Model gryzoni indukowany przez TNBS do badania patogennej roli stresu mechanicznego w chorobie Leśniowskiego-Crohna
1 marca 2022
Obecny protokół opisuje rozwój podobnego do choroby Leśniowskiego-Crohna modelu zapalenia jelita grubego u gryzoni. Zapalenie przezścienne prowadzi do zwężenia w miejscu wkroplenia TNBS, a powiększenie mechaniczne obserwuje się w segmencie bliższym zwężeniu. Zmiany te pozwalają na badanie naprężeń mechanicznych w zapaleniu jelita grubego.
Tak więc w naszym protokole wkraplanie TNBS do okrężnicy prowadzi do przezściennego zapalenia w miejscu wkroplenia i mechanicznego rozdęcia w segmencie bliższym zapaleniu. To naśladuje zwężoną chorobę Leśniowskiego-Crohna. Ponieważ segment proksymalny jest mechanicznie rozdęty, ale nie wykazuje widocznego stanu zapalnego, badanie porównawcze odcinka proksymalnego i miejsca zapalenia pomaga określić, czy naprężenia mechaniczne odgrywają rolę w zapaleniu jelita grubego Leśniowskiego-Crohna.
Wcześniejsze badania koncentrowały się tylko na miejscu zapalenia. Nasz protokół pracujący w różnych miejscach w modelu podkreśla kluczową rolę naprężeń mechanicznych w chorobie Leśniowskiego-Crohna, szczególnie w zwężonej chorobie Leśniowskiego-Crohna. Na początek połóż szczury na stole anestezjologicznym w pozycji leżącej.
Aby wywołać zapalenie jelita grubego, wprowadź otwarty cewnik poliuretanowy klasy medycznej przez odbyt na około siedem do ośmiu centymetrów od krawędzi odbytu i delikatnie wkraplaj TNBS do okrężnicy. Podawać szczurom kontrolnym pozorowaną 250 mikrolitrów soli fizjologicznej. Aby pomóc w dystrybucji TNBS lub soli fizjologicznej i uniknąć rozlania, trzymaj szczury w pozycji leżącej z głową skierowaną w dół pod kątem około 30 stopni, z zamkniętym odbytem przez dwie minuty.
Otwórz brzuch szczura za pomocą chirurgicznych nożyczek i kleszczy. Ostrożnie usuń całą okrężnicę powyżej kanału odbytu i natychmiast przenieś okrężnicę do lodowatego buforu 1x HBSS. Wyprostuj dwukropek w buforze i zmierz długość dwukropka za pomocą linijki.
Weź nylonową nić i zakreśl ją wokół okrężnicy, aby zmierzyć zewnętrzny obwód segmentów okrężnicy u szczurów kontrolnych i leczonych TNBS. Weź tkanki o pełnej grubości do histologii. Rozetnij okrężnicę wzdłuż deski krezkowej i dokładnie wyczyść okrężnicę buforem HBSS.
Oceń okrężnicę pod kątem makroskopowego wyniku zapalenia na podstawie predefiniowanych kryteriów z minimalnymi modyfikacjami. Zbierz próbki tkanki okrężnicy od szczurów leczonych TNBS w miejscach P, I i D.Site P to część od dwóch do trzech centymetrów przed brzegiem jamy ustnej miejsca zapalenia. Miejsce I to miejsce zapalne, w którym wkrapla się TNBS, zwykle od czterech do sześciu centymetrów od końca okrężnicy.
Wreszcie miejsce D to część od jednego do dwóch centymetrów dystalnie do brzegu oralnego miejsca zapalenia. Wkroplenie TNBS do okrężnicy u szczurów wywołało miejscowe zapalenie przezścienne o długości około dwóch centymetrów z pogrubioną ścianą jelita i zwężonym światłem w miejscu wkroplenia w dystalnej części okrężnicy. Miejsce wkroplenia TNBS było określane jako miejsce I.As wyniku przezściennego zapalenia i zwężenia, zarówno stan zapalny, jak i stres mechaniczny były obecne w miejscu I. Zwężenie w miejscu I doprowadziło do znacznego rozdęcia światła w segmencie bliższym miejscu wkroplenia TNBS, określanym jako miejsce P. Obwód okrężnicy był znacznie zwiększony w miejscach P i I w porównaniu z okrężnicą kontrolną pozorowaną.
Podczas mechanicznego rozdęcia miejsce P nie wykazywało widocznego stanu zapalnego. Wręcz przeciwnie, odcinek okrężnicy dystalny do wkroplenia TNBS, określany jako miejsce D, nie wykazywał ani stanu zapalnego, ani rozdęcia mechanicznego. Makroskopowy wynik stanu zapalnego w miejscu I u szczurów leczonych TNBS był dramatycznie zwiększony w porównaniu z kontrolami pozorowanymi w miejscach P i D szczurów z zapaleniem jelita grubego.
Wyniki stanu zapalnego w miejscach P i D nie były istotnie zwiększone w porównaniu z pozorowanym. Dlatego ważne jest, aby badać nie tylko miejsce I, ale także miejsca P i D w modelu, ponieważ pomaga to rozpoznać patogenne znaczenie stresu mechanicznego w chorobie Leśniowskiego-Crohna. Aby dokładniej ustalić, czy stres mechaniczny jest czynnikiem patogennym w zapaleniu jelit, można również spróbować uwolnić wzdęcia mechaniczne, karmiąc zwierzęta wyłącznie dietą płynną i sprawdzając, czy pomaga to w stanach zapalnych i funkcjonowaniu jelit.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje opracowanie modelu colitis przypominającego chorobę Leśniowskiego-Crohna u gryzoni, z uwzględnieniem zapalenia transmuralnego oraz stresu mechanicznego. Pozwala on na badanie zmian mechanicznych w colitis, w szczególności w warunkach stenozy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Gastroenterologia
- Nieswoiste zapalenia jelit
Wstęp
- Choroba Crohna charakteryzuje się zapaleniem transmuralnym.
- Stres mechaniczny może odgrywać istotną rolę w progresji choroby.
- Poprzednie badania koncentrowały się głównie na miejscach zapalenia.
- Model ten umożliwia badania porównawcze segmentów objętych procesem chorobowym i segmentów zdrowych.
Cel badania
- Opracowanie modelu gryzoni naśladującego stenozyjącą chorobę Crohna.
- Zbadanie roli stresu mechanicznego w zapaleniu jelita grubego.
- Porównanie zmian mechanicznych w segmentach objętych zapaleniem i segmentach zdrowych.
Zastosowane metody
- Wewnątrzjelitowa instylacja TNBS w celu wywołania stanu zapalnego.
- Ocena rozciągliwości mechanicznej w segmentach proksymalnych.
- Analiza porównawcza obszarów objętych stanem zapalnym i obszarów zdrowych.
- Zastosowanie znieczulenia podczas przygotowania gryzoni.
Główne wyniki
- W miejscu podania TNBS pomyślnie wywołano zapalenie transmuralne.
- W segmencie proksymalnym zaobserwowano rozciągnięcie mechaniczne.
- Wyniki sugerują krytyczną rolę stresu mechanicznego w chorobie LeCroghna.
- Model podkreśla znaczenie badania różnych obszarów anatomicznych.
Wnioski
- Opracowany model jest skuteczny w badaniu zapalenia jelita krezkowego przypominającego chorobę Crohna.
- Stres mechaniczny może przyczyniać się do patologii choroby.
- Przyszłe badania powinny zgłębić znaczenie tych wyników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zrozumienie niezależnej roli stresu mechanicznego w patogenezie choroby Leśniowskiego-Crohna jest kluczowe dla ograniczenia ryzyka na wczesnym etapie odkrywania leków oraz walidacji celów terapeutycznych w rozwoju leków na IBD. Model gryzoni indukowany TNBS umożliwia precyzyjne rozróżnienie czynników mechanicznych od zapalnych, co zwiększa pewność prognostyczną w badaniach translacyjnych oraz wspomaga selekcję projektów w ramach strategii antyfibrotycznych i antystenotycznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie stresu mechanicznego jako niezależnego czynnika patogennego w chorobie Crohna.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez rozróżnienie wkładu mechanicznego od zapalnego w procesach włóknienia i zwężenia.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dla nowych hipotez terapeutycznych ukierunkowanych na przebudowę tkanek.
Przesiew i opracowanie analizy
- Zapewnia zwalidowany system in vivo do ilościowej oceny ekspresji genów, odpowiedzi immunologicznej oraz włóknienia w określonych warunkach mechanicznych.
- Umożliwia powtarzalny pomiar makroskopowego stanu zapalnego i rozciągnięcia mechanicznego w różnych obszarach anatomicznych.
- Wspiera standaryzację testów w celu późniejszej oceny związków celujących w szlaki stresu mechanicznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele przedkliniczne do cech patologii choroby Crohna istotnych z punktu widzenia schorzenia, w tym zapalenia transmuralnego i zwężenia światła jelita.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację interwencji antyfibrotycznych i przeciwdziałających zwężeniom.
- Umożliwia identyfikację translacyjnych biomarkerów poprzez korelację naprężeń mechanicznych z ekspresją genów i przebudową tkanki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten łączy wczesną fazę odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących stresu mechanicznego w IBD, co wspiera identyfikację substancji wiodących oraz podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Biologia odkrywcza: Analizuje patogenne znaczenie stresu mechanicznego w porównaniu z zapaleniem w chorobie Leśniarskiego-Crohna.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, specyficznych dla miejsca odczytów w zakresie zapalenia, włóknienia i rozciągnięcia mechanicznego.
- Analityka: Umożliwia analizę porównawczą ekspresji genów i odpowiedzi immunologicznej w określonych miejscach anatomicznych.
- Badania translacyjne: Modeluje klinicznie istotne cechy w celu przedklinicznej oceny strategii przeciwvłóknieniowych.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badań mechanistycznych i przesiewania związków w badaniach nad nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w chorobie Leśniowskiego-Crohna.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę in vivo czynników mechanicznych i zapalnych w modelach IBD.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go w przypadku kandydatów na leki przeciwzwłóknieniowe i przeciwzwężeniowe.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację zasobów badawczych i przedklinicznych ukierunkowanych na przebudowę tkanek, z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu procedur chirurgicznych u gryzoni oraz modelowania zapalenia jelita grubego.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury analitycznej w zakresie badań histologicznych, molekularnych i makroskopowych.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów oceny stopnia stanu zapalnego oraz pobierania tkanek pomiędzy zespołami.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody dla innych szczepów gryzoni lub modeli istotnych dla IBD.
- Ilościowa ocena stresu mechanicznego jest ograniczona do określonych miejsc anatomicznych i może nie obejmować efektów systemowych.
