Name: Wytrącanie białek na bazie rozpuszczalnika organicznego do solidnej oczyszczania proteomu przed spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj metodę wytrącania białek na bazie rozpuszczalnika organicznego do oczyszczania proteomu przed spektrometrią mas. Protokół zapewnia wysoką wydajność i czystość próbek w zaledwie kilka minut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te zostały sfinansowane przez Kanadyjską Radę ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii. Autorzy dziękują Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Kanada) oraz SPARC BioCentre (Molecular Analysis) w Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) za ich wkład w pozyskiwanie danych o SM.

1. Rozważania materialne i przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Używaj wyłącznie rozpuszczalników o wysokiej czystości (aceton, chloroform, metanol) (>99,5%) oraz chemikaliów, wolnych od nadmiaru wilgoci.</li>
	<li>Przygotuj roztwory chlorku sodu i siarczanu cynku (1 M) w wodzie. UWAGA: Roztwory soli można przechowywać w nieskończoność w temperaturze pokojowej, pod warunkiem że są wolne od zanieczyszczeń lub rozwoju mikroorganizmów.</li>
	<li>Użyj najmniejszej fiolki mikrowirówki z polipropylenu (PP), wystarczającej do zatrzymania wymaganej objętości próbki oraz rozpuszczalników do wytrącenia się z wytrącenia.</li>
	<li>Upewnij się, że stężenie SDS w próbce wytrącanej nie przekracza 2% (w/v). Jeśli SDS jest wyższy, rozcieńcz próbkę wodą.</li>
	<li>Dla optymalnej efektywności wydzielania białka należy zapewnić stężenie białka w zakresie od 0,01 do 10 g/L. UWAGA: Optymalna masa opadów wynosi od 1 do 100 μg białka.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie rozpuszczalniki i roztwory są wolne od cząstek stałych przed użyciem. Wykonaj albo filtrację (<0,5 μm), albo etap wirowania (10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej), aby usunąć nierozpuszczone cząstki.</li>
	<li>Jeśli konieczna jest redukcja wiązań dwusiarczkowych i alkilacja, należy wykonać te kroki przed wytrąceniem białka. Nadmiar reagentów redukujących i alkilujących zostanie usunięty w procesie wytrącenia.</li>
	<li>Wytrącaj białka, wybierając i wykonując jeden z protokołów (kroki 2, 3, 4 lub 5).</li>
</ol>
2. Szybkie wytrącanie białek (na bazie fiolki) za pomocą acetonu
<ol>
	<li>Pipet 90 μL (bezcząstkowo-cząstkowo-białkowego) roztworu białka lub proteomu do rurki mikrowirówki PP. Następnie dodaj 10 μL 1 M wodnego NaCl. UWAGA: Jeśli stężenie jonowe ekstraktu proteomowego przekracza już 100 mM, nie jest potrzebna dodatkowa sól.</li>
	<li>Pipet 400 μL acetonu do próbki. Zakręć fiolkę i delikatnie stuknij w nią, aby połączyć rozpuszczalniki. Nie jest wymagane intensywne mieszanie. UWAGA: Objętość białka, soli i acetonu można zwiększać, o ile utrzymuje się względny stosunek każdego z nich.</li>
	<li>Pozwól fiolce wysiąść w temperaturze pokojowej, bez zakłóceń, przez co najmniej 2 minuty. UWAGA: Dłuższe inkubacje, w tym te w obniżonej temperaturze (np. konwencjonalne wytrącanie acetonu wykorzystuje nocne opady w zamrażarce), mogą prowadzić do powstawania większych (widocznych) zagregowanych cząstek białka (Rysunek 1A), które zazwyczaj nie poprawiają całkowitej regeneracji białka.</li>
	<li>Po inkubacji włóż próbki do wirówki, notując orientację fiolki. Wiruj przez minimum 2 minuty, w temperaturze pokojowej 10 000 x g lub wyższej.</li>
	<li>Odkręć fiolkę i delikatnie przelewając supernatant, powoli odwracając fiolkę do pojemnika na odpady. Dotknij odwróconej fiolki ręcznikiem papierowym, aby pobrać resztki rozpuszczalnika z fiolki. UWAGA: Rozpuszczalniki odpadowe należy zachować i wyrzucać zgodnie z odpowiednimi protokołami.</li>
	<li>W przypadku próbek zawierających SDS należy podać 400 μL świeżego acetonu, uważając, aby nie naruszyć granulki. UWAGA: Krok 2.6 jest opcjonalny.<ol>
		<li>Natychmiast odwiruj próbkę (10 000 x g lub więcej przez 1 minutę w temperaturze pokojowej), umieszczając fiolkę w wirniku w tej samej orientacji, co początkowy obrót. Przelej rozpuszczalnik do mycia zgodnie z krokiem 2.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozwól próbce całkowicie wyschnąć z otwartą nakręciłem (~1 min). Ponownie zakap fiolkę i przystąpi do rozpuszczania granulatów (krok 6).</li>
</ol>
3. Wytrącanie peptydów o niskiej masie cząsteczkowej (LMW) (ZnSO4 + aceton)
<ol>
	<li>Podaję 54 μL ekstraktu proteomowego do fiolki PP o pojemności 2 mL, a następnie dodaj 6 μL 1 M ZnSO4. UWAGA: Optymalne odzyskanie peptydów LMW (≤5 kDa) uzyskuje się przez dodanie acetonu do końcowych 97% objętości. Zakładając fiolkę PP o pojemności 2 mL, maksymalna początkowa objętość próbki wynosi 54 μL.</li>
	<li>Dodaj 1940 μL acetonu do końcowych 97% objętości. Delikatnie mieszaj i zostaw na blacie przez co najmniej 2 minuty.</li>
	<li>Wiruj (10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej) i usuń supernatant, odwracając fiolkę, a następnie dotykając fiolki ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>W przypadku próbek zawierających SDS należy podać 400 μL świeżego acetonu, uważając, aby nie naruszyć granulki. UWAGA: Krok 3.4 jest opcjonalny.<ol>
		<li>Natychmiast odwiruj próbkę zgodnie z krokiem 3.3, umieszczając fiolkę w wirniku w tej samej orientacji co początkowy obrót. Przelej rozpuszczalnik do mycia zgodnie z krokiem 3.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie rozpuszcza powstały suchy pellet w wodnym rozpuszczalniku z krótkim wirowaniem lub sonikacją (~5 min).</li>
</ol>
4. Wytrącanie białek za pomocą chloroformu/metanolu/wody (CMW)
<ol>
	<li>Podaj 100 μL roztworu białka lub proteomu do fiolki PP. Dodaj 400 μL metanolu, a następnie 100 μL chloroformu. Zakręć fiolkę i krótko wymieszać wir. UWAGA: Do opadów CMW preferowane są fiolki o pojemności 1,5 mL o wąskim dnie (Rysunek 2A). UWAGA: Rozpuszczalnik chloroformowy należy obchodzić się w odpowiednim okapie wentylacyjnym. Wszystkie rozpuszczalniki mające kontakt z chloroformem powinny być traktowane jako odpady halogenowane po utylizacji.</li>
	<li>Szybko wylej 300 μL wody bezpośrednio do środka fiolki. Zakręć fiolkę. Pozwól próbce stać na blacie stołu niezakłóconym przez 1 minutę. UWAGA: Rozwiązanie natychmiast będzie wyglądać na mętnobiałe. Unikaj mieszania fiolki po dodaniu wody.</li>
	<li>Umieść fiolkę z PP w wirówce i obróć przez minimum 5 minut (10 000 x g lub więcej w temperaturze pokojowej). UWAGA: Po odwirowaniu powstają dwie widoczne warstwy rozpuszczalnika (warstwa górna = metanol/woda; dolna = chloroform). Na granicy rozpuszczalnika powstaje stały pellet białkowy (Rysunek 2A).</li>
	<li>Używając dużej (1 mL) mikropipety i trzymając fiolkę pod kątem ~45°, usuń ~700 μL rozpuszczalnika z górnej warstwy w równym tempie.</li>
	<li>Użyj mniejszej (200 μL) mikropipety, aby kontynuować usuwanie górnej warstwy rozpuszczalnika z fiolki przechylonej o ~45°. Pipet w jednym ciągłym ruchu, aż górna warstwa rozpuszczalnika utworzy kulkę w fiolce.</li>
	<li>Dodaj 400 μL świeżego metanolu do fiolki próbki, nie naruszając granulki, rozpuszczalnik rozpuszczając wzdłuż krawędzi fiolki.</li>
	<li>Zakręć fiolkę. Połącz warstwy rozpuszczalnika, delikatnie kołysząc fiolkę, aby rozpuszczalniki się mieszały razem. UWAGA: Ważne jest, aby nie zakłócać granulek. Nie wiruj fiolki.</li>
	<li>Zwracając uwagę na orientację fiolki w wirniku, wiruj przez minimum 10 minut (10 000 x g w temperaturze pokojowej). Granulka białkowa przylega do dna fiolki (Rysunek 2B).</li>
	<li>Przechyl fiolkę pod kątem 45°, tak że granulka jest skierowana w dół. Umieść końcówkę pipety wzdłuż górnej krawędzi fiolki i usuń supernatant za pomocą końcówki mikropipety o pojemności 1 mL, powoli, ale w miarę ciągłości. Zachowaj ~20 μL rozpuszczalnika w fiolce.</li>
	<li>Przemyj granulki białkowe dla próbek zawierających SDS, powoli podawając 400 μl świeżego metanolu. Nie wiruj fiolki.<ol>
		<li>Bezpośrednio przeprowadzić wirowanie (10 000 x g przez 2 minuty w temperaturze), umieszczając fiolkę w wirniku z taką samą orientacją, jak początkowy obrót.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń rozpuszczalnik, zgodnie z krokiem 4.9. Pozwól próbce wyschnąć na powietrzu w warstwie oparowej, aż resztki rozpuszczalnika wyparują.</li>
	<li>Zapoznaj się z zalecanymi procedurami resolubilizacji w kroku 6.</li>
</ol>
5. Wytrącanie białek z użyciem jednorazowego wkładu filtracyjnego
UWAGA: Każdy protokół wytrącenia na bazie rozpuszczalnika opisany w krokach 2-5 może być wykonany w dwustopniowym wkładzie filtracyjnym i ekstrakcyjnym (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Po przymocowaniu korka do górnej wkładki filtracyjnej (Rysunek 3A) należy podać pożądaną objętość wyekstrahowanego proteomu, soli i rozpuszczalnika, zgodnie z jedną z trzech poniższych opcji.<ol>
		<li>(Opcja 1) Do wytrącania białek acetonem połącz 90 μL białka lub roztworu proteomowego, 10 μL 1 M wodnego NaCl oraz 400 μL acetonu. Inkubuj przez minimum 2 minuty na blacie stołowym. UWAGA: Widoczny osad pojawi się dla skoncentrowanych próbek białek (1 g/L) (Rysunek 3B).</li>
		<li>(Opcja 2) Do wytrącania peptydów LMW połącz 15 μL próbki, 1,5 μL 1 M ZnSO4 oraz 485 μL acetonu. Inkubuj przez minimum 2 minuty na blacie stołowym. UWAGA: Stężenie soli 90 mM w próbce wodnej nie wpłynie na odzysk w porównaniu do zalecanych 100 mM w kroku 3.</li>
		<li>(Opcja 3) Do wytrącenia CMW należy dodać 50 μL ekstraktu proteomowego, 200 μL metanolu i 50 μL chloroformu. Zakręć fiolkę i krótko zawij w wirze, żeby połączyć.<ol>
			<li>Szybko wylej 150 μL wody bezpośrednio do środka fiolki. Inkubuj przez 1 minutę na blacie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirówka przez 2 minuty w temperaturze 2500 x g w temperaturze pokojowej, z korkiem nadal podłączonym do wkładki filtracyjnej.</li>
	<li>Odwróć wkład, a następnie odkręć i wyjmij korek z podstawy wkładu.</li>
	<li>Włóż wkład filtracyjny do czystej fiolki i wróć do wirówki. Wiruj przez 3 minuty w temperaturze 500 x g w temperaturze pokojowej. Wyrzuć rozpuszczalnik przepływowy z dolnej fiolki. UWAGA: Jeśli w górnej części wkładu filtracyjnego pozostaje rozpuszczalnik, należy wrócić do wirówki i wykonać dodatkowy obrót.</li>
	<li>Przemyj granulat białkowy, dodając 400 μL acetonu do wkładu filtracyjnego (dla wytrącenia CMW, krok 5.1.3, dodaj 400 μL metanolu).</li>
	<li>Wirówka przez 3 minuty w temperaturze 500 x g w temperaturze pokojowej lub aż w górnej części wkładu nie pozostanie żaden rozpuszczalnik.</li>
	<li>Ponownie rozpuszczaj granulat wydzielający zgodnie z krokiem 6.</li>
</ol>
6. Resolubilizacja granulatu białkowego
<ol>
	<li>Membranę u podstawy wkładki filtracyjnej zwilż się, podawając 2-5 μL izopropanolu bezpośrednio do błony tuż przed opisanymi poniżej protokołami resolubilizacji.</li>
	<li>Stosuj jedną z poniższych metod resolubilizacyjnych.<ol>
		<li>(Opcja 1) Do wkładu filtracyjnego dodaj co najmniej 20 μL buforu wodnego zawierającego ≥2% SDS. Cape i vortex energicznie (~1 min). Alternatywnie, sonikować (>10 min), aby rozproszyć granulki białkowe.<ol>
			<li>Podgrzej próbkę w temperaturze 95 °C przez 5 minut). Powtórz proces mieszania po podgrzewaniu. UWAGA: Bufor ładowania żelu Laemmli może ponownie rozpuszczać granulki białkowe. Jednak próbki zawierające SDS są niekompatybilne z trawieniem trypsyny oraz z odwróconą fazą LC i MS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>(Opcja 2) Przygotuj roztwór 80% kwasu mrówkowego (v/v) w wodzie. Wstępnie schłodzić roztwór kwasowy (-20 °C) oraz wkład filtracyjny zawierający wytrącone białko.<ol>
			<li>Do wkładu należy podać 50 μL zimnego kwasu mrówkowego; Cap i Vortex przez 30 sekund. Wróć do zamrażarki (-20 °C) na 10 minut.</li>
			<li>Ponownie przełącz kartridż przez 30 sekund. Następnie powtórz cykl schładzania i mieszania jeszcze raz (10 min, -20 °C, 30 s wiru).</li>
			<li>Dodaj wodę do końcowych 500 μL, rozcieńczając kwas mrówkowy do 8%. UWAGA: Protokół z zimnym kwasem mrówkowym jest niezgodny z późniejszym trawieniem trypsyny, ale jest kompatybilny z LC-MS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>(Opcja 3) Dodaj 50 μL świeżo przygotowanej 8 M mocznika w wodzie do wkładu filtracyjnego. Sonikat przez 30 minut.<ol>
			<li>Pozwól wkładowi inkubować na blacie stołowym przez 1 godzinę (do końca na noc).</li>
			<li>Rozcieńcz mocznik o wielkości 8 m co najmniej 5-krotnie wodą lub odpowiednim buforem. UWAGA: Po rozcieńczeniu protokół rozpuszczalności mocznika jest kompatybilny z dalszym trawieniem trypsyny, a także z LC-MS.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Trawienie białek
<ol>
	<li>Do analizy SM od dołu do góry poddaj ponownie rozpuszczone białka trawieniu enzymatycznemu przy użyciu jednej z dwóch wymienionych poniżej metod.<ol>
		<li>(Opcja 1) Do resolubilizacji kwasem mrówkowym należy zmniejszyć początkową objętość kwasu mrówkowego o 80% w kroku 6.2.2.1 do 25 μL. W kroku 6.2.2.3 użyj 375 μL wody, aby rozcieńczyć kwas mrówkowy do 5% (v/v).</li>
		<li>Pepsynę podawaj do wkładu w stosunku białka do enzymu 50:1. Z zatyczką podłączoną do wkładu filtracyjnego, inkubuj próbkę przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Opcja 2) Aby rozpuścić mocznik, należy ustalić pH w zakresie od 8 do 8,3, dodając 100 mM Trisochloru lub wodorowęglanu amonu w kroku 6.2.3.2.<ol>
		<li>Dodaj trypsynę w stosunku masy białka do enzymu wynoszącym 50:1. Z korkiem przymocowanym do wkładu inkubuj próbkę przez noc w ciepłej kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zakończ trawienie poprzez zakwaszenie roztworu 10% TFA do ostatecznego 1%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskaj białko strawione przez pepsynę lub trypsynę, wyjmując korek z podstawy filtra i wirując wkład umieszczony w czystej fiolce (2 min, 5000 x g, temperatura pokojowa).</li>
</ol>
8. Czyszczenie SPE
UWAGA: W przypadku dodatkowego odsolonienia próbki po strawieniu lub wymianie rozpuszczalnika, próbka może być poddana oczyszczaniu w odwróconej fazie, jak opisano.
<ol>
	<li>Wkład SPE (patrz Tabela materiałów) zapełnij przez przepuszczenie 300 μL metanolu (2 min, 400 x g), a następnie 300 μL 5% acetonitrylu/0,1% TFA (2 min, 400 x g).</li>
	<li>Podłącz wkład SPE z zaparowanym wkładem do podstawy wkładu filtracyjnego zawierającego ponownie rozpuszczone lub strawione białko.</li>
	<li>Przekręć białko przez wkład SPE (5 min, 800 x g w temperaturze pokojowej). Jeśli rozpuszczalnik pozostaje w górnej wkładce, należy ją zwrócić do wirówki i powtórzyć obrót. UWAGA: Ponowne przepuszczenie próbki przez wkład SPE może poprawić proces odzysku.</li>
	<li>Dodaj 300 μL 5% acetonitrylu/0,1% TFA w wodzie do wkładu. Do prania przepuszczaj wkład SPE (2 min, 2000 x g). Zrezygnuj z przepływu.</li>
	<li>W przypadku białek LMW lub strawionych peptydów eluuj próbkę, przepływając 300 μL 50% acetonitrylu/0,1% TFA (5 min, 2500 x g).</li>
	<li>W przypadku białek nienaruszonych należy przejść krok 8.5 z dodatkowym krokiem elucijnym, używając 300 μL 75% acetonitrylu/0,1% TFA. Połącz oba powstałe fragmenty. UWAGA: Krok 8.6 jest opcjonalny.</li>
</ol>

Laboratorium Doucette opracowało i opatentowało ProTrap XG użyty w tym badaniu. AAD jest także współzałożycielem Proteoform Scientific, która skomercjalizowała wkład do przygotowania próbek.

Optymalna charakterystyka SM osiąga się, gdy resztkowy SDS jest wyczerpany poniżej 10 ppm. Podczas gdy alternatywne podejścia, takie jak FASP i trawienie na kulkach, oferują ilościowe wyczerpanie SDS przy zmiennej odzysku 31,32,33, głównym celem wydzielania jest jednoczesne zmaksymalizowanie czystości i wydajności. Zależy to od skutecznej izolacji supernatantu (zawierającego SDS) bez zakłócania granulki białkowej. W przypadku wy...

Analiza proteomu za pomocą spektrometrii masowej stała się coraz bardziej rygorystyczna dzięki zwiększonej czułości, rozdzielczości, szybkości skanowania i wszechstronności nowoczesnych instrumentów MS. Postępy w MS przyczyniają się do większej efektywności identyfikacji białek oraz dokładniejszej ilościowejanalizy 1,2,3,4,5. Dzięki ulepszonej instrumentacji MS badacze wymagają odpowiednio spójnej strategii przygotowania próbki na początku i na początku, zdolnej do ilościowego odzyskania białek o wysokiej czystości w minimalnym czasie na wszystkich etapach przepływu pracy 6,7,8,9,10,11 . Aby dokładnie odzwierciedlić status proteomu układu biologicznego, białka muszą być izolowane z natywnej matrycy próbki w sposób efektywny i obiektywny. W tym celu dołączenie denaturującego surfaktantu, takiego jak siarczan sodu dodecylowy (SDS), zapewnia efektywną ekstrakcję białek i rozpuszczanie12. Jednak SDS silnie zakłóca jonizację elektrosprayową, powodując poważne tłumienie sygnału MS, jeśli nie zostanie prawidłowo wyeliminowana13.
Dostępne są różne strategie zubożania SDS do późniejszych analiz proteomowych, takie jak zatrzymanie białek powyżej filtra granicznego masy cząsteczkowej zawartego w jednorazowych wkładach spinowych 14,15,16. Preferowana jest metoda wspomaganego przygotowywania próbek filtrem (FASP), ponieważ skutecznie zmniejsza poziom SDS poniżej 10 ppm, ułatwiając optymalne MS. Jednak odzyskiwanie białek przy użyciu FASP jest zmienne, co skłoniło do eksploracji innych technik. Podejścia chromatograficzne, które selektywnie wychwytują białko (lub surfaktant), ewoluowały w różne wygodne wkłady lub formaty oparte na kulkach 17,18,19,20,21. Biorąc pod uwagę te proste i (idealnie) spójne strategie oczyszczania białek, klasyczne podejście polegające na wytrącaniu białek za pomocą rozpuszczalników organicznych jest często pomijane jako obiecująca metoda izolacji białek. Chociaż wykazano, że wytrącanie rozpuszczalnika skutecznie wyczerpuje SDS poniżej krytycznych poziomów, odzyskiwanie białek jest od dawna zastrzeżonym problemem tego podejścia. Wiele grup zaobserwowało błąd odzysku białek, z nieakceptowalnie niskimi wydajnościami wydzielin w zależności od stężenia białka, masy cząsteczkowej i hydrofobiczności22,23. Ze względu na różnorodność protokołów opadów opisanych w literaturze, opracowano ustandaryzowane warunki opadowe. W 2013 roku Crowell i in. jako pierwsi opisali zależność siły jonowej od efektywności wydzielania białek w 80% acetonie24. Dla wszystkich badanych białek dodanie do 30 mM chlorku sodu okazało się niezbędne do maksymalizacji plonów (do 100% odzysku). Niedawno Nickerson i in. wykazali, że połączenie jeszcze wyższej siły jonowej (do 100 mM) z podwyższoną temperaturą (20 °C) podczas opadów acetonu dało niemal ilościowe odzyskanie w 2-5 min25. Zaobserwowano niewielki spadek odzysku białek o niskiej masie cząsteczkowej (LMW). Dlatego kolejny raport Baghalabadi i in. wykazał skuteczną zdolność odzyskiwania białek i peptydów LMW (≤5 kDa) poprzez połączenie konkretnych soli, szczególnie siarczanu cynku, z wyższym poziomem rozpuszczalnika organicznego (97% acetonu)26.
Choć udoskonalenie protokołu wytrącenia zapewnia bardziej wiarygodną strategię oczyszczania białek w proteomice opartej na rozsianym rozsianym rozstrzygnięciu (MS), sukces konwencjonalnego wytrącenia w dużej mierze zależy od techniki użytkownika. Głównym celem tych prac jest przedstawienie solidnej strategii wytrącenia, która ułatwi izolację granulki białkowej od zanieczyszczającego supernatantu. Opracowano jednorazowy wkład filtracyjny do eliminacji pipetowania poprzez izolację zagregowanego białka powyżej porowatego filtra membranowego PTFE27. Elementy interferujące z MS w supernatancie są skutecznie usuwane w krótkim, niskoobrotowym kroku wirowania. Jednorazowy wkład filtrujący oferuje także wymienny wkład SPE, który umożliwia późniejsze czyszczenie próbek po resolubilizacji i opcjonalnym trawieniu białek, przed zastosowaniem spektrometrii masowej.
Przedstawiono tutaj szereg zalecanych przepływów opadania proteomu, w tym modyfikowane protokoły acetonu i chloroformu/metanolu/wody28 , w formacie konwencjonalnym (na bazie fiolki) oraz półautomatycznym w jednorazowym wkładzie dwustanowym filtracji i ekstrakcji. Wyróżnione są uzyskane efekty odzyskiwania białek i efektywności wyczerpania SDS, wraz z pokryciem proteomu LC-MS/MS oddolnie nawigowanym, aby pokazać oczekiwany efekt każdego protokołu. Omówione są praktyczne zalety i wady każdego podejścia.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC177170010</td><td>&le; 0,002 % aldehydu</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td>Klasa HPLC</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6141-1KG</td><td>solidny</td></tr><tr><td>Merkaptoetanol beta-beta</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td>Stopień biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>B8026-5G</td><td>Bromofenol z niebieskim sodem</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-400</td><td>Chloroform</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Honeywell</td><td>56302</td><td>Dodatek Eluent dla LC-MS</td></tr><tr><td>Spektrometr mas Fusion Lumos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>do analizy standardowej mieszaniny białek</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>356352-1L-M</td><td>W biologii molekularnej > 99%</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4641</td><td>Klasa HPLC</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452SK-4</td><td>Klasa HPLC</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-400-102</td><td>do 21 000 xg</td></tr><tr><td>Rurka mikrowirówki (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>Zwężane dno</td></tr><tr><td>Rurka mikrowirówkowa &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td>zaokrąglone dno</td></tr><tr><td>Wskazówki do mikropipet; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (0,1-10 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-197-28</td><td>Uniwersalna końcówka pipety, niesterylna</td></tr><tr><td>Wskazówki do mikropipet; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (1-200 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-302</td><td>Uniwersalna końcówka pipety, niesterylna</td></tr><tr><td>Wskazówki do mikropipet; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (200-1000 i mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-303</td><td>Uniwersalna końcówka pipety, niesterylna</td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-710-903</td><td>Pakiet Micropipet Trio</td></tr><tr><td>Pepsyna</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0525000</td><td>Liofilizowany proszek, &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; >3200 jednostek/mg</td></tr><tr><td>ProTrap XG</td><td>Proteoform Scientific</td><td>PXG-0002</td><td>50 kompletnych jednostek na pudełko</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td>Odczynnik ACS, >99%</td></tr><tr><td>Siarczan dodecylosiarczan sodu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28312</td><td>Sproszkowany stały</td></tr><tr><td>Spektrometr mas timsTOF Pro</td><td>Bruker</td><td></td><td>do analizy ekstraktu z proteomu wątroby</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L06374. AP</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Stopień biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-7</td><td>Z trzustki bydła, leczonej TPCK</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Bio-Rad</td><td>1610731</td><td>solidny</td></tr><tr><td>Woda (dejonizowana)</td><td>System oczyszczania wody Sartorius Arium Mini</td><td>76307-662</td><td>Typ 1 ultrapure (18,2 M&Omega; cm)</td></tr><tr><td>Siarczan cynku</td><td>Millipore Sigma</td><td>307491-100G</td><td>solidny</td></tr></tbody></table>

wytrącanie białek na bazie rozpuszczalnika organicznego do solidnej oczyszczania proteomu przed spektrometrią mas

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Chociaż liczne postępy w instrumentach spektrometrii mas (MS) poprawiły jakościową i ilościową analizę proteomów, bardziej niezawodne podejścia front-end do izolowania, wzbogacania i przetwarzania białek przed MS są kluczowe dla skutecznej charakterystyki proteomu. Niski, nieregularny odzysk białek oraz resztkowe zanieczyszczenia, takie jak surfaktanty, są szkodliwe dla analizy SM. Wytrącanie białek jest często uważane za zawodne, czasochłonne i technicznie trudne w porównaniu z innymi strategiami przygotowania próbek. Te obawy można przezwyciężyć poprzez zastosowanie optymalnych protokołów wytrącenia białek. W przypadku wytrącania acetonem kluczowe jest połączenie konkretnych soli, kontrola temperatury, skład rozpuszczalnika oraz czas wytrącenia, natomiast efektywność wytrącania chloroformu/metanolu/wody zależy od prawidłowego pipetowania i manipulacji fiolkami. Alternatywnie, te protokoły opadów są uproszczone i półautomatyczne w jednorazowym wkładzie wirującym. Oczekiwane wyniki wytrącenia białek na bazie rozpuszczalnika w konwencjonalnym formacie oraz przy użyciu jednorazowego, dwustopniowego wkładu filtracyjnego i ekstrakcyjnego zostały przedstawione w niniejszej pracy. Obejmuje to szczegółową charakterystykę mieszanin proteomicznych za pomocą analizy LC-MS/MS od dołu do góry. Lepsza wydajność przepływów opartych na SDS jest również wykazywana w porównaniu do białek nieskażonych.

Rysunek 4 podsumowuje oczekiwane wyczerpanie SDS po wytrąceniu białek z fiolki lub wkładów w jednorazowym wkładzie filtracyjnym z użyciem acetonu. Konwencjonalna inkubacja nocna (-20 °C) w acetonie jest porównywana z protokołem szybkiego wytrącania acetonu w temperaturze pokojowej (krok 2), a także z wytrącaniem CMW (krok 4). Pozostałe SDS zostało zmierzone ilościowo za pomocą testu aktywnych substancji methylenowych (MBAS)29. Krótko mówiąc, próbkę 100 μL połączono z ...

Niniejszy protokół opisuje wytrącanie białek na bazie rozpuszczalnika w kontrolowanych warunkach, co zapewnia solidne i szybkie odzyskiwanie oraz oczyszczanie próbek proteomu przed spektrometrią mas.

Wytrącanie białek na bazie rozpuszczalnika organicznego do solidnej oczyszczania proteomu przed spektrometrią mas

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Protokoły te zostały zaprojektowane tak, aby maksymalizować odzysk oraz czystość białek dzięki wytrąceniu na bazie rozpuszczalnika. Pokażemy wam kilka trików na wydzielanie opadów w fiolkach, a także półautomatyczne podejście w formacie kartridża obrotowego. Zoptymalizowaliśmy również protokół opadów tak, aby był spójny i szybki.Cały protokół zajmuje tylko kilka minut. Protokoły te pokazują, że wytrącanie białek przez rozpuszczalnik jest idealne do przygotowania próbki przed spektrometrią mas. Protokoły będą idealnie pasować zarówno do workflow od dołu do góry, jak i od góry do dołu dla profesjonalistów.Dziś zademonstrują nam Ziheng Dang i Victoria Miller, starsza naukowczyni w Proteoform Scientific w Halifax, Nowa Szkocja, Pipette 90 mikrolitrów roztworu białka wolnego od cząstek w mikrowirówce polipropylenowej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów jednego mola chlorku sodu wodnego i 400 mikrolitrów acetonu do roztworu próbki, zakręć i delikatnie stuknąć w fiolkę, aby połączyć rozpuszczalniki. Pozwól fiolce się wychować.W temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie minuty po inkubacji, odwiruj próbki, notując orientację fiolki i obracaj przez co najmniej dwie minuty przy temperaturze 10 000 RCF lub wyższej w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu widoczny jest biały granulek na dnie rurki. W tym momencie odkręć rurkę i przelać supernat do pojemnika na odpady, odwracając rurkę.Użyj ręcznika papierowego, aby wyciągnąć resztki rozpuszczalnika z fiolki. Dla SDS zawierających próbki. Ostrożnie podawaj 400 mikrolitrów świeżego acetonu, nie naruszając granulatu.Natychmiast centruj próbkę na minutę przy temperaturze 10 000 G lub wyższej w temperaturze pokojowej, umieszczając fiolkę w wirniku w tej samej orientacji, co początkowy obrót. Zlicz rozpuszczalnik do mycia tak, jak opisano wcześniej. Susz próbkę z otwartą kapslą przez około minutę.W okapu wyparowym, przed rozpuszczeniem peletów. Podaj 100 mikrolitrów roztworu białkowego do fiolki z polipropylenu. Do okapu wypalającego dodaj 400 mikrolitrów metanolu, a następnie 100 mikrolitrów chloroformu.Zakręć fiolkę i krótko wymieszać wir. Szybko wydaj 300 mikrolitrów wody bezpośrednio do środka fiolki. Zakręć fiolkę i pozwól jej stać na blacie stołu przez minutę, następnie umieść fiolkę z polipropylenem w wirówce i obracaj przez pięć minut w temperaturze 10 000 G lub wyższej w temperaturze pokojowej.Obserwowano, że fiolka ma dwie warstwy rozpuszczalnika oraz widoczny biały kulkę aż do fiolki pod kątem około 45 stopni. Usuń około 700 mikrolitrów rozpuszczalnika z górnej warstwy w jednolitej szybkości, początkowo używając dużej mikropipety o pojemności jednego mililitra, a później końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aż utworzy się kulka w fiolce. Dodaj 400 mikrolitrów świeżego metanolu do fiolki próbki, nie naruszając granulacji, rozpuszczalnik rozpuszczalnik rozpuszczając wzdłuż boku fiolki.Zakręć fiolkę i połącz warstwy rozpuszczalnika, delikatnie kołysząc ją, aby rozpuszczalniki się mieszały razem. Aby obserwować biały granulek białkowy, notując orientację fiolki w wirówce wirnikowej przez co najmniej 10 minut przy temperaturze 10 000 G lub wyższej w temperaturze pokojowej. Ustawij fiolkę pod kątem tak, że granulat jest skierowany w dół.Umieść końcówkę pipety wzdłuż górnej krawędzi fiolki i usuń supernatant mikropipetą o średnicy jednego mililitra, powoli, ale równomiernie. Zachowując około 20 mikrolitrów rozpuszczalnika. Pozwól resztkom rozpuszczalnika wyschnąć w okapie wyparowym.By wytrącić białko. Używając jednorazowego wkładu filtracyjnego, przyłącz korek do górnego wkładu filtracyjnego. Połącz 90 mikrolitrów roztworu białkowego, 10 mikrolitrów jednego mole aquas, chlorku sodu oraz 400 mikrolitrów acetonu.Inkubuj przez minimum dwie minuty na blacie stołu, wiruj przygotowaną próbkę białka z korek nadal podłączonym do wkładki filtracyjnej przez dwie minuty w temperaturze 2 500 razy G.At temperaturze pokojowej, odwracaj wkład i odkręcaj oraz wyjmij korek z podstawy wkładu. Włóż wkład filtracyjny do czystej fiolki, wirówki białka na trzy minuty w temperaturze 500 G w temperaturze pokojowej. Usuń przepływ przez rozpuszczalnik z dolnej fiolki.Umyj granulek białkowy, dodając 400 mikrolitrów acetonu do wkładu filtracyjnego, wiruj przez trzy minuty w temperaturze 500 razy G w temperaturze pokojowej lub aż w górnej części wkładu nie pozostanie żaden rozpuszczalnik. Zgodnie z wcześniej zademonstrowanymi protokołami wytrącenia białek. Ponownie rozpuszcza białko, zwilżając błonę u podstawy wkładki filtracyjnej, podawając od dwóch do pięciu mikrolitrów ISO propanolu bezpośrednio do błony bezpośrednio przed przejściem do protokołu ponownej rozpuszczalności granulki białkowej, przygotowując roztwór 80% objętości na objętość kwasu mrówkowego w wodzie.Schłodź ten roztwór kwasowy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, a wkład filtracyjny zawiera wytrącone białko. Rozdaj 50 mikrolitrów zimnego, rozcieńczonego kwasu mrówkowego do schłodzonej kapsułki i wiru wkładu na 30 sekund. Wkład filtracyjny z powrotem do zamrażarki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 10 minut.Powtórz poprzednie etapy wiru i inkubacji. Dodaj 450 mikrolitrów wody do końcowej objętości 500 mikrolitrów. Rozcieńczenie kwasu mrówkowego do 8%Odwróć wkład, odkręć i wyjmij korek z podstawy wkładu i przymocuj wkład SPE do fiolki.Przekręć białko przez wkład SPE w wirówce w temperaturze pokojowej przez pięć minut przy 800 g. Jeśli rozpuszczalnik pozostaje w górnym wkładzie, zwróć wkład do wirówki i powtórz obrót. Przepłucz przez dodanie 300 mikrolitrów 5% acetonitrylu z 0,1% TFA w wodzie do wkładu SPE, przepuszcz przez wkład SPE przez dwie minuty przy 2000 razy G. W przypadku białek o niskiej masie cząsteczkowej lub strawionych peptydów eluuj próbkę przez przepływ 300 mikrolitrów. 50% acetonitrylu z 0,1% TFA przez pięć minut przy 2,500 razy G. Dla nienaruszonych białek.Następnie wykonuję dodatkowy krok eluzji, z użyciem 300 mikrolitrów 75% acetonitrylu z 0,1% kwasu trifluoro ascetycznego. Połącz oba powstałe fragmenty. Wykres porównuje wyczerpanie SDS po wymroczeniu białek w pojemniku lub wytrąceniu białek w jednorazowym wkładzie filtracyjnym.Używanie acetonu z konwencjonalnymi protokołami rapid i CMW. Wszystkie podejścia redukują SDS, aby umożliwić optymalną analizę spektrometrii mas. Ten wykres pokazuje ilościowe odzyskiwanie białek poprzez szybkie wytrącanie acetonu i CMW poprzez analizę stron SDS przetworzonego całkowitego lizatu komórek drożdży.Uzyskano spójną odbudowę przy użyciu wszystkich protokołów opadania. Wytrącanie w jednorazowym wkładzie filtracyjnym eliminuje potrzebę starannego pipetowania supernatantu SDS, jednocześnie zachowując zagregowane białka nad filtrem membranowym. W związku z tym nie wykryto widocznych pasm w frakcjach supernatantów na trzech niezależnych replikacjach.Wytrącanie białek na bazie wkładu wykazuje lepsze odzyskiwanie próbki osocza bydła po strawieniu Pepsyny w porównaniu do wytrącenia z fiolki. Bardziej istotne różnice w wydajności zauważają w wkładzie – przy użyciu chlorku sodu przy użyciu rozpuszczalnika cynkowego uzyskano najwyższą wydajność. Ten wykres określa maksymalną intensywność peptydu z każdej próbki peptydu o stosunku powyżej jednego, co odzwierciedla wyższą częstość peptydów dla próbek przetwarzanych w jednorazowych wkładach filtracyjnych.Wykres porównuje liczbę zidentyfikowanych peptydów na białko w trzech preparatach próbek replikacyjnych. Współczynniki korelacji od 0,94 do 0,95 na tych wykresach pokazują wysoką spójność podejścia do przygotowania próbki do analizy spektrometrii masowej oddolnie. Więc gdy ten granulek się uformuje, naprawdę warto go unikać.Jeśli zostawisz go jako nienaruszony pellet, uzyskasz wyższy plon. Więc pamiętaj, żeby nie zapomnieć umyć tego pelletu dodatkowym acetonem. Dzięki temu pozbywamy się SDS, utrzymując próbkę jak najczystszą, co daje nam najlepszą analizę spektrometrii mas.Odkryliśmy więc, że usunięcie nadmiaru rozpuszczalnika przez odwrócenie jest znacznie prostsze niż próba pipetowania próbki. W ten sposób uzyskasz bardziej stabilne plony. Przeprowadzenie opadów acetonem w temperaturze pokojowej skutkowało bardziej regularną i szybszą odbudową niż tradycyjne opady w zamrażarce.

organic-solvent-based-protein-precipitation-for-robust-proteome

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Cyfrowa mikroprzepływność to technika polegająca na manipulowaniu pojedynczymi kroplami (~nL - mL) na macierzy elektrod poprzez przykładanie pól elektrycznych. Jest ona odpowiednia do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Wiarygodność wyników eksperymentów metabolomicznych zależy od skuteczności i powtarzalności przygotowania próbki. Opisana jest rygorystyczna i dogłębna metoda, która umożliwia ekstrakcję metabolitów z płynów biologicznych z możliwością późniejszej analizy do tysięcy związków lub tylko klas związków będących przedmiotem zainteresowania.

Wieloetapowa technika przygotowania do odzyskiwania wielu klas związków metabolitów w celu dogłębnej i pouczającej analizy metabolomicznej

Ten protokół służy do ekstrakcji i koncentracji białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej zebranej z wody morskiej, a następnie do generowania peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas.

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Obecny protokół opisuje ekstrakcję aminokwasów niebiałkowych z matryc biologicznych poprzez wytrącanie białek kwasu trichlorooctowego (TCA) i hydrolizę kwasową przed analizą za pomocą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas.

Ekstrakcja aminokwasów niebiałkowych z cyjanobakterii do analizy chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas

Ten protokół opisuje metodę pobierania próbek łez za pomocą pasków Schirmera oraz zintegrowany ilościowy przepływ pracy do odkrywania nieinwazyjnych biomarkerów białka łez. Proces przygotowania próbki do wychwytywania zawiesiny umożliwia szybkie i niezawodne przygotowanie próbki do rozdarcia oraz analizę spektrometryczną mas, co skutkuje wyższą wydajnością odzyskiwania peptydów i identyfikacją białek niż standardowe procedury w roztworze.

Przygotowanie próbki zatrzymującej zawiesinę białek do proteomiki łez metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Poznaj metodę wytrącania białek na bazie rozpuszczalnika organicznego do oczyszczania proteomu przed spektrometrią mas. Protokół zapewnia wysoką wydajność i czystość próbek w zaledwie kilka minut.

Wytrącanie białek na bazie rozpuszczalnika organicznego do solidnej oczyszczania proteomu przed spektrometrią mas

Przeglądaj więcej filmów