Name: Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Poznaj standardowy test karmienia membranowego do oceny związków przeciwmalarycznych u komarów Anopheles. Ta metoda pozwala badać transmisję Plasmodium falciparum i identyfikować oocysty w przewodzie pokarmowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Prof. Lyn-Mari Birkholtz i dr Janette Reader z Wydziału Biochemii, Genetyki i Mikrobiologii Instytutu Zrównoważonej Kontroli Malarii na Uniwersytecie w Pretorii za hodowlę i dostarczenie kultury gametocytów. Szczep pasożyta został uzyskany z tego ostatniego działu (nie jest częścią tej publikacji). Departament Nauki i Innowacji (DSI) oraz Narodowa Fundacja Badawcza (NRF); Inicjatywa Katedr Badawczych Republiki Południowej Afryki (UID 64763 do LK i UID 84627 do LMB); Wspólnoty Praktyków NRF (UID 110666 LMB i LK); oraz Strategiczne Partnerstwa na rzecz Innowacji w Dziedzinie Zdrowia (SHIP) Południowoafrykańskiej Rady ds. Badań Medycznych są również uznawane za fundusze z DSI.

Ilustrację protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Zgoda etyczna na pobranie i wykorzystanie ludzkiej krwi została uzyskana z Komitetu Etyki Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Pretorii (506/2018).
1. Hodowla gametocytów
UWAGA: Przed przygotowaniem SMFA, w University of Pretoria przygotowano hodowlę gametocytów (kompletny protokół opisano w pracy Reader i wsp.22).
<ol>
	<li>Przygotować hodowlę gametocytów składającą się z gametocytów stadium V szczepu pasożyta NF54.</li>
	<li>Upewnić się, że poziom gametocytemii w hodowli wynosi od 1,5% do 2,5%, przy hematokrycie 50% w surowicy męskiej grupy krwi A+, z dodatkiem świeżych erytrocytów.</li>
	<li>Rozdzielić hodowlę do oddzielnych kolb i dodać 2 µM każdego związku dla poszczególnych wariantów traktowania na 48 h przed przeprowadzeniem SMFA. Grupę kontrolną pozostawić nietraktowaną.</li>
	<li>Ocenić hodowlę gametocytów tuż przed przeprowadzeniem SMFA, aby upewnić się, że zachodzi eksflagellacja gamet męskich, przy zachowaniu stosunku samic do samców 3:1.</li>
</ol>
2. Sztuczne zakażanie komarów za pomocą metody SMFA
UWAGA: Bezpieczeństwo biologiczne: zakażone komary powinny być utrzymywane w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) z ograniczonym dostępem.
<ol>
	<li>Używając aspiratora ustnego, umieść 25 niekarmionych samic An. gambiae w kubku do karmienia o pojemności 350 mL. Powtórz tę czynność dla każdego kubka do zabiegów i wyraźnie oznakuj kubki, określając, czy mają służyć jako grupy kontrolne, czy badawcze. Dobierz liczbę kubków na zabieg zgodnie z liczbą przewidzianych powtórzeń technicznych. 
	UWAGA: W typowej ocenie związków blokujących transmisję stosuje się komary z kolonii w wieku od 5 do 7 dni. Głodzenie komarów przez 3-4 h lub dłużej przed karmieniem krwią ułatwi pobranie krwi podczas SMFA.</li>
	<li>Podłącz szklany system karmienia do łaźni wodnej i utrzymuj temperaturę na poziomie 37 °C. 
	UWAGA: Szklany karmnik składa się z dwóch ramion, które są połączone z rurkami silikonowymi podłączonymi do łaźni wodnej (Rysunek 2). Pusta w środku struktura karmnika umożliwia cyrkulację wody i utrzymanie temperatury krwi.</li>
	<li>Przygotuj jelito bydlęce (lub membranę syntetyczną), płucząc je w wodzie z kranu, a następnie potnij na kawałki dopasowane do każdego karmnika. Zakryj każdy karmnik i przymocuj membranę gumką recepturką. 
	UWAGA: W przypadku jelita nie było wymaganej zgody komisji etycznej, ponieważ zostało ono zakupione w lokalnym sklepie mięsnym, gdzie jest sprzedawane publicznie do celów spożywczych.</li>
	<li>Umieść kubki do infekcji pod karmnikami tak, aby membrana spoczywała na siatce kubka.</li>
	<li>Do karmników w kubkach kontrolnych dodaj 1 mL krwi zainfekowanej gametocytami, a do każdego odpowiadającego im karmnika i kubka do zabiegów dodaj krew zainfekowaną gametocytami z dodatkiem badanego związku.</li>
	<li>Pozostaw komary do karmienia przez około 40 min przy odsłoniętych karmnikach. 
	UWAGA: Karmienie odbywa się w warunkach insekterium (25 °C, 80% wilgotności względnej) w ciemności. Średnica karmnika wynosi około 13 mm.</li>
	<li>Po karmieniu zdejmij karmniki z kubków, wypłucz je, a nadmiar krwi zneutralizuj podchlorynem.</li>
	<li>Usuń niekarmione komary z kubka, ogłuszając wszystkie komary na lodzie (przez 1-2 min) i oddzielając osobniki niekarmione od tych, które pobrały posiłek z krwi. Szukaj napuchniętych i czerwonych odwłoków (wskazujących na obecność krwi), aby odróżnić komary nakarmione, w pełni nasycone, od niekarmionych (Rysunek 3).</li>
	<li>Umieść kubki do infekcji w komorze bezpieczeństwa biologicznego (Rysunek uzupełniający S1) i zapewnij w każdym kubku wkład z 10% roztworem cukru, wymieniając go co drugi dzień przez 8-10 dni.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zainfekowanych komarów
UWAGA: Ta część protokołu odbywa się w pomieszczeniu do zakażeń BSL2. Do pomieszczenia zakażeń, w którym przetrzymywane są zakażone komary, dopuszczony jest wyłącznie upoważniony i przeszkolony personel. Komary są utrzymywane w zmodyfikowanych kubkach posiadających tylko jeden punkt wejścia, który automatycznie zamyka się po usunięciu aspiratora ustnego. Kubki te umieszcza się w przezroczystym pojemniku z tworzywa termoplastycznego, aby zapobiec ucieczce owadów. Pojemnik znajduje się w pomieszczeniu zakażeń za systemem podwójnych drzwi. Należy wdrożyć wszystkie niezbędne protokoły na wypadek przypadkowej ekspozycji na zakażone komary (Supplemental File S1). Protokoły te są specyficzne dla danego kraju i zależą od wymogów instytucji.
<ol>
	<li>W 8.–10. dniu po karmieniu zakażonym materiałem, ogłusz zakażone komary, umieszczając je na lodzie, a następnie przenieś je do oznakowanych probówek z 70% etanolem (trzymając komary z każdej grupy kontrolnej i badawczej oddzielnie).</li>
	<li>Przed opuszczeniem pomieszczenia do zakażeń upewnij się, że wszystkie komary nie żyją.</li>
</ol>
4. Disekcje zakażonych komarów
UWAGA: Ta część protokołu jest przeprowadzana w laboratorium.
<ol>
	<li>Przenieś komary do oznaczonych szalek Petri wyłożonych papierem filtrowanym, zachowując rozdzielność grup kontrolnej i badawczej.</li>
	<li>Nanieś kroplę soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) na szkiełko przedmiotowe (oznaczone zgodnie z grupą kontrolną/badawczą) i przenieś pojedynczego komara z papieru filtrowanego do PBS.</li>
	<li>Usuń jelito środkowe z unieruchomionego, zakażonego osobnika, przytwierdzając klatkę piersiową komara igłą sekcyjną i jednocześnie pociągając pęsetą za 7th segment odwłoka.</li>
	<li>Gdy jelito będzie odsłonięte i widoczne, zlokalizuj cewki Malpighiego (Rysunek 4A,B), aby odróżnić jelito od jajników. Wyjmij jelito z PBS, przenieś je do kropli 0,1% merkurochromu na nowym szkiełku przedmiotowym i pozostaw do zabarwienia na 8-10 min.</li>
	<li>Po zabarwieniu przykryj jelito szkiełkiem nakrywką i obserwuj je w świetle przechodzącym przy powiększeniu 20x-40x (Rysunek 4C,D).</li>
	<li>Odnotuj obecność oraz liczbę oocyst na jelito środkowe dla każdej grupy kontrolnej i badawczej (Plik uzupełniający S2).</li>
	<li>Oblicz aktywność blokującą transmisję, korzystając z równania (1): 
	%TBA  <img alt="Schemat formuły obliczania wydajności, Cp-Tp/Cp × 100, zastosowanie edukacyjne w termodynamice." src="/files/ftp_upload/63546/63546eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">    (1) 
	gdzie TBA = aktywność blokująca transmisję (redukcja częstości występowania oocyst); p = częstość występowania oocyst; C = grupa kontrolna; a T = grupa badawcza.</li>
	<li>Oblicz aktywność redukującą transmisję, korzystając z równania (2): 
	%TRA = <img alt="Formuła obliczania procentowego: ((Ci-Ti)/Ci)×100, wyrażenie matematyczne." src="/files/ftp_upload/63546/63546eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2">    (2) 
	gdzie TRA = aktywność redukująca transmisję (redukcja intensywności oocyst); I = intensywność oocyst; C = grupa kontrolna; a T = grupa badawcza. 
	UWAGA: Wartość TBA może nie być znacząco zredukowana, ale może zaobserwować się znaczącą różnicę w TRA i odwrotnie. Zależy to od ocenianego materiału chemicznego.</li>
	<li>Przeprowadź analizę statystyczną, stosując nieparametryczny test t- (Mann-Whitney).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Aby ten protokół został pomyślnie wykonany, należy zwrócić uwagę na każdy krok, nawet jeśli może to być żmudny i pracochłonny proces. Jednym z najważniejszych kroków jest upewnienie się, że hodowla gametocytów jest dobrej jakości i że składa się z dojrzałych gametocytów, z prawidłowym stosunkiem mężczyzn do kobiet, przed rozpoczęciem SMFA 23,24. Podczas SMFA ważne jest również utrzymanie kultury gametocytów w odpowiedniej temperaturze, aby zapobiec wiczczowaniu s...

Malaria, znana jako jedna z najbardziej niszczycielskich chorób na świecie, nadal stanowi wielkie zagrożenie dla kilku krajów - szczególnie tych w regionie afrykańskim - i przyczynia się do około 95% przypadków na całym świecie1. Choroba ta jest wywoływana przez pasożyta pierwotniaka i wraz z wektorem komarów Anopheles, ci winowajcy mogą wyrządzić wielką szkodę ludzkiemu gospodarzowi2. Dokładniej rzecz ujmując, gatunek falciparum z rodzaju pasożyta Plasmodium jest odpowiedzialny za około 99% przypadków malarii w Afryce Subsaharyjskiej1. Oprócz tego, kilka głównych wektorów komarów Anopheles (w tym An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. i An. funestus Giles) może być obwinianych za ponad 95% transmisji pasożytów na całym świecie3,4,5,6,7,8. Aby stworzyć idealne towarzystwo pasożyta-wektora, wektor komara powinien być podatny na pasożyta i być w stanie go przenosić9. Co więcej, zarówno wektor, jak i pasożyt powinny pokonywać bariery fizyczne, aby stworzyć idealną kombinację zakaźną - wektor komara powinien być w stanie utrzymać rozwój pasożyta, a pasożyt powinien mieć zdolność do pokonania mechanizmów obronnych gospodarza10,11.
Gametocyty, stadium płciowe pasożyta P. falciparum, odgrywają kluczową rolę w łączeniu partnerów wektora i pasożyta12. Rozwój płciowy zachodzi in vivo, a gametocytogeneza opisuje proces różnicowania dojrzałych gametocytów na ruchliwe mikrogamety męskie i makrogamety żeńskie13. Innym procesem, który zachodzi w obrębie komara, jest biczowanie - proces, podczas którego męski gametocyt przekształca się w gamety i wyłania się z czerwonych krwinek pobranych podczas posiłku z krwi11. Sugeruje się ponadto, że proces biczowania jest wzmocniony przez korzystną zmianę w środowisku komara midgut14. Po wygiśnięciu zygota powstaje w wyniku fuzji gamet męskich i żeńskich13. Z zygoty powstaje ruchliwy ookinet, który przemieszcza się z mączki z krwi do nabłonka komara midgut13. Tutaj ookinete dojrzewa i tworzy się oocysta, która z kolei wytwarza ruchliwe sporozoity13,15. Sporozoity następnie migrują do gruczołów ślinowych komarów, a gdy komar pobiera posiłek z krwi od swojego żywiciela, sporozoity te są wstrzykiwane do krwiobiegu gospodarza15.
Interwencje kontroli malarii, łączące strategie kontroli wektorów i stosowanie skutecznych leków przeciwmalarycznych, stały się kluczowe w walce z tą chorobą15. Wraz ze wzrostem odporności na pasożyty i komary, rośnie pilna potrzeba identyfikacji nowych związków przeciwmalarycznych16. Dlatego ważna jest ocena in vivo związków blokujących transmisję16. Po opracowaniu tak skutecznych leków blokujących transmisję, SMFA zostało wykorzystane do oceny, czy związki te hamują rozwój płciowy P. falciparum u komara Anopheles17,18,19. Test ten zyskał uznanie w latach 1970-1980 jako złoty standard oceny blokowania transmisji20,21. Ten test stanowi tańszą alternatywę niż inne testy, takie jak RT-qPCR, który wymaga specjalistycznego sprzętu. Co więcej, do przeprowadzenia eksperymentów nie są potrzebni żadni pacjenci. Test ten obejmuje również dostarczenie krwi indukowanej gametocytami samicom komarów, które są następnie preparowane w celu oceny, czy występuje rozwój oocyst21. Pozwala to na kwantyfikację gametocytów i wykrywanie zdeformowanych oocyst ze względu na związki22. Aby związek został sklasyfikowany jako skuteczny, należy ocenić częstość występowania (odsetek komarów, które są nosicielami co najmniej jednej oocysty w jelicie środkowym) oraz liczbę oocyst (intensywność) w jelicie środkowym komara w celu oceny zahamowania infekcji17,21,22.

<table><tbody><tr><td>Jelito bydlęce/</td>związek <td>rzeźniczy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MMV1581558</td><td>MMV</td><td></td><td>Skrzynka reagowania na pandemię</td></tr><tr><td>Igły preparacyjne</td><td>WRIM</td><td></td><td>Wykonana na zamówienie</td></tr><tr><td>rurka sokoła</td><td>Lasec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podajniki szkła</td><td>Glastechniek Peter Coelen BV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism (8.3.0)</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mercurochrome</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>129-16-8</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Merch (Sigma-Aldrich)</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Cleansafe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletki PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2944</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego z pleksiglasu</td><td>Wits University</td><td></td><td>Wykonane przez wykonawców w Wits</td></tr><tr><td>Plastikowe kubki (350 mL)</td><td>Plastikowa ziemia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia plasmodium falciparum u wektorów komarów anopheles

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria pozostaje jedną z najbardziej niszczycielskich chorób na świecie i do tej pory region afrykański jest nadal odpowiedzialny za 94% wszystkich przypadków na świecie. Ta choroba pasożytnicza wymaga pasożyta pierwotniaka, wektora komara Anopheles i żywiciela kręgowców. Rodzaj Anopheles obejmuje ponad 500 gatunków, z których 60 jest znanych jako wektory pasożyta. Rodzaj pasożyta Plasmodium składa się z 250 gatunków, z których 48 bierze udział w przenoszeniu chorób. Co więcej, pasożyt Plasmodium falciparum przyczynił się do około 99,7% przypadków malarii w Afryce Subsaharyjskiej w ostatnich latach. 
Gametocyty stanowią część etapu płciowego pasożyta i są spożywane przez samicę komara po pożywieniu się zainfekowanym ludzkim gospodarzem. Dalszy rozwój pasożyta w obrębie komara jest wspomagany przez korzystne warunki środowiskowe w jelicie środkowym komara. Tutaj zachodzi fuzja gamet żeńskich i męskich, w wyniku czego powstają ruchliwe ookinety. Ookinety dostają się do nabłonka jelita środkowego komara, a dojrzałe ookinety tworzą oocysty, które z kolei wytwarzają ruchliwe sporozoity. Te sporozoity migrują do gruczołów ślinowych komara i są wstrzykiwane, gdy komar spożywa posiłek z krwi. 
Dla celów odkrywania leków, komary zostały sztucznie zainfekowane krwią zakażoną gametocytami w standardowym teście karmienia błonowego (SMFA). W celu wykrycia infekcji u komara i/lub oceny skuteczności związków przeciwmalarycznych, jelita środkowe samic komarów zostały usunięte po zakażeniu i zabarwione merkurochromem. Metodę tę zastosowano w celu poprawy wizualnego wykrywania oocyst pod mikroskopem w celu dokładnego określenia częstości występowania i intensywności oocyst.

Całkowita liczba sekcjonowanych okazów kontrolnych wyniosła 47, przy średniej częstości występowania na poziomie 89% i intensywności wynoszącej 9,5 oocyst na jelito środkowe (Tabela 1, zgodnie z wcześniejszą publikacją22). W przypadku związku MMV1581558 wielkość próby wyniosła łącznie 42 okazy, przy częstości występowania oocyst na poziomie 36% i średniej intensywności 1,5 oocyst. Wykazuje to redukcję częstości występowania oocyst o 58% oraz TRA na poziomie 82% we wszystkich trzec...

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

Protokół pozwala nam wykryć wpływ leczenia na podatność na malarię afrykańskich wektorów malarii. Na przykład związki mające na celu zablokowanie przenoszenia się z człowieka na komara. Technika ta pozwala naukowcom na ocenę dużej liczby związków w warunkach laboratoryjnych, nawet zanim dostępne będą GATE dotyczące toksyczności.Rozwarstwienie jelita środkowego może być na początku trudne, ale wymaga tylko trochę praktyki. Ponadto identyfikacja oocyst nie zawsze jest łatwa. Najpierw, za pomocą aspiratora do ust, umieść 25 niekarmionych samic komarów Anopheles gambiae w 350-mililitrowym kubku do karmienia.Oznacz kubki w wyraźny sposób, aby odróżnić grupę kontrolną od leczonej. Wybierz liczbę filiżanek na zabieg w zależności od liczby dołączonych powtórzeń technicznych. Podłącz system podajnika szkła do łaźni wodnej i utrzymuj temperaturę na poziomie 37 stopni Celsjusza.Następnie przygotuj jelito krowie lub syntetyczną membranę, płucząc je w wodzie z kranu i krojąc na kawałki, które są dopasowane do każdego karmnika. Zakryj dolną część każdego karmnika i przymocuj membranę elastyczną opaską. Aby używać kubków do karmienia jako kubków na infekcje, najpierw trzymaj membranę na siatkach kubków.Następnie umieść kubki na infekcje pod karmnikami. Teraz dodaj jeden mililitr krwi zakażonej gametocytami do podajników kubków kontrolnych, a krew zakażoną gametocytami ze związkiem testowym do podajników kubków terapeutycznych. Następnie pozostaw komary na żer na około 40 minut.Po karmieniu wyjmij karmniki z kubków, opłucz karmniki i potraktuj nadmiar krwi podchlorynem. Następnie powal wszystkie komary na lód na jedną do dwóch minut i wybierz komary, które spożyły posiłek z krwi, szukając spuchniętych i czerwonych brzuchów. Zastąp wodę z cukrem, która jest podawana co drugi dzień do każdej filiżanki z infekcją, wacikiem z 10% cukrem i inkubuj kubki z infekcją w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez osiem do 10 dni.Osiem do 10 dni po karmieniu powal zarażone komary, umieszczając je na lodzie. Następnie przenieś je do oznakowanych probówek z 70% etanolem, utrzymując kontrolę w każdej grupie leczonej w oddzielnych probówkach. Oddzielając grupy kontrolne i testowe, przenieś komary na oznakowane szalki Petriego wyłożone bibułą filtracyjną.Dodaj kroplę PBS na odpowiednio oznaczone szkiełko i przenieś komara z bibuły filtracyjnej do kropli. Przypnij klatkę piersiową komara igłą do preparowania. Następnie usuń jelito środkowe, pociągając siódmy segment brzucha kleszczami i przenieś go do kropli 0,1% merkurochromu na nowym szkiełku mikroskopowym.Pozostaw jelita do zabarwienia na osiem do 10 minut. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na poplamionym wnętrzu i obejrzyj je w jasnym oświetleniu pola przy 20 do 40-krotnym powiększeniu. Zapisać liczbę oocyst na jelito środkowe dla grupy kontrolnej i każdej grupy leczonej.W tym badaniu stwierdzono, że związek MMV1581558 znacznie ogranicza liczbę oocyst Plasmodium falciparum w jelicie środkowym samic komarów Anopheles gambiae w porównaniu z kontrolą. W grupie kontrolnej średnie rozpowszechnienie oocyst w jelicie środkowym wynosiło 89% przy średniej intensywności 9,5 oocyst na jelito środkowe. Ale w grupie leczonej MMV1581558 średnia częstość występowania oocyst wynosiła 36%, przy średniej intensywności tylko 1,5 oocysty na jelito środkowe.W związku z tym MMV1581558 leczenie skutkowało 58% aktywnością blokującą transmisję i 82% aktywnością redukującą transmisję we wszystkich trzech kontrpróbach biologicznych. Bardzo ważne jest, aby komary żywiły się zdrową kulturą gametocytów. Jeśli są to niedojrzałe gametocyty lub nie są gametocytami w piątym stadium, prawdopodobieństwo zakażenia komara jest ograniczone lub niemożliwe.W teście wykorzystuje się metodę wizualnej identyfikacji morfologicznej, jednak można zastosować molekularne testy ilościowe. Jest to jednak bardziej kosztowne i może ograniczyć ich zastosowanie w laboratoriach o ograniczonych zasobach. Możliwość zastosowania tej techniki otwiera nowe możliwości oceny zmian w występowaniu i intensywności malarii u prawie wszystkich komarów.Na przykład porównanie zdolności wektorowej gatunków.

standard-membrane-feeding-assay-for-detection-plasmodium-falciparum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na wirusa dengue, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom wirusowym u komarów. Niniejszy protokół ilustruje sposób badania stopnia zakażenia komarów wirusem dengue. Przedstawiono techniki namnażania wirusa w kulturze, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.

Protokół infekcji denga w komarach (A. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie odpornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy stopnia infekcji komarów przez Plasmodium. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania mian wirusów w jelicie środkowym komara.

Protokół zakażania komarów *Plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia

Ten film demonstruje test odżywiania krwią w celu oceny śmiertelności i płodności badanych związków o nowych sposobach działania na samice komarów. Technika ta pomaga w badaniach przesiewowych nowych klas insektycydów w celu zabicia opornej populacji komarów i kontrolowania rozprzestrzeniania się choroby.

Test żerowania komarów: metoda oceny wpływu badanego związku na śmiertelność i płodność dorosłych samic komarów

Pomiar funkcji przeciwciał jest kluczem do zrozumienia odporności na malarię Plasmodium falciparum. Metoda ta opisuje oczyszczanie żywotnych merozoitów i pomiar fagocytozy zależnej od opsonizacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Wysokowydajne oczyszczanie merozoitów Plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących

Komary przenoszące malarię mają wiele ważnych epidemiologicznie cech, które można wykryć tylko za pomocą technik molekularnych. Wykorzystując platformę genotypowania SNP opartą na MALDI-TOF, opracowaliśmy test do jednoczesnego wykrywania wielu kluczowych cech (gatunek, odporność na insektycydy, zakażenie pasożytami i wybór żywiciela) wektorów malarii.

Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Opisana to oszczędzająca czas i miejsce metoda liczenia jaj i określania szybkości wylęgu poszczególnych komarów za pomocą 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, co może znacznie zwiększyć skalę i szybkość testów płodności i płodności.

Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL)

Szczegółowe badania nad stadiami pasożytów malarii u komarów są niezbędne do opracowania skutecznych strategii blokowania transmisji. Protokół ten pokazuje, jak skutecznie hodować zakaźne gametocyty, a następnie karmić te gametocyty komarami w celu wytworzenia stadiów komara P. falciparum.

Plasmodium falciparum (Plasmodium falciparum) Hodowla gametocytów i infekcja komarów poprzez sztuczne karmienie błoną

Celem tego protokołu jest dostarczanie komarom Aedes aegypti pokarmów pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków z krwi za pomocą sztucznego karmnika membranowego i precyzyjne określenie ilościowe ilości spożytego posiłku.

Karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti

Ten protokół opisuje test immunoenzymatyczny do wykrywania sporozoitów gruczołów ślinowych u komarów. Wykorzystując łatwo dostępne przeciwciała monoklonalne, metoda umożliwia ekonomiczne, wysokoprzepustowe wykrywanie komarów przenoszących Plasmodium falciparum lub Plasmodium vivax. Metoda ta nadaje się do badań nad przenoszeniem malarii, w tym do badań wektorowych.

Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego

Poznaj standardowy test karmienia membranowego do oceny związków przeciwmalarycznych u komarów Anopheles. Ta metoda pozwala badać transmisję Plasmodium falciparum i identyfikować oocysty w przewodzie pokarmowym.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Przeglądaj więcej filmów