdź, czy nie ma odruchów lub szczypanie u nóg, aby potwierdzić znieczulenie.</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór TNBS w zależności od masy ciała. 
	UWAGA: Zastosowano TNBS - 65 mg/kg masy ciała w 250 μL 40% etanolu/soli fizjologicznej.</li>
	<li>Ułóż szczury w pozycji leżącej na stole anestezjologicznym. Aby wywołać zapalenie jelita grubego, wprowadź przez odbyt otwarty cewnik poliuretanowy klasy medycznej na ~7-8 cm od krawędzi odbytu i delikatnie wkraplaj TNBS (przygotowany w kroku 1.3) do okrężnicy19. Szczurom kontrolnym pozorowanym podawać tylko 250 μl soli fizjologicznej.</li>
	<li>Po zakropleniu TNBS lub soli fizjologicznej trzymaj szczury w pozycji leżącej i lekko głową w dół (~30°), z zamkniętym odbytem przez 2 minuty, aby wspomóc dystrybucję TNBS i uniknąć rozlania.</li>
	<li>Dostarczaj szczurom jedzenie i wodę ad libitum przez 7 dni i obserwuj szczury codziennie pod kątem masy ciała, spożycia pokarmu, kału i ogólnego stanu zdrowia.</li>
</ol>
2. Preparaty tkankowe
<ol>
	<li>W dniu eutanazji należy poddać szczury eutanazji za pomocą inhalacji CO2 i potwierdzić eutanazję ze zwichnięciem szyjki macicy.</li>
	<li>Otwórz brzuch szczura za pomocą chirurgicznych nożyczek i kleszczy.</li>
	<li>Ostrożnie usuń całą okrężnicę (nad kanałem odbytu) i natychmiast przenieś okrężnicę do lodowatego buforu 1x HBSS.</li>
	<li>Wyprostuj dwukropek w buforze i zmierz długość dwukropka za pomocą linijki. Weź nylonową nić i zaokrąglij wokół okrężnicy, aby zmierzyć zewnętrzny obwód segmentów okrężnicy u szczurów kontrolnych i leczonych TNBS. Weź tkanki o pełnej grubości do histologii.</li>
	<li>Rozetnij okrężnicę wzdłuż deski krezkowej i dobrze oczyść okrężnicę buforem HBSS. Oceń okrężnicę pod kątem makroskopowego wyniku zapalenia na podstawie kryteriów opisanych wcześniej19 z minimalnymi modyfikacjami. 
	UWAGA: 0 = normalna błona śluzowa; 1 = miejscowe przekrwienie, ale bez nadżerek i owrzodzeń; 2 = wrzód i zwężenie (dotknięty obszar < 5 mm); 3 = ciężkie owrzodzenie, blizna i zwężenie (dotknięty obszar > 5 mm).</li>
	<li>Pobrać próbki tkanki okrężnicy z miejsca P (porcja 2-3 cm przed ustnym brzegiem miejsca zapalenia), miejsca I (miejsce zapalenia, zwykle 4-6 cm od końca okrężnicy, do którego wkrapla się TNBS) i miejsca D (część 1-2 cm dystalnie do brzusznego brzegu miejsca zapalenia), odpowiednio od szczurów leczonych TNBS. 
	UWAGA: Z każdego segmentu pobrano tkankę jelita grubego o długości ~1-2 cm. Ponadto, tkanki jelita grubego o długości 2 cm (~ 4-6 cm od końca okrężnicy) szczurów leczonych solą fizjologiczną zostały pobrane jako pozorowana kontrola (S) (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Pobrać próbki tkanek z każdego miejsca w celu przygotowania pełnej grubości, a w razie potrzeby odpowiednio warstwy błony śluzowej/podśluzówkowej i mięśni zewnętrznych21,22.</li>
	<li>Próbki tkanek należy najpierw zamrozić w ciekłym azocie przed przechowywaniem ich w temperaturze -80 °C w celu przechowywania przez okres do jednego roku i do celów przyszłych (tj. preparatów RNA).</li>
</ol>
3. Histopatologiczna ocena zapalenia i zwłóknienia jelit
<ol>
	<li>Utrwal tkanki okrężnicy na całej grubości w 10% formalinie przez 48 godzin, a następnie przenieś do 70% etanolu na 24-48 godzin.</li>
	<li>Użyj mikrotomu, aby wyciąć skrawki parafiny o grubości 5 μm dla barwienia Hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz Trichromem Massona6,19,23 (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Rejestruj i przeglądaj obrazy za pomocą mikroskopu pionowego wyposażonego w kamerę o wysokiej rozdzielczości z kompatybilnym oprogramowaniem (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Wskaźniki stopnia stanu zapalnego i zwłóknienia przez dwóch niezależnych badaczy, w tym patologa chirurgicznego przewodu pokarmowego, zgodnie z kryteriami opisanymi wcześniej6,23 z modyfikacjami. Zobacz Plik Uzupełniający 1, aby zapoznać się z wynikami.</li>
	<li>Zmierzyć grubość i liczbę komórek okrągłych i podłużnych warstw mięśni na przekrój poprzeczny w czterech widokach każdej próbki barwionej H&E i przyjąć średnią z czterech pomiarów dla każdej próbki.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja RNA i ilościowy RT-PCR
<ol>
	<li>Homogenizować wycięte tkanki okrężnicy uzyskane z kontroli pozorowanej i trzech miejsc (P, I, D) szczurów z zapaleniem jelita grubego TNBS w odczynniku ekstrakcyjnym zestawu do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wyizoluj RNA z każdej próbki za pomocą zestawu. Eluować osad RNA w 30 μl wody wolnej od RNaz.</li>
	<li>Określić ilościowo stężenie RNA i sprawdzić czystość za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Użyj 1 μg całkowitego RNA do syntezy cDNA21,22 przy użyciu zestawu do syntezy RNA (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Analizuj i określaj ilościowo poziomy ekspresji genów, wykonując PCR w czasie rzeczywistym z 50 ng cDNA jako matrycą, sondami IL-6 i CTGF przy użyciu komercyjnego zestawu PCR do systemu PCR w czasie rzeczywistym (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Użyj genu kontrolnego 18S rRNA, aby znormalizować próbki i określić ilościowo względną ekspresję genów przy użyciu uzyskanych wartości Cq.</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wykorzystaj oprogramowanie do analizy statystycznej (patrz tabela materiałów), aby porównać szczury z pozorowaną kontrolą i zapaleniem jelita grubego TNBS.</li>
	<li>Uznajmy, że wartość p < 0,05 jest statystycznie istotna15,19.</li>
	<li>Aby przetestować różnice między dwiema grupami, użyj analizy testu t Studenta i wykonaj test ANOVA, jeśli porównania obejmują więcej niż dwie grupy15,19.</li>
</ol>

<ol><li>Kappelman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+and+geographic+distribution+of+Crohn%27s+disease+and+ulcerative+colitis+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).</li>
<li>Hwang, J. M., Varma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+for+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Surgery for inflammatory bowel disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).</li>
<li>Latella, G., Rieder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fibrosis%3A+Ready+to+be+reversed%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal fibrosis: Ready to be reversed.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).</li>
<li>Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+management%2C+and+treatment+of+fibrosis+in+patients+with+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).</li>
<li>Bettenworth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Crohn%27s+disease-associated+small+bowel+strictures+and+fibrosis+on+cross-sectional+imaging%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review.</a> Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).</li>
<li>Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+hyperplasia%2Fhypertrophy+is+the+most+prominent+histological+change+in+Crohn%27s+fibrostenosing+bowel+strictures%3A+A+semiquantitative+analysis+by+using+a+novel+histological+grading+scheme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crohn%27s+and+Colitis%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).</li>
<li>Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+course+of+Crohn%27s+disease+after+ileocolic+resection%3A+Endoscopically+visualised+ileal+ulcers+preceding+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms.</a> Gut. 33 (3), 331-335 (1992).</li>
<li>Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+is+a+pro-inflammatory+stimulus+in+the+gut%3A+In+vitro%2C+in+vivo+and+ex+vivo+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence.</a> PLoS One. 9, 106242(2014).</li>
<li>Gabella, G., Yamey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+collagen+by+smooth+muscle+in+the+hyertrophic+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine.</a> Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).</li>
<li>Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obstruction+and+pseudo-obstruction+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease.</a> Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).</li>
<li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+corresponding+to+strictured+bowel+induces+a+fibrogenic+response+in+human+colonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts.</a> Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).</li>
<li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signalling%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li>
<li>Cox, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertonic+saline+modulation+of+intestinal+tissue+stress+and+fluid+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance.</a> Shock. 29 (5), 598-602 (2008).</li>
<li>Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+gene+expression+in+gut+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1000(2017).</li>
<li>Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction%3A+Role+of+stretch-induced+COX-2%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).</li>
<li>Gutierrez, J. A., Perr, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+modulates+TGF-beta1+and+alpha1%28I%29+collagen+expression+in+fetal+human+intestinal+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells.</a> American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).</li>
<li>Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTGF+is+a+central+mediator+of+tissue+remodeling+and+fibrosis+and+its+inhibition+can+reverse+the+process+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+Tissue+Repair%22%5BJournal%5D)">CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis.</a> Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24(2012).</li>
<li>Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+the+Cyr61%2FCCN1+and+CTGF%2FCCN2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins.</a> The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).</li>
<li>Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immune+and+genetic+responses+in+rat+models+of+Crohn%27s+colitis+and+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).</li>
<li>Antoniou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TNBS-induced+colitis+animal+model%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine+and+Surgery+%28London%29%22%5BJournal%5D)">The TNBS-induced colitis animal model: An overview.</a> Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).</li>
<li>Shi, X. Z., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+Cav1.2+channel+with+VIP+and+VIP+receptor+agonists+and+antagonists%3A+A+novel+approach+to+designing+promotility+and+antimotility+agents%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).</li>
<li>Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophylactic+and+therapeutic+benefits+of+COX-2+inhibitor+on+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction%3A+Roles+of+PGE2+and+EP+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).</li>
<li>Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li>
<li>Mudter, J., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Il-6+signaling+in+inflammatory+bowel+disease%3A+Pathophysiological+role+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance.</a> Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).</li>
<li>Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mechano-transcription+process+as+therapeutic+intervention+in+gastrointestinal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 809350(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów i nie mają nic do ujawnienia.

Zapalenie jelita grubego wywołane TNBS zostało wprowadzone w 1989 roku i od tego czasu jest używane jako eksperymentalny model choroby Leśniowskiego-Crohna 19,20,23. Do istotnych cech tego modelu u gryzoni należy rozwój przezściennego stanu zapalnego, który bardzo przypomina zmiany histopatologiczne rozwijające się w ludzkiej chorobie Leśniowskiego-Crohna 19,20. Dotychcz...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63499">A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn&#39;s Disease</a>. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights. 
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 &#181;L of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights. 
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 &#181;L of 40% ethanol/saline was used.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63499">A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn&#39;s Disease</a>. The Introduction and Protocol were updated.

Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

Nieswoiste zapalenie jelit (IBD), w tym wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) i choroba Leśniowskiego-Crohna (CD), charakteryzuje się przewlekłym stanem zapalnym w przewodzie pokarmowym (GI). Dotyka ~1-2 miliony Amerykanów1. Szacowane roczne koszty opieki nad pacjentami z IBD w USA wynoszą 11,8 miliarda dolarów. W przeciwieństwie do UC, CD charakteryzuje się przezściennym zapaleniem i tworzeniem się zwężeń2,3. Powstawanie zwężeń (zwężenie) występuje nawet u 70% pacjentów z CD3 i może być spowodowane przezściennym zapaleniem (zwężenie zapalne) lub zwłóknieniem jelit (zwężenie zwłóknieniowe)4,5. Zwłóknienie jelit charakteryzuje się nadmiernym odkładaniem się kolagenu i innych macierzy zewnątrzkomórkowych (ECM) z komórkami mięśni gładkich (SMC) jako jednym z głównych typów komórek mezenchymalnych zaangażowanych w ten proces3,4. Przerost mięśni gładkich związany z hipertrofią to kolejna istotna zmiana histologiczna w zwężeniu zwłóknienia w CD6. Chociaż powstawanie zwężeń w CD wiąże się z przewlekłym stanem zapalnym, żadne leczenie przeciwzapalne nie jest skuteczne, z wyjątkiem leczenia chirurgicznego2,6. Jednak nawroty pooperacyjne są prawie w 100%, jeśli ma się wystarczająco dużo czasu2,7. Jako reakcja zapalna, zwłóknienie i przerost SMC mogą również rozwinąć się w stanach niezapalnych (tj. niedrożność jelit) w jelitach8,9; Uważa się, że w powstawaniu zwężeń biorą udział zarówno mechanizmy zależne, jak i niezależne3,4. Biorąc pod uwagę, że szeroko zakrojone badania nad mechanizmami zależnymi od stanu zapalnego nie przełożyły się na żadną skuteczną terapię powstawania zwężeń, potrzebne są badania nad możliwą rolą mechanizmów niezależnych od stanu zapalnego w zwłóknieniu jelit.
Jako czynnik niezapalny, stres mechaniczny (MS) związany z obrzękiem, infiltracją komórek zapalnych, deformacją tkanek, zwłóknieniem i zwężeniem10,11,12,13 jest powszechnie spotykany w IBD, zwłaszcza CD, który charakteryzuje się przezściennym zapaleniem. Naprężenie mechaniczne jest najbardziej widoczne w zwężeniu CD, gdzie zwężenie (zapalne lub zwłóknieniowe) w miejscu zapalenia powoduje naprężenie mechaniczne w tkance lokalnej i prowadzi do rozdęcia światła w segmencie bliższym miejscu niedrożności10,14. Wcześniejsze badania in vitro wykazały, że stres mechaniczny zmienia ekspresję genów specyficznych mediatorów stanu zapalnego (tj. COX-2, IL-6)8,14,15 i czynniki wzrostu (tj. TGF-β) w tkankach przewodu pokarmowego, zwłaszcza komórkach mięśni gładkich jelit (SMC)16. Ostatnie badania wykazały również, że ekspresja specyficznych mediatorów profibrotycznych, takich jak czynnik wzrostu tkanki łącznej (CTGF), jest bardzo wrażliwa na obciążenia mechaniczne17,18. Postawiono hipotezę, że stres mechaniczny może odgrywać niezależną rolę patogenną w zapaleniu, zwłóknieniu i przebudowie tkanek związanym z chorobą Alzheimera. Jednak patogenne znaczenie stresu mechanicznego w zapaleniu jelit, zwłóknieniu i przeroscie mięśni gładkich w CD pozostaje w dużej mierze niezbadane. Może to częściowo wynikać z faktu, że stan zapalny jest bardziej widocznym i lepiej zbadanym procesem niż stres mechaniczny. Co ważniejsze, nie ma dobrze zdefiniowanego modelu zwierzęcego IBD, który pozwoliłby odróżnić wpływ stresu mechanicznego od stanu zapalnego.
Obecna praca opisuje gryzoniowy model zapalenia jelita grubego podobnego do choroby Leśniowskiego-Crohna, wywołany przez wstrzyknięcie do okrężnicy odczynnika haptenowego kwasu 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowego (TNBS)19,20, który może służyć do badania roli naprężeń mechanicznych w CD. Stwierdzono, że wkroplenie TNBS wywołało miejscowe (~2 cm długości) przezścienne zapalenie ze zwężeniem światła (zwężeniem) w dalszej części okrężnicy. Zwężenie prowadzi do wyraźnego rozdęcia jelit (stresu mechanicznego)14,15, ale niewidoczny stan zapalny w odcinku okrężnicy proksymalnie do miejsca wkroplenia. Wręcz przeciwnie, odcinek okrężnicy dystalny do miejsca zwężenia nie przedstawia stanu zapalnego ani obciążenia mechanicznego. W trzech różnych miejscach zaobserwowano znaczące zmiany w ekspresji genów, zapaleniu, zwłóknieniu i przeroscie SMC. Wyniki sugerują, że stres mechaniczny, a w szczególności ekspresja genów wywołana stresem mechanicznym, może odgrywać kluczową rolę w rozwoju zwłóknienia i hiperplazji w zapaleniu jelita grubego Leśniowskiego-Crohna.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie sterujące ACT-1 Ver2.63</td> Termocykler dotykowy <td>Nikon</td><td>DXM1200F</td><td></td></tr><tr><td>C1000 z 96-dołkowym modułem szybkiej reakcji</td> Moduł reakcji optycznej <td>BIO-RAD</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 do systemów PCR w czasie rzeczywistym</td><td>BIO-RAD</td><td>1845097</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik specjalny Dako Agilent Artisan Link Pro</td><td>Dako</td><td>AR310</td><td></td></tr><tr><td>Dako-Agilent Masson's Zestaw trichromowy ref# AR173</td><td>Dako</td><td>AR173</td><td></td></tr><tr><td>DXM1200 Cyfrowa kolorowa kamera HR</td><td>Nikon</td><td>DXM1200</td><td></td></tr><tr><td>Eukarionyczna 18S rRNA Kontrola endogenna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4352930E</td><td></td></tr><tr><td>E-Z Anestezja</td><td>E-Z Systems Inc.</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad</td><td>9.0.2 (161)</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki PCR z twardą skorupą, niskoprofilowe, cienkościenne, w listwach przypodłogowych, białe/przezroczyste</td><td>BIO-RAD</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x bez wapnia i magnezu)</td><td>CORNING</td><td>21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-667</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Cyfrowy system obrazowania</td><td>LI-COR</td><td>9120</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler epGradient Thermal Cycler z panelem sterowania Termocykler 5340</td><td>Eppendorf</td><td>5341</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik poliuretanowy klasy medycznej klasy otwartej</td><td>Covidien</td><td>8890703013</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometry NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy Nikon Eclipse E800</td><td>Nikon</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>Kanapki z nitrocelulozą/bibułą filtracyjną Opakowanie 50, 0,45 i mu; m, 7 x 8,5 cm</td><td>BIO-RAD</td><td>1620215</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 3350, osmotyczny środek przeczyszczający</td><td>Miralax</td><td>C8175</td><td>Dawka: 17g w 226 ml wody</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini wirujące kolumny, probówki zbiorcze (1,5 ml i 2 mL), odczynniki i wolne od RNaz</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III System syntezy pierwszej nici</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Testy ekspresji genów TaqMan Rn00573960_g1 sonda CTGF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Testy ekspresji genów TaqMan Rn99999011_m1 Sonda IL6</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma H& E Zestaw do barwienia #1</td><td>Sakura</td><td>6190</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma Plus Automatyczny barwnik do szkiełek</td><td>Sakura</td><td>6171</td><td></td></tr><tr><td>TNBS (roztwór kwasu pikrylosulfonowego)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>92822</td><td></td></tr></tbody></table>

model gryzoni indukowany przez tnbs do badania patogennej roli stresu mechanicznego w chorobie leśniowskiego-crohna

A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

Choroby zapalne jelit (IBD), takie jak choroba Leśniowskiego-Crohna (CD), są przewlekłymi chorobami zapalnymi przewodu pokarmowego, dotykającymi około 20 na 1 000 000 w Europie i USA. CD charakteryzuje się przezściennym zapaleniem, zwłóknieniem jelit i zwężeniem światła. Chociaż terapie przeciwzapalne mogą pomóc w kontrolowaniu stanu zapalnego, nie są skuteczne w przypadku zwłóknienia i zwężenia w CD. Patogeneza CD nie jest dobrze poznana. Obecne badania koncentrują się głównie na określeniu rozregulowanych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej jelit. Podczas gdy zapalenie przezścienne związane z CD, zwłóknienie jelit i zwężenie światła reprezentują mechaniczne naprężenie ściany jelita, rola stresu mechanicznego w CD nie jest dobrze zdefiniowana. Aby ustalić, czy stres mechaniczny odgrywa niezależną rolę patogenną w chorobie Alzheimera, opracowano protokół indukowanego przez TNBS modelu zapalenia jelita grubego podobnego do CD u gryzoni. Ten model przezściennego zapalenia i zwłóknienia wywołany TNBS przypomina patologiczne cechy charakterystyczne CD w okrężnicy. Jest indukowany przez wkroplenie TNBS do dystalnej części jelita grubego dorosłych szczurów Sprague-Dawley. W tym modelu zapalenie przezścienne prowadzi do zwężenia w miejscu wkroplenia TNBS (miejsce I). Rozdęcie mechaniczne obserwuje się w części bliższej miejsca wkroplenia (miejsce P), co stanowi naprężenie mechaniczne, ale nie jest widocznym stanem zapalnym. Część okrężnicy dystalna do stanu zapalnego (miejsce D) nie przedstawia stanu zapalnego ani obciążenia mechanicznego. Zaobserwowano charakterystyczne zmiany w ekspresji genów, odpowiedzi immunologicznej, zwłóknieniu i wzroście mięśni gładkich w różnych miejscach (P, I i D), co podkreśla głęboki wpływ naprężeń mechanicznych. Dlatego ten model zapalenia jelita grubego podobnego do CD pomoże nam lepiej zrozumieć mechanizmy patogenne CD, w szczególności rolę stresu mechanicznego i ekspresji genów wywołanej stresem mechanicznym w dysregulacji immunologicznej, zwłóknieniu jelit i przebudowie tkanek w CD.

Widok makroskopowy zapalenia jelita grubego podobnego do choroby Crohna indukowanego wewnątrzjelitowym podaniem TNBS 
Jak pokazano na Rysunku 1, wewnątrzjelitowe podanie TNBS u szczurów wywołało miejscowy stan zapalny transmuralny (o długości ok. 2 cm) z pogrubieniem ściany jelita i zwężeniem światła (stenoza) w miejscu podania w dystalnym odcinku jelita grubego (Rysunek 1A). Miejsce podania TNBS określono jako miejsce I. W wyniku zapalenia t...

Obecny protokół opisuje rozwój podobnego do choroby Leśniowskiego-Crohna modelu zapalenia jelita grubego u gryzoni. Zapalenie przezścienne prowadzi do zwężenia w miejscu wkroplenia TNBS, a powiększenie mechaniczne obserwuje się w segmencie bliższym zwężeniu. Zmiany te pozwalają na badanie naprężeń mechanicznych w zapaleniu jelita grubego.

Model gryzoni indukowany przez TNBS do badania patogennej roli stresu mechanicznego w chorobie Leśniowskiego-Crohna

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting ...

Tak więc w naszym protokole wkraplanie TNBS do okrężnicy prowadzi do przezściennego zapalenia w miejscu wkroplenia i mechanicznego rozdęcia w segmencie bliższym zapaleniu. To naśladuje zwężoną chorobę Leśniowskiego-Crohna. Ponieważ segment proksymalny jest mechanicznie rozdęty, ale nie wykazuje widocznego stanu zapalnego, badanie porównawcze odcinka proksymalnego i miejsca zapalenia pomaga określić, czy naprężenia mechaniczne odgrywają rolę w zapaleniu jelita grubego Leśniowskiego-Crohna.Wcześniejsze badania koncentrowały się tylko na miejscu zapalenia. Nasz protokół pracujący w różnych miejscach w modelu podkreśla kluczową rolę naprężeń mechanicznych w chorobie Leśniowskiego-Crohna, szczególnie w zwężonej chorobie Leśniowskiego-Crohna. Na początek połóż szczury na stole anestezjologicznym w pozycji leżącej.Aby wywołać zapalenie jelita grubego, wprowadź otwarty cewnik poliuretanowy klasy medycznej przez odbyt na około siedem do ośmiu centymetrów od krawędzi odbytu i delikatnie wkraplaj TNBS do okrężnicy. Podawać szczurom kontrolnym pozorowaną 250 mikrolitrów soli fizjologicznej. Aby pomóc w dystrybucji TNBS lub soli fizjologicznej i uniknąć rozlania, trzymaj szczury w pozycji leżącej z głową skierowaną w dół pod kątem około 30 stopni, z zamkniętym odbytem przez dwie minuty.Otwórz brzuch szczura za pomocą chirurgicznych nożyczek i kleszczy. Ostrożnie usuń całą okrężnicę powyżej kanału odbytu i natychmiast przenieś okrężnicę do lodowatego buforu 1x HBSS. Wyprostuj dwukropek w buforze i zmierz długość dwukropka za pomocą linijki.Weź nylonową nić i zakreśl ją wokół okrężnicy, aby zmierzyć zewnętrzny obwód segmentów okrężnicy u szczurów kontrolnych i leczonych TNBS. Weź tkanki o pełnej grubości do histologii. Rozetnij okrężnicę wzdłuż deski krezkowej i dokładnie wyczyść okrężnicę buforem HBSS.Oceń okrężnicę pod kątem makroskopowego wyniku zapalenia na podstawie predefiniowanych kryteriów z minimalnymi modyfikacjami. Zbierz próbki tkanki okrężnicy od szczurów leczonych TNBS w miejscach P, I i D.Site P to część od dwóch do trzech centymetrów przed brzegiem jamy ustnej miejsca zapalenia. Miejsce I to miejsce zapalne, w którym wkrapla się TNBS, zwykle od czterech do sześciu centymetrów od końca okrężnicy.Wreszcie miejsce D to część od jednego do dwóch centymetrów dystalnie do brzegu oralnego miejsca zapalenia. Wkroplenie TNBS do okrężnicy u szczurów wywołało miejscowe zapalenie przezścienne o długości około dwóch centymetrów z pogrubioną ścianą jelita i zwężonym światłem w miejscu wkroplenia w dystalnej części okrężnicy. Miejsce wkroplenia TNBS było określane jako miejsce I.As wyniku przezściennego zapalenia i zwężenia, zarówno stan zapalny, jak i stres mechaniczny były obecne w miejscu I. Zwężenie w miejscu I doprowadziło do znacznego rozdęcia światła w segmencie bliższym miejscu wkroplenia TNBS, określanym jako miejsce P. Obwód okrężnicy był znacznie zwiększony w miejscach P i I w porównaniu z okrężnicą kontrolną pozorowaną.Podczas mechanicznego rozdęcia miejsce P nie wykazywało widocznego stanu zapalnego. Wręcz przeciwnie, odcinek okrężnicy dystalny do wkroplenia TNBS, określany jako miejsce D, nie wykazywał ani stanu zapalnego, ani rozdęcia mechanicznego. Makroskopowy wynik stanu zapalnego w miejscu I u szczurów leczonych TNBS był dramatycznie zwiększony w porównaniu z kontrolami pozorowanymi w miejscach P i D szczurów z zapaleniem jelita grubego.Wyniki stanu zapalnego w miejscach P i D nie były istotnie zwiększone w porównaniu z pozorowanym. Dlatego ważne jest, aby badać nie tylko miejsce I, ale także miejsca P i D w modelu, ponieważ pomaga to rozpoznać patogenne znaczenie stresu mechanicznego w chorobie Leśniowskiego-Crohna. Aby dokładniej ustalić, czy stres mechaniczny jest czynnikiem patogennym w zapaleniu jelit, można również spróbować uwolnić wzdęcia mechaniczne, karmiąc zwierzęta wyłącznie dietą płynną i sprawdzając, czy pomaga to w stanach zapalnych i funkcjonowaniu jelit.

a-tnbs-induced-rodent-model-to-study-pathogenic-role-mechanical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Dekstran siarczan sodu (DSS) podawany w wodzie pitnej jest uznanym mysim modelem uszkodzenia zapalnego w przebiegu ostrego colitis. Niniejszy protokół opisuje metodę podawania DSS oraz przygotowania tkanek.

Modelowanie zapalenia jelita grubego u myszy z użyciem dekstranu siarczanu sodu (DSS)

Zakażenie gryzoniami Citrobacter stanowi cenny model do badania infekcji bakteryjnych jelit, jak również odpowiedzi immunologicznych gospodarza i zapalenia jelita grubego u myszy. Protokół ten określa pomiar integralności bariery, obciążenia patogenem i uszkodzeń histologicznych, co pozwala na dokładne scharakteryzowanie udziału patogenu i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego u myszy.

Mysi model Citrobacter rodentium: badanie udziału patogenów i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego

Zapalenie jelita grubego wywołane DNBS/TNBS oferuje alternatywną i tanią metodę badania patobiologii nieswoistych zapaleń jelit. Protokół omówiony w tym artykule przedstawia skuteczne zastosowanie DNBS do wywoływania zapalenia jelita grubego u myszy i szczurów oraz pozwala na dokładne zbadanie odpowiedzi jelitowych za pośrednictwem gospodarza.

Modele zapalenia jelita grubego DNBS/TNBS: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

W tym badaniu szczegółowo opisujemy procedurę zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS, które wykazuje porównywalną patofizjologię do zwłóknienia Leśniowskiego-Crohna. Omawiamy również to podejście w świetle hamującego działania rapamycyny na zwłóknienie jelit.

Mechanistyczny wgląd w rozwój zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS i ocena hamującego działania rapamycyny

Ten protokół opisuje mysi model zwłóknienia jelit wywołanego przez Salmonellę, który przypomina kluczowe patologiczne cechy choroby Leśniowskiego-Crohna, w tym przezścienne zapalenie i zwłóknienie. Metoda ta może być stosowana do oceny czynników gospodarza, które zmieniają wyniki zwłóknienia przy użyciu zmutowanych myszy utrzymywanych na tle genetycznym C57Bl/6.

Przewlekłe zwłóknienie jelit wywołane zakażeniem Salmonellą

Protokół przedstawia kompletny, potwierdzony, indukowany przez TNBS mysi model choroby Leśniowskiego-Crohna oraz metody wizualizacji receptorów estrogenowych za pomocą immunohistochemii przy użyciu immunofluorescencji utrwalonych formaliną odcinków jelita grubego zanurzonych w parafinie.

Wizualizacja receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji

W tym protokole opisany jest model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego dla antygenu mikrobioty jelitowej z limfocytów T. Limfocyty T CD4 + izoluje się od myszy transgenicznych CBir1 TCR. Są one specyficzne dla immunodominującego antygenu mikrobioty jelitowej CBir1 flageliny, który jest przenoszony do myszy biorcy Rag1-/-, prowadząc do zapalenia jelit.

Indukcja zapalenia jelit przez adoptywny transfer transgenicznych limfocytów T CD4 + CBir1 TCR do myszy z niedoborem odporności

Ten protokół opisuje metodę tworzenia szczurzego modelu zapalenia torebki. Model worka jelita krętego powstał poprzez wykonanie operacji zespolenia jelita krętego z odbytem (IPAA) z wykorzystaniem technik mikrochirurgicznych. Po operacji szczur był leczony 4% siarczanem dekstranu sodu (DSS) przez 4 dni.

Szczurzy model zapalenia torebki po proktokolektomii i zespoleniu jelita krętego z odbytem przy użyciu siarczanu dekstranu sodu

Protokół ten pokazuje, jak model myszy zawierający domenę homologii 2 zawierający domenę 5'-inozytol fosfatazy (SHIP) niedoborowy dla zapalenia i włóknienia kości typu Leśniowskiego-Crohna (CD) podobnego do choroby Leśniowskiej (CD) może być wykorzystywany do testowania nowych terapii dla CD.

Ocena interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym SHIP zapalenia i włóknienia choroby Leśniowskiego-Crowna podobnego do choroby Leśniowskiego-CRUNA

Odkryj model TNBS u szczurów do badania roli stresu mechanicznego w chorobie Leśniowskiego-Crohna. Protokół umożliwia analizę zmian mechanicznych w różnych segmentach jelita.

Model gryzoni indukowany przez TNBS do badania patogennej roli stresu mechanicznego w chorobie Leśniowskiego-Crohna

Przeglądaj więcej filmów