Name: Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawino-5′-fosforanu ryboflawiny w świetle widzialnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj metodę inaktywacji patogenów bakteryjnych, takich jak Staphylococcus aureus i E.coli, poprzez fotolizę ryboflawino-5′-fosforanu w świetle widzialnym. Protokół ten znajduje zastosowanie w terapii ran oraz w sanitacji przemysłu spożywczego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni dr Tak-Wah Wong i panu Zong-Jhe Hsieh za ich wsparcie w eksperymentach.

1. Konfiguracja układu do fotolizy
<ol>
	<li>Zamontuj sześć diod elektroluminescencyjnych (LED) (DC 12 V) wewnątrz nieprzezroczystego plastikowego kubka (8 cm x 7 cm), jak pokazano na Rysunku 1, aby stworzyć układ do fotolizy31.</li>
	<li>Wprowadź odczynniki (patrz poniżej) do szklanych probówek (o średnicy 13 mm i wysokości 100 mm) i zamocuj probówki u góry kubka, jak pokazano na Rysunku 1. Umieść układ eksperymentalny w pomieszczeniu o stabilnej temperaturze 25 ± 3 °C.</li>
	<li>Monitoruj i zapisuj temperaturę jednostek badawczych podczas reakcji fotolitycznych za pomocą termometru na podczerwień. 
	UWAGA: Rysunek 2 przedstawia widma emisyjne dla światła niebieskiego, zielonego, czerwonego i fioletowego, zarejestrowane za pomocą skalibrowanego spektrometru optycznego UV-Vis. Długości fal odpowiadające maksimum absorbancji dla niebieskich, zielonych, czerwonych i fioletowych diod LED użytych w badaniu wynoszą odpowiednio 465, 529, 632 i 405 nm. Chipsety LED mogą nagrzewać aparat podczas eksperymentów z naświetlaniem. Dlatego cały układ fotoreakcyjny w każdym doświadczeniu był umieszczany w pomieszczeniu, w którym temperaturę utrzymywano na stałym poziomie 25 ± 3 °C.</li>
</ol>
2. Wpływ długości fali światła na fotolizę FMN (Rycina 3)
<ol>
	<li>Przygotować 0,1 mM roztwór FMN w 100 mM buforze fosforanowym (PB) (pH 7,8). Próbki FMN (po 3 mL każda) naświetlać światłem niebieskim, zielonym, czerwonym lub fioletowym o natężeniu 10 W/m2 przez 5 min. 3 mL roztworu FMN przechowywać w ciemności jako próbkę kontrolną.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję naświetlonych próbek FMN w zakresie 250-750 nm przy użyciu spektrofotometru UV/Vis.</li>
</ol>
3. Metoda redukcji nitro błękitu tetrazoliowego (NBT) do wykrywania <img alt="Rodnik anionowy ponadtlenkowy O2−; wzór chemiczny; obecność wolnego rodnika w procesach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> (Rysunek 4).
UWAGA: Zastosowana tutaj metoda redukcji NBT została lekko zmodyfikowana względem testu fotoreakcji ryboflawiny. Metoda redukcji NBT służy do oceny poziomu <img alt="Rodnik anionowy ponadtlenkowy O2−; wzór chemiczny; obecność wolnego rodnika w procesach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"> generowanego w wyniku fotolizy FMN. Fotochemicznie wzbudzony FMN jest najpierw redukowany przez L-metioninę do semichinonu, który następnie przekazuje elektron tlenowi, prowadząc do powstania <img alt="Rodnik anionowy ponadtlenkowy O2−; wzór chemiczny; obecność wolnego rodnika w procesach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1">31. Powstały <img alt="Rodnik anionowy ponadtlenkowy O2−; wzór chemiczny; obecność wolnego rodnika w procesach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"> redukuje NBT do formazanu, który wykazuje charakterystyczną absorbancję przy 560 nm32.
<ol>
	<li>Do 73,3 mL buforu PB (100 mM; pH 7,8) dodać 109,3 mg L-metioniny. Roztwór wymieszać na wirówce typu vortex do rozpuszczenia L-metioniny.</li>
	<li>Po całkowitym rozpuszczeniu L-metioniny dodać do roztworu 10 mg proszku NBT oraz 1,53 mL 0,117 mM FMN. W przypadku zastosowania każdego 1 mL roztworu reakcyjnego (tj. mieszaniny FMN, L-metioniny i NBT), końcowe stężenia FMN, metioniny i NBT wynoszą odpowiednio 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M oraz 1,6 x 10-4 M.</li>
	<li>Roztwór reakcyjny (1 mL) naświetlać niebieskim lub fioletowym światłem LED o natężeniu 10 W/m2 przez 1–5 min.</li>
	<li>Wykryć gatunki <img alt="Rodnik anionowy ponadtlenkowy O2−; wzór chemiczny; obecność wolnego rodnika w procesach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> powstałe w wyniku reakcji fotochemicznej, która redukuje NBT i prowadzi do powstania formazanu (na podstawie absorbancji przy 560 nm).</li>
</ol>
4. S. aureus żywotność po fotolizie FMN (Rycina 5)
<ol>
	<li>Przenieś kolonię S. aureus (BCRC 10451) z płytki hodowlanej do 10 mL bulionu Lysogeny w probówce z nakrętką o pojemności 15 mL. Hoduj w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 16 h.</li>
	<li>Przenieś 0,5 mL hodowli do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL. Dodaj do probówki sterylną wodę, aby rozcieńczyć hodowlę do gęstości optycznej 0,5 przy 600 nm (OD600) (~6 x 107 CFU/mL).</li>
	<li>Przenieś 0,5 mL hodowli do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL, wiruj przy 14 000 x g przez 10 min i odlej nadsącz, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
	<li>Dodaj 1 mL roztworu buforowanego FMN (30, 60 i 120 µM FMN w PB) do osadów komórkowych uzyskanych zgodnie z krokiem 4.3, a następnie wymieszaj w wortexie. Dla kontroli naświetlanej dodaj 1 mL samego PB.</li>
	<li>Przenieś po 1 mL roztworów żywych komórek bakteryjnych zawierających 30 µM FMN oraz samego PB do probówek szklanych i naświetlaj je światłem fioletowym o natężeniu 10 W/m2 przez 30 min.</li>
	<li>Przenieś po 1 mL roztworów żywych komórek bakteryjnych zawierających 30, 60 i 120 µM FMN oraz samego PB do probówek szklanych i naświetlaj je światłem niebieskim o natężeniu 20 W/m2 przez 120 min. Przygotuj kolejną probówkę szklaną z 1 mL roztworu żywych komórek bakteryjnych zawierającego 120 µM FMN i naświetlaj ją światłem niebieskim o natężeniu 20 W/m2 przez 60 min.</li>
	<li>Przygotuj probówki zgodnie z opisem w krokach 4.5 i 4.6 i owiń je grubą folią aluminiową. Probówki te służą jako kontrole w ciemności.</li>
	<li>Przez czas naświetlania (30-120 min) utrzymuj komorę naświetlającą (jak i kontrole w ciemności) w pomieszczeniu chłodniczym w temperaturze 9 ± 1 °C. 
	UWAGA: Nie można pominąć kwestii ciepła wydzielanego przez diody LED, ponieważ chipy LED umieszczone wewnątrz naczynia mogą nagrzewać układ fotoreakcyjny podczas eksperymentów z naświetlaniem. Dlatego eksperymenty przeprowadzano w pomieszczeniu chłodniczym w temperaturze 9 ± 1 °C.</li>
	<li>Po naświetlaniu przenieś 0,2 mL z każdego z roztworów reakcyjnych na płytkę z agarem Luria (LA). Rozsiej bakterie po płytce za pomocą szklanego rozprowadzacza w kształcie litery L i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Oblicz liczbę kolonii żywych oraz wskaźniki inaktywacji S. aureus po nocnej inkubacji. 
	UWAGA: Wskaźnik inaktywacji S. aureus oblicza się jako procentową redukcję, która jest równa [1 -I / D] ×100%, gdzie I i D oznaczają odpowiednio liczbę CFU w próbce naświetlanej i w kontroli w ciemności. Procentowa redukcja jest definiowana jako ujemna wartość wskaźnika inaktywacji.</li>
</ol>
5. Detekcja <img alt="Rodnik anionowy ponadtlenkowy O2−; wzór chemiczny; obecność wolnych rodników w procesach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> w S. aureus (Rycina 6)
<ol>
	<li>Przygotować próbki S. aureus zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
	<li>Rozcieńczyć gęstość bakterii w próbkach sterylną wodą do gęstości optycznej 0,5 przy 600 nm (OD600, ~6 x 106 CFU/mL). Przenieść 0,5 mL hodowli do probówki do wirowania o pojemności 1,5 mL. Wirować przy 14 000 x g przez 10 min i odlać nadsącz, aby uzyskać pellet komórkowy.</li>
	<li>Do 75 mL PB dodać 0,1093 g L-metioniny, 0,1 g NBT oraz 25 mL FMN (400, 240 lub 120 µM). Dla każdego 1 mL zastosowanego odczynnika końcowe stężenia FMN, metioniny i NBT wynoszą odpowiednio 100 (60 lub 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M oraz 1,2 x 10-3 M.</li>
	<li>Do pelletów komórkowych uzyskanych w kroku 5.2 dodać 1 mL każdego roztworu odczynnika (tj. z różnymi stężeniami FMN). Naświetlać roztwory światłem fioletowym o natężeniu 10 W/m2 przez 10 min.</li>
	<li>Wirować mieszaninę przy 14 000 x g przez 10 min i odlać nadsącz. Resuspendować pellet w 1 mL dimetylosulfotlenku (DMSO), aby wyekstrahować zredukowany NBT. Wykryć wytworzone gatunki <img alt="Rodnik anionowy ponadtlenkowy O2−; wzór chemiczny; obecność wolnego rodnika w procesach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> na podstawie absorbancji przy 560 nm.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Dane należy przedstawić jako średnią ± odchylenie standardowe (SD) z trzech niezależnych prób.</li>
	<li>W celu oceny różnic między dwoma pomiarami należy zastosować homoskedastyczny test t dla dwóch prób. Wartości p- &lt; 0,05 uznaje się za istotne statystycznie.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Fotousensybilizator zwiększa reakcję fotochemiczną związków chemicznych w celu generowania ROS. Patogenne mikroorganizmy mogą zostać inaktywowane poprzez naświetlanie światłem w obecności fotousensybilizatorów. Niniejsze badanie określa aPDI dla S. aureus wywołane przez ROS generowane przez naświetlanie światłem fioletowym egzogennego fotousensybilizatora, FMN.
Jak pokazano na Rysunku 3, w przypadku FMN absorbancja przy 444 nm ulega znacznemu zmniejszeniu...

Ryboflawina-5′-fosforan (FMN) powstaje w wyniku fosforylacji w pozycji 5′ ryboflawiny w łańcuchu bocznym rybitylu i jest niezbędna wszystkim flawoproteinom do generowania energii w licznych procesach komórkowych. Pełni ona również rolę witaminy w niektórych funkcjach organizmu człowieka1. FMN jest około 200 razy bardziej rozpuszczalna w wodzie niż ryboflawina2.
 antybakteryjna inaktywacja fotodynamiczna (aPDI) bakterii jest skuteczną metodą zwalczania oporności bakterii3,4, ponieważ nie zależy ona od mechanizmu oporności bakteryjnej. W praktyce klinicznej aPDI stosuje się w leczeniu infekcji tkanek miękkich w celu zmniejszenia częstotliwości występowania szpitalnych zakażeń skóry wywołanych przez bakterie wielolekooporne5,6,7,8,9. aPDI powoduje również śmierć komórek poprzez generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). ROS, takie jak rodniki ponadtlenkowe (<img alt="Rodnik anionowy ponadtlenkowy O2−; wzór chemiczny; obecność wolnego rodnika w procesach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">), tlen singletowy, rodniki hydroksylowe (•OH) oraz rodniki nadtlenkowe, to wolne rodniki lub cząsteczki zawierające reaktywny tlen10,11,12, które zazwyczaj wykazują wysoką reaktywność13. Podobnie jak uszkodzenia DNA powodowane przez ROS, peroksydacja błon oraz destrukcja komórek śródbłonka są również niekorzystnymi reakcjami biochemicznymi przypisywanymi działaniu ROS w komórkach12.
Zastosowanie aPDI przeciwko bakteriom patogennym wymaga użycia źródła światła widzialnego lub UV w celu inaktywacji mikroorganizmów w obecności związków chemicznych, takich jak chlorek metylotioniniumu14, koniugat PEI-ce615, porfiryna16, dwutlenek tytanu17, błękit toluidyny O18 oraz nanocząsteczki tlenku cynku19. Błękit toluidyny O i błękit metylenowy są barwnikami fenotiazyniowymi, przy czym błękit metylenowy posiada właściwości toksyczne. Nanocząsteczki tlenku cynku oraz naświetlanie UV są powiązane z niekorzystnymi skutkami zdrowotnymi i środowiskowymi. W związku z tym dalsze badania nad wykorzystaniem niezawodnego, bezpiecznego i prostego fotouczulacza via fotolizę pod wpływem promieniowania widzialnego są w pełni uzasadnione.
Mikroskładnik, ryboflawina lub FMN, nie jest toksyczny i jest w rzeczywistości stosowany w produkcji żywności lub jako dodatek paszowy20. Zarówno FMN, jak i ryboflawina wykazują wysoką wrażliwość na napromieniowanie światłem2. Pod wpływem promieniowania UV1,2,21,22,23 oraz światła niebieskiego10,24 obie te substancje przechodzą w stan wzbudzony. Aktywowana ryboflawina lub FMN powstająca w wyniku fotolizy zostaje przeniesiona do stanu trypletowego, co prowadzi do jednoczesnego generowania ROS2,25. Kumar i wsp. wykazali, że ryboflawina aktywowana światłem UV selektywnie powoduje zwiększone uszkodzenia fragmentu guaniny w DNA drobnoustrojów chorobotwórczych26. Wykazano, że podczas napromieniowania światłem UV fotodynamicznie aktywowana ryboflawina stymuluje generowanie 8-OH-dG, będącego biomarkerem stresu oksydacyjnego, w dwuniciowym DNA27. Doniesiono, że S. aureus oraz E. coli ulegają dezaktywacji przez ROS podczas fotolizy ryboflawiny lub FMN10,24,28. Wcześniejsza praca autorów wykazała, że reakcje fotolityczne z udziałem ryboflawiny i FMN redukują fiolet krystaliczny – barwnik triarylmetanowy i środek przeciwbakteryjny, który generuje <img alt="Rodnik anionowy ponadtlenkowy O2−; wzór chemiczny; obecność wolnego rodnika w procesach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> – oraz eliminują większość zdolności przeciwdrobnoustrojowych fioletu krystalicznego28. Podczas napromieniowania flawinowego dinukleotydu adeninowego lub FMN światłem niebieskim, powstałe ROS indukują apoptozę w komórkach HeLa w wyniku ich zatrucia in vitro29. Stosując obróbkę fotochemiczną w obecności ryboflawiny, Cui i wsp. inaktywowali limfocyty poprzez hamowanie ich proliferacji oraz produkcji cytokin30.
Fotoliza ryboflawiny jest wykorzystywana do inaktywacji patogenów krwi za pomocą promieniowania UV10,24, jednak składniki krwi mogą ulec uszkodzeniu pod wpływem naświetlania promieniami UV30. Doniesiono również, że płytki krwi poddane działaniu promieniowania UV wykazują postępujący wzrost ekspresji markerów aktywacji P-selektyny i LIMP-CD63 na swoich błonach. Należy zbadać cytotoksyczność promieniowania UV oraz naświetlania o wysokiej intensywności; niezwykle przydatny byłby zatem prosty i bezpieczny fotouczulacz do fotoreakcji FMN z wykorzystaniem światła widzialnego.
Światło o krótszych długościach fal posiada większą energię i z znacznie większym prawdopodobieństwem powoduje poważne uszkodzenia komórek. Jednakże, w obecności odpowiedniego fotouczulacza, naświetlanie fioletowym światłem o niskim natężeniu może hamować rozwój drobnoustrojów chorobotwórczych. Z tego powodu istotne jest zbadanie procesu fotouczulania oraz generowania <img alt="Rodnik anionowy ponadtlenkowy O2−; wzór chemiczny; obecność wolnego rodnika w procesach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> przez FMN podczas naświetlania światłem fioletowym, aby określić drogę, poprzez którą ROS powstałe w wyniku fotolizy FMN zwiększają inaktywację bakterii.
Kontrola drobnoustrojów jest powszechnym problemem, a opracowywanie nowych antybiotyków często trwa dziesięciolecia. Po naświetlaniu światłem fioletowym fotoinaktywacja pośredniczona przez FMN może eliminować środowiskowe bakterie patogenne. Niniejsze badanie przedstawia skuteczny protokół przeciwdrobnoustrojowy in vitro z wykorzystaniem światła fioletowego do napędzania fotolizy FMN i w ten sposób generowania <img alt="Rodnik anionowy ponadtlenkowy O2−; wzór chemiczny; obecność wolnego rodnika w procesach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> dla aPDI. Do określenia wykonalności aPDI indukowanego przez FMN wykorzystano żywotność drobnoustrojów S. aureus.

<table><tbody><tr><td>Niebieskie, zielone i czerwone światła LED</td><td>Vita LED Technologies Co., Tainan, Tajwan</td><td></td><td>DC 12 V 5050</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>190186</td><td></td></tr><tr><td>Termometr na podczerwień</td><td>Raytek Co. Santa Cruz, CA</td><td>MT4</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion</td><td>Difco Co., NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>1.05707</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>China tech Co., Nowe Tajpej, Tajwan</td><td>YP30-3-2</td><td></td></tr><tr><td>5&prime;-fosforan ryboflawiny</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R7774</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Licznik energii słonecznej</td><td>Tenmars Electronics Co., Tajpej, Tajwan</td><td>TM-207</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus subsp. aureus</td><td>Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Tajwan</td><td>10451</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr optyczny UV-Vis</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>USB4000</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokio, Japonia</td><td>U-2900</td><td></td></tr><tr><td>Fioletowa dioda LED</td><td>Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, Chińska Republika Ludowa</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawino-5′-fosforanu ryboflawiny w świetle widzialnym

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Ryboflawina-5'-fosforan (lub mononukleotyd flawinowy; FMN) jest wrażliwa na światło widzialne. W wyniku fotolizy FMN pod wpływem promieniowania światłem widzialnym mogą powstawać różne związki, w tym reaktywne formy tlenu (ROS). ROS powstające podczas fotolizy FMN są szkodliwe dla mikroorganizmów, w tym dla bakterii patogennych, takich jak Staphylococcus aureus (S. aureus). Niniejszy artykuł przedstawia protokół dezaktywacji S. aureus jako przykładu poprzez reakcje fotochemiczne z udziałem FMN pod wpływem promieniowania światłem widzialnym. Anion rodnikowy ponadtlenkowy (<img alt="Jon ponadtlenkowy, O₂⁻, struktura chemiczna, analiza reakcji redoks, wzór cząsteczkowy." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">) powstający podczas fotolizy FMN jest oceniany poprzez redukcję nitro błękitu tetrazolium (NBT). Do określenia skuteczności procesu wykorzystano przeżywalność drobnoustrojów S. aureus uzależnioną od reaktywnych form <img alt="Jon ponadtlenkowy, O₂⁻, struktura chemiczna, analiza reakcji redoks, wzór cząsteczkowy." src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">. Szybkość inaktywacji bakterii jest proporcjonalna do stężenia FMN. Światło fioletowe jest bardziej efektywne w inaktywacji S. aureus niż promieniowanie światłem niebieskim, natomiast światło czerwone lub zielone nie indukuje fotolizy FMN. Niniejszy artykuł demonstruje fotolizę FMN jako prostą i bezpieczną metodę w procesach sanitarnych.

Wpływ długości fali światła na FMN 
Widma absorbancji 0,1 mM FMN naświetlanego niebieskimi, zielonymi, czerwonymi i fioletowymi diodami LED przedstawiono na rycinie 3. W przypadku kontroli w ciemności dla FMN występują dwa piki (372 nm i 444 nm). Światło zielone i czerwone nie wykazuje wpływu, ponieważ zmiany w widmach są nieistotne. Z kolei absorbancja FMN przy 444 nm ulega zmniejszeniu odpowiednio o około 19% i 34% po naświetlaniu światłem niebieskim i fioletowym z natę...

Tutaj prezentujemy protokół inaktywacji bakterii chorobotwórczych za pomocą reaktywnych form tlenu wytwarzanych podczas fotolizy mononukleotydu flawinowego (FMN) pod wpływem światła niebieskiego i fioletowego o niskiej intensywności. Wykazano, że fotoliza FMN jest prostą i bezpieczną metodą w procesach sanitarnych.

Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawino-5′-fosforanu ryboflawiny w świetle widzialnym

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Protokół ten wykorzystuje promieniowanie widzialnym światłem fioletowym do indukcji fotolizy mononukleotydów flawinowych. W ten sposób powstaje duża ilość wolnych rodników, które hamują rozwój bakterii chorobotwórczych, takich jak Staphylococcus aureus i E.coli. Przetestowaliśmy mononukleotyd flawinowy jako odpowiedni fotouczulacz.W tym protokole używamy widzialnego światła fioletowego, które jest bezpieczne i nie wymaga drogiego sprzętu. Metoda ta może być stosowana do terapii uszkodzonej skóry lub zakażonych tkanek podskórnych poprzez wprowadzenie światłowodu do oświetlenia. Może być również stosowany w praktyce sanitarnej w przemyśle spożywczym.Procedurę zademonstruje Tang-Yu Chen, doktorant z mojego laboratorium Na początek zamontuj sześć diod elektroluminescencyjnych o napięciu 12 woltów każda na wewnętrznej stronie nieprzezroczystego plastikowego kubka. Weź szklaną probówkę o średnicy 13 milimetrów i wysokości 100 milimetrów i dodaj reagenty do probówki. Zabezpiecz rurki w górnej części kubka i umieść ten zestaw w stałej temperaturze 25 trzech stopni Celsjusza.Monitoruj i rejestruj temperaturę jednostek testowych podczas reakcji fotolitycznych za pomocą termometru na podczerwień. Następnie należy przygotować 0,1-milimolowy roztwór FMN w 100-milimolowym buforze fosforanu potasu o pH 7,8. Wystaw trzy mililitry próbki FMN każda na działanie światła niebieskiego, zielonego, czerwonego lub fioletowego przez pięć minut.Równolegle trzymaj trzy mililitry roztworu FMN w ciemności jako kontrolę. Umieścić próbkę w spektrofotometrze w zakresie widzialnym w promieniowaniu UV i zarejestrować absorbancję napromieniowanych próbek w zakresie od 250 do 750 nanometrów. Aby przygotować się do wykrycia rodników ponadtlenkowych, najpierw dodaj 109,3 miligrama L-metioniny do 73,3 mililitra 100-milimolowego buforu fosforanowego o pH 7,8.Do roztworu dodaj 10 miligramów proszku NBT i 1,5 mililitra 0,117-milimolowego FMN. Wystawić jeden mililitr roztworu reakcyjnego na działanie niebieskiego lub fioletowego światła LED przez jedną do pięciu minut. Zarejestruj absorbancję 516 nanometrów, aby wykryć formazan, który jest wytwarzany w reakcji fotochemicznej NBT.Zaszczepij kolonię Staphylococcus aureus w 10 mililitrach bulionu lizogenicznego w 15-mililitrowej probówce z zakręcaną nakrętką. Hoduj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin w shakerze. Przenieś 0,5 mililitra kultury do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.Rozcieńczyć kulturę do gęstości optycznej 0,5 przy 600 nanometrach, dodając wysterylizowaną wodę. Następnie przenieś 0,5 mililitra kultury do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować przy sile 14 000 g przez 10 minut i zdekantować supernatant.Dodaj jeden mililitr buforowanego roztworu FMN do osadu komórkowego i wiruj. Do kontroli napromienianej dodać jeden mililitr buforu fosforanowego. Przenieś jeden mililitr roztworu komórek bakteryjnych zawierającego 30-mikromolowy FMN i bufor fosforanowy do szklanych probówek.Umieść je na promieniowanie pod fioletowym światłem o mocy 10 watów na metr kwadratowy przez 30 minut. Następnie przenieś jeden mililitr roztworu komórek bakteryjnych zawierającego 30-60 i 120 mikromolowy FMN i bufor fosforanowy w szklanych probówkach. Naświetlać niebieskim światłem przez 120 minut z mocą 20 watów na metr kwadratowy.Należy również napromienić probówkę zawierającą jeden mililitr 120-mikromolowego FMN przez 60 minut. Po napromieniowaniu dodać 0,2 mililitra roztworu reakcyjnego na płytkę z agarem luria. Rozprowadź roztwór za pomocą szklanej pałeczki w kształcie litery L i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia oblicz liczbę żywotnych płytek i szybkość inaktywacji Staphylococcus aureus. Przygotuj próbki gronkowca złocistego zgodnie z wcześniejszym opisem, aby uzyskać osad komórkowy. Do 75 mililitrów buforu fosforanowego dodaj 0,1093 grama L-metioniny, 0,1 grama NBT i 25 mililitrów roztworu FMN.Dodaj jeden mililitr każdego roztworu reagenta o różnych stężeniach FMN do granulek komórek i wiru. Naświetlać roztwory pod fioletowym światłem o mocy 10 watów na metr kwadratowy przez 10 minut. Odwirować mieszaninę o stężeniu 14 000 G przez 10 minut i zdekantować supernatant.Zawiesić osad w jednym mililitrze dimetylosulfotlenku w celu ekstrakcji zredukowanego NBT. Zapisz absorbancję przy 560 nanometrach. Naświetlanie FMN światłem zielonym i czerwonym nie wykazało wpływu na piki przy 372 i 444 nanometrach w porównaniu z ciemną kontrolą, podczas gdy zmniejszenie absorbancji FMN przy 444 nanometrach zaobserwowano w świetle niebieskim i fioletowym, co wskazuje na zwiększoną fotolizę.Detekcja rodników ponadtlenkowych powstających podczas fotolizy FMN w świetle niebieskim lub fioletowym została wykonana za pomocą redukcji NBT. Efekt fotochemiczny FMN był zależny od czasu napromieniowania. Fotoliza FMN przy użyciu promieniowania światłem niebieskim lub fioletowym spowodowała znaczną inaktywację Staphylococcus aureus.Inaktywację zależną od dawki zaobserwowano dla napromieniowania światłem niebieskim, z 97% inaktywacją osiągniętą dla 120-mikromolowego FMN. W świetle fioletowym wskaźnik inaktywacji wynoszący 96% osiągnięto w przypadku Staphylococcus aureus, przy czym 30-mikromolowy FMN wykazał wyższą skuteczność w inaktywacji bakterii. Zmniejszenie NBT wykazało, że efekt fotolityczny FMN w świetle fioletowym u Staphylococcus aureus był proporcjonalny do stężenia FMN.W warunkach nieleczonych mniejsza obfitość rodników ponadtlenkowych była wskazywana przez niską absorbancję na poziomie 560 nanometrów, podczas gdy wyższe wartości absorbancji w leczeniu FMN wykazywały obfitą produkcję rodników ponadtlenkowych, co skutkowało zwiększonym efektem fotochemicznym. Bardzo ważne jest, aby mieć dobre źródło światła LED. Szerokość widmowa reżimu światła fioletowego musi być wąska, aby uniknąć nakładania się na absorpcję UV, ponieważ promieniowanie UV może być niebezpieczne.Po zabiegu inne związki chemiczne, takie jak tetracyklina, doksycyklina, katechina i mogą być testowane pod kątem fotolizy podobnej do FMN.

inactivation-pathogens-via-visible-light-photolysis-riboflavin-5

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wykazujemy, że opracowane urządzenie biomedyczne wykorzystujące ciągłe lub impulsowe leczenie laserem światła widzialnego w połączeniu z antybiotykoterapią (gentamycyną) wywołuje statystycznie istotny efekt synergistyczny, prowadzący do zmniejszenia żywotności P. aeruginosa PAO1 o 8 log w porównaniu z samą antybiotykoterapią.

Synergistyczny efekt światła widzialnego i gentamycyny w odniesieniu do mikroorganizmów Pseudomona aeruginosa

Źródło: Cheng, C., et al. Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawiny-5′-fosforanu w świetle widzialnym. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia metodę oceny fototoksycznego wpływu mononukleotydu flawinowego (FMN) na bakterie chorobotwórcze. Kultury bakteryjne są wystawione na działanie rosnących stężeń FMN i oświetlone światłem widzialnym w celu wytworzenia reaktywnych form tlenu (ROS), które uszkadzają składniki komórkowe. Bakterie, które przeżyły, są następnie oznaczane ilościowo w...

Inaktywacja bakterii za pomocą aktywowanego światłem mononukleotydu flawinowego

Źródło: Cheng, C., et al. Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawiny-5′-fosforanu w świetle widzialnym. J. Vis. Exp. (2022).Na tym filmie zbuforowana mieszanina reakcyjna zawierająca L-metioninę, błękit nitro tetrazolium (NBT) i mononukleotyd flawinowy (FMN) jest naświetlana światłem fioletowym w celu wywołania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS). Prowadzi to do inaktywacji bakterii i powstania wykrywalnego spektrometrycznie formazanu.

Kwantyfikacja inaktywacji bakterii wywołanej światłem poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu

Źródło: Zhao, K. i in. Model in vitro do badania wpływu terapii fotodynamicznej pośredniczonej kwasem 5-aminolewulinowym na biofilm gronkowca aureus . J. Vis. Exp. (2018)Film prezentuje protokół terapii fotodynamicznej mający na celu ocenę działania antybakteryjnego na biofilmy bakterii Gram-dodatnie. Biofilmy dzielą się na cztery grupy: dwie otrzymują prekursor fotosensyzatora, a dwie otrzymują bufor. Wszystkie są inkubowane w ciemności, po czym następuje ekspozycja na czerwone światło dla...

Aktywacja światłem biofilmów bakteryjnych z użyciem prekursora fotosensywnego

Ten film pokazuje proces redukcji patogenów oparty na ryboflawinie i świetle UV przeciwko skażeniu bakteryjnemu o wysokim mianie w produktach z płytek krwi u ludzi. Proces ten może przyczynić się do zmniejszenia ryzyka poważnych niepożądanych zdarzeń transfuzji związanych ze skażeniem bakteryjnym.

Leczenie produktów płytkowych ryboflawiną i światłem UV w celu wyeliminowania bakterii

Warunki przechowywania produktów płytkowych tworzą idealne środowisko do namnażania się zanieczyszczeń bakteryjnych do niebezpiecznych poziomów.  Celem tego badania było wykorzystanie testu tworzenia kolonii do oceny procesu redukcji patogenów opartego na ryboflawinie w stosunku do zanieczyszczenia bakteryjnego o wysokim mianie w ludzkich produktach płytkowych.

Leczenie produktów płytkowych ryboflawiną i światłem UV: skuteczność w walce z wysokim mianem bakterii

Infekcje wywołane przez wielolekooporne (MDR) szczepy bakteryjne stały się poważnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego, co spowodowało konieczność opracowania alternatywnych metod leczenia. Przedstawiamy protokół oceny skuteczności terapii przeciwdrobnoustrojowym światłem niebieskim (aBL) w zakażeniach MDR Acinetobacter baumannii w oparzeniach myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

In vivo (in vivo) Badanie przeciwdrobnoustrojowej terapii światłem niebieskim w wielolekoopornych zakażeniach oparzeniami Acinetobacter baumannii przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego

Rosnąca częstość występowania lekoopornych Candida albicans jest poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie. Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna (aPDT) może stanowić strategię walki z lekoopornymi infekcjami grzybiczymi. Niniejszy protokół opisuje skuteczność aPDT za pośrednictwem Rose bengal na wielolekoopornym szczepie C. albicans in vitro.

Terapia fotodynamiczna za pośrednictwem róży bengalskiej w celu zahamowania Candida albicans

Obecny protokół opisuje modyfikacje transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) z systemem oświetlenia świetlnego, wytwarzanie komórek płynnych oraz obserwacje in situ TEM indukowanych światłem interakcji między komórkami bakteryjnymi a fotosensybilizatorem. Omówiono również metody przygotowania próbek, uszkodzenia wiązki elektronów i obrazowanie.

Indukowana światłem transmisyjna mikroskopia elektronowa in situ do obserwacji oddziaływania ciecz-miękka materia

Ten protokół opisuje prostą i ekonomiczną metodę oceny skuteczności potencjalnych fotosensybilizatorów w antybakteryjnej inaktywacji fotodynamicznej (aPDI), przy użyciu formatu 96-dołkowej płytki w połączeniu ze źródłem światła na panelu LED. Takie podejście umożliwia jednoczesne testowanie wielu warunków eksperymentalnych, w tym różnych stężeń, związków i szczepów bakterii.

Badania przesiewowe in vitro oparte na diodach LED do oceny fotoaktywowanych cząsteczek w inaktywacji fotodynamicznej bakterii

Urządzenie LED z niebieskim światłem o średnicy 405 nm wykazuje skuteczność antybakteryjną przeciwko szerokiemu zakresowi patogenów ran podczas oceny na syntetycznym modelu skóry opartym na kolagenie. To uproszczone podejście in vitro oferuje powtarzalną i etycznie wykonalną alternatywę dla wczesnej fazy oceny terapii przeciwdrobnoustrojowych opartych na świetle.

Badanie urządzenia LED z niebieskim światłem w celu tłumienia patogenów ran z wykorzystaniem syntetycznego modelu skóry na bazie kolagenu

Poznaj metodę inaktywacji patogenów bakteryjnych, takich jak Staphylococcus aureus i E.coli, poprzez fotolizę ryboflawino-5′-fosforanu w świetle widzialnym. Protokół ten znajduje zastosowanie w terapii ran oraz w sanitacji przemysłu spożywczego.

Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawino-5′-fosforanu ryboflawiny w świetle widzialnym

Przeglądaj więcej filmów