Wytrącanie białek na bazie rozpuszczalnika organicznego do solidnej oczyszczania proteomu przed spektrometrią mas

Protokoły te zostały zaprojektowane tak, aby maksymalizować odzysk oraz czystość białek dzięki wytrąceniu na bazie rozpuszczalnika. Pokażemy wam kilka trików na wydzielanie opadów w fiolkach, a także półautomatyczne podejście w formacie kartridża obrotowego. Zoptymalizowaliśmy również protokół opadów tak, aby był spójny i szybki.

Cały protokół zajmuje tylko kilka minut. Protokoły te pokazują, że wytrącanie białek przez rozpuszczalnik jest idealne do przygotowania próbki przed spektrometrią mas. Protokoły będą idealnie pasować zarówno do workflow od dołu do góry, jak i od góry do dołu dla profesjonalistów.

Dziś zademonstrują nam Ziheng Dang i Victoria Miller, starsza naukowczyni w Proteoform Scientific w Halifax, Nowa Szkocja, Pipette 90 mikrolitrów roztworu białka wolnego od cząstek w mikrowirówce polipropylenowej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów jednego mola chlorku sodu wodnego i 400 mikrolitrów acetonu do roztworu próbki, zakręć i delikatnie stuknąć w fiolkę, aby połączyć rozpuszczalniki. Pozwól fiolce się wychować.

W temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie minuty po inkubacji, odwiruj próbki, notując orientację fiolki i obracaj przez co najmniej dwie minuty przy temperaturze 10 000 RCF lub wyższej w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu widoczny jest biały granulek na dnie rurki. W tym momencie odkręć rurkę i przelać supernat do pojemnika na odpady, odwracając rurkę.

Użyj ręcznika papierowego, aby wyciągnąć resztki rozpuszczalnika z fiolki. Dla SDS zawierających próbki. Ostrożnie podawaj 400 mikrolitrów świeżego acetonu, nie naruszając granulatu.

Natychmiast centruj próbkę na minutę przy temperaturze 10 000 G lub wyższej w temperaturze pokojowej, umieszczając fiolkę w wirniku w tej samej orientacji, co początkowy obrót. Zlicz rozpuszczalnik do mycia tak, jak opisano wcześniej. Susz próbkę z otwartą kapslą przez około minutę.

W okapu wyparowym, przed rozpuszczeniem peletów. Podaj 100 mikrolitrów roztworu białkowego do fiolki z polipropylenu. Do okapu wypalającego dodaj 400 mikrolitrów metanolu, a następnie 100 mikrolitrów chloroformu.

Zakręć fiolkę i krótko wymieszać wir. Szybko wydaj 300 mikrolitrów wody bezpośrednio do środka fiolki. Zakręć fiolkę i pozwól jej stać na blacie stołu przez minutę, następnie umieść fiolkę z polipropylenem w wirówce i obracaj przez pięć minut w temperaturze 10 000 G lub wyższej w temperaturze pokojowej.

Obserwowano, że fiolka ma dwie warstwy rozpuszczalnika oraz widoczny biały kulkę aż do fiolki pod kątem około 45 stopni. Usuń około 700 mikrolitrów rozpuszczalnika z górnej warstwy w jednolitej szybkości, początkowo używając dużej mikropipety o pojemności jednego mililitra, a później końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aż utworzy się kulka w fiolce. Dodaj 400 mikrolitrów świeżego metanolu do fiolki próbki, nie naruszając granulacji, rozpuszczalnik rozpuszczalnik rozpuszczając wzdłuż boku fiolki.

Zakręć fiolkę i połącz warstwy rozpuszczalnika, delikatnie kołysząc ją, aby rozpuszczalniki się mieszały razem. Aby obserwować biały granulek białkowy, notując orientację fiolki w wirówce wirnikowej przez co najmniej 10 minut przy temperaturze 10 000 G lub wyższej w temperaturze pokojowej. Ustawij fiolkę pod kątem tak, że granulat jest skierowany w dół.

Umieść końcówkę pipety wzdłuż górnej krawędzi fiolki i usuń supernatant mikropipetą o średnicy jednego mililitra, powoli, ale równomiernie. Zachowując około 20 mikrolitrów rozpuszczalnika. Pozwól resztkom rozpuszczalnika wyschnąć w okapie wyparowym.

By wytrącić białko. Używając jednorazowego wkładu filtracyjnego, przyłącz korek do górnego wkładu filtracyjnego. Połącz 90 mikrolitrów roztworu białkowego, 10 mikrolitrów jednego mole aquas, chlorku sodu oraz 400 mikrolitrów acetonu.

Inkubuj przez minimum dwie minuty na blacie stołu, wiruj przygotowaną próbkę białka z korek nadal podłączonym do wkładki filtracyjnej przez dwie minuty w temperaturze 2 500 razy G.At temperaturze pokojowej, odwracaj wkład i odkręcaj oraz wyjmij korek z podstawy wkładu. Włóż wkład filtracyjny do czystej fiolki, wirówki białka na trzy minuty w temperaturze 500 G w temperaturze pokojowej. Usuń przepływ przez rozpuszczalnik z dolnej fiolki.

Umyj granulek białkowy, dodając 400 mikrolitrów acetonu do wkładu filtracyjnego, wiruj przez trzy minuty w temperaturze 500 razy G w temperaturze pokojowej lub aż w górnej części wkładu nie pozostanie żaden rozpuszczalnik. Zgodnie z wcześniej zademonstrowanymi protokołami wytrącenia białek. Ponownie rozpuszcza białko, zwilżając błonę u podstawy wkładki filtracyjnej, podawając od dwóch do pięciu mikrolitrów ISO propanolu bezpośrednio do błony bezpośrednio przed przejściem do protokołu ponownej rozpuszczalności granulki białkowej, przygotowując roztwór 80% objętości na objętość kwasu mrówkowego w wodzie.

Schłodź ten roztwór kwasowy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, a wkład filtracyjny zawiera wytrącone białko. Rozdaj 50 mikrolitrów zimnego, rozcieńczonego kwasu mrówkowego do schłodzonej kapsułki i wiru wkładu na 30 sekund. Wkład filtracyjny z powrotem do zamrażarki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 10 minut.

Powtórz poprzednie etapy wiru i inkubacji. Dodaj 450 mikrolitrów wody do końcowej objętości 500 mikrolitrów. Rozcieńczenie kwasu mrówkowego do 8%Odwróć wkład, odkręć i wyjmij korek z podstawy wkładu i przymocuj wkład SPE do fiolki.

Przekręć białko przez wkład SPE w wirówce w temperaturze pokojowej przez pięć minut przy 800 g. Jeśli rozpuszczalnik pozostaje w górnym wkładzie, zwróć wkład do wirówki i powtórz obrót. Przepłucz przez dodanie 300 mikrolitrów 5% acetonitrylu z 0,1% TFA w wodzie do wkładu SPE, przepuszcz przez wkład SPE przez dwie minuty przy 2000 razy G. W przypadku białek o niskiej masie cząsteczkowej lub strawionych peptydów eluuj próbkę przez przepływ 300 mikrolitrów. 50% acetonitrylu z 0,1% TFA przez pięć minut przy 2,500 razy G. Dla nienaruszonych białek.

Następnie wykonuję dodatkowy krok eluzji, z użyciem 300 mikrolitrów 75% acetonitrylu z 0,1% kwasu trifluoro ascetycznego. Połącz oba powstałe fragmenty. Wykres porównuje wyczerpanie SDS po wymroczeniu białek w pojemniku lub wytrąceniu białek w jednorazowym wkładzie filtracyjnym.

Używanie acetonu z konwencjonalnymi protokołami rapid i CMW. Wszystkie podejścia redukują SDS, aby umożliwić optymalną analizę spektrometrii mas. Ten wykres pokazuje ilościowe odzyskiwanie białek poprzez szybkie wytrącanie acetonu i CMW poprzez analizę stron SDS przetworzonego całkowitego lizatu komórek drożdży.

Uzyskano spójną odbudowę przy użyciu wszystkich protokołów opadania. Wytrącanie w jednorazowym wkładzie filtracyjnym eliminuje potrzebę starannego pipetowania supernatantu SDS, jednocześnie zachowując zagregowane białka nad filtrem membranowym. W związku z tym nie wykryto widocznych pasm w frakcjach supernatantów na trzech niezależnych replikacjach.

Wytrącanie białek na bazie wkładu wykazuje lepsze odzyskiwanie próbki osocza bydła po strawieniu Pepsyny w porównaniu do wytrącenia z fiolki. Bardziej istotne różnice w wydajności zauważają w wkładzie – przy użyciu chlorku sodu przy użyciu rozpuszczalnika cynkowego uzyskano najwyższą wydajność. Ten wykres określa maksymalną intensywność peptydu z każdej próbki peptydu o stosunku powyżej jednego, co odzwierciedla wyższą częstość peptydów dla próbek przetwarzanych w jednorazowych wkładach filtracyjnych.

Wykres porównuje liczbę zidentyfikowanych peptydów na białko w trzech preparatach próbek replikacyjnych. Współczynniki korelacji od 0,94 do 0,95 na tych wykresach pokazują wysoką spójność podejścia do przygotowania próbki do analizy spektrometrii masowej oddolnie. Więc gdy ten granulek się uformuje, naprawdę warto go unikać.

Jeśli zostawisz go jako nienaruszony pellet, uzyskasz wyższy plon. Więc pamiętaj, żeby nie zapomnieć umyć tego pelletu dodatkowym acetonem. Dzięki temu pozbywamy się SDS, utrzymując próbkę jak najczystszą, co daje nam najlepszą analizę spektrometrii mas.

Odkryliśmy więc, że usunięcie nadmiaru rozpuszczalnika przez odwrócenie jest znacznie prostsze niż próba pipetowania próbki. W ten sposób uzyskasz bardziej stabilne plony. Przeprowadzenie opadów acetonem w temperaturze pokojowej skutkowało bardziej regularną i szybszą odbudową niż tradycyjne opady w zamrażarce.