Name: Pobieranie odcisków palców kardiolipiny w leukocytach za pomocą spektrometrii mas w celu szybkiej diagnozy zespołu Bartha (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Poznaj metodę analizy kardiolipiny w leukocytach za pomocą spektrometrii MALDI-TOF do szybkiej diagnozy zespołu Bartha. Technika mierzy stosunek monolizokardiolipiny do kardiolipiny z 100% czułością i swoistością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni osobom z BTHS i ich rodzinom za udział w naszych badaniach. Dziękujemy Fundacji Zespołu Bartha w USA i Barth Syndrome UK Trust za ich wsparcie i pomoc w pobraniu próbek krwi na dorocznym spotkaniu w Bristolu. Badanie zostało sfinansowane przez Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus i Region Apulia.

Próbki krwi zdrowych dawców i pacjentów z niewydolnością serca zostały pobrane w Szpitalu Policlinic w Bari (Włochy), natomiast próbki pacjentów z BTHS zostały pobrane przez klinikę BTHS National Health Service UK w Bristol Royal Hospital for Children (Wielka Brytania). Uzyskano pisemną świadomą zgodę zdrowych dawców, pacjentów i rodziców (w stosownych przypadkach) oraz zgody odpowiednich komisji bioetycznych.
UWAGA: Jeśli nie zostanie natychmiast użyta, krew (w probówce z żelem K-EDTA) może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 24-48 godzin.
1. Izolacja leukocytów przez sedymentację dekstranu czerwonych krwinek (RBC)
<ol>
	<li>Umieść próbki krwi (w K-EDTA) na wytrząsarce orbitalnej na 10 minut, aby wymieszać krew.</li>
	<li>Do 0,9 ml krwi pełnej w probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 0,1 ml 20% roztworu dekstranu (masa cząsteczkowa > 100 kDa, w 0,9% NaCl). Delikatnie odpipetować i rozprowadzić zawiesinę 20 razy, unikając pęcherzyków powietrza, które w przeciwnym razie zatrzymałyby erytrocyty w górnej części probówki. Pozwól erytrocytom osadzać się przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki zebrać i przenieść żółty supernatant do probówki o pojemności 15 ml, a następnie odwirować przy 400 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej (bez hamulca, wirnik wahadłowy).</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający głównie leukocyty i resztki erytrocytów w 0,6 ml lodowatej wody dwudestylowanej (ddH2O).</li>
	<li>Po ~15 s dodaj 0,2 ml 0,6 M KCl do zawiesiny komórek, aby przywrócić prawidłową osmolarność. Krótki wstrząs osmotyczny spowoduje lizę erytrocytów i pozostawi leukocyty nienaruszone. Dostosuj końcową objętość do 2,5 ml za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 400 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej (bez hamulca, wirnik obrotowy). Wyrzucić supernatant i ponownie przemyć osad leukocytów 2,5 ml 1x PBS.</li>
	<li>Odwirować jak w kroku 1.6 i odrzucić supernatant. Zawiesić osad zawierający leukocyty w 200 μl wysterylizowanego ddH2O. 
	UWAGA: Z doświadczenia autorów wynika, że odpowiada to zawartości białka w zakresie od 200 μg do 400 μg.</li>
	<li>Zamrozić zawiesinę w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przeprowadzić ekstrakcję lipidów w następujący sposób.</li>
</ol>
2. "Mini-ekstrakcja" lipidów z izolowanych leukocytów
<ol>
	<li>Przenieś 20 μl zawiesiny leukocytów (około 20-40 μg białek) do probówki o pojemności 1,5 ml i wiruj z prędkością 16 000 x g przez 30 s.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad, dodać 10 μl CHCl3 do pozostałej osadki i kilkakrotnie pipetować w celu przyspieszenia ekstrakcji lipidów.</li>
	<li>Na koniec dodać 10 μl roztworu matrycy 9-aminoakrydyny (9-AA) (10 mg/ml 9-AA w 2-propanolu/acetonitrylu, 60:40 v/v) do osadu w CHCl3. Odpipetować i kilkakrotnie rozproszyć do wymieszania.</li>
	<li>Odwirować roztwór zawierający lipidy wCHCl 3 i 9-AA w temperaturze 16 000 x g przez 30 s, a następnie umieścić supernatant w postaci kropelek po 0,35 μl (trzy kontrpróby na każdą próbkę) na tarczy MALDI (płytce próbki), która ma być poddana analizie (metoda osadzania "suchych kropel").</li>
	<li>Pozostaw kropelki do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 10-15 minut.</li>
</ol>
3. Analiza lipidów metodą MALDI-TOF/MS
<ol>
	<li>Uzyskanie widm masowych próbek w trzech egzemplarzach na spektrometrze mas MALDI-TOF.</li>
	<li>Po kalibracji za pomocą wzorców lipidowych (patrz Tabela materiałów), ustaw analizy w trybie jonów ujemnych i zoptymalizuj zakres detekcji m/z od 200 Th do 2,000 Th dla analizy małych cząsteczek.</li>
	<li>Utrzymuj fluencję lasera 5% powyżej progu (CL i MLCL), aby uzyskać S/N (co najmniej 2).</li>
	<li>Pozyskiwanie widm w trybie reflektora za pomocą opóźnionej ekstrakcji impulsowej. Dla każdego widma masowego średnio 2,000 pojedynczych strzałów laserowych (suma 4 x 500). Zastosuj tłumienie matrycy bramkowanej do 400 Th, aby zapobiec nasyceniu detektora.</li>
</ol>
4. Jak obliczyć stosunek (MLCL + CLi)/CLm
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie instrumentu MALDI-TOF/MS (patrz Tabela materiałów), aby przeanalizować uzyskane widma.</li>
	<li>Za pomocą polecenia Otwórz otwórz okno dialogowe Przeglądarka widma, w którym można wybrać i wczytać interesujące Cię widmo.</li>
	<li>Na pasku menu kliknij ikony Wygładź widmo masy i Odejmij linię bazową widma masy.</li>
	<li>Kliknij File > Export > Mass Spectrum i wybierz format ASCII, aby wyeksportować widmo w postaci dwukolumnowej tabeli z parami punktów danych: m/z (x) i intensity (y). Skopiuj i wklej współrzędne w programie arkusza kalkulacyjnego (*.xls).</li>
	<li>Powtórz kroki od 4.2 do 4.4 dla trzech próbek każdej analizowanej próbki, wklejając współrzędne do tego samego pliku programu arkusza kalkulacyjnego, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1 (Krok 1).</li>
	<li>Postępując zgodnie z zakresami x pokazanymi na Rysunek 1 (Krok 2) dla każdego wymienionego gatunku, oblicz sumę wartości y1,y 2 i y3 (potrójnie) za pomocą funkcji SUMA, aby uzyskać powierzchnię piku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1; Krok 3).</li>
	<li>Wykonaj średnią z potrójnych wartości obszaru za pomocą funkcji ŚREDNIA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1; Krok 3).</li>
	<li>Umieść średnie wartości powierzchni dla każdego gatunku w kolumnie, jak pokazano w Rysunek 1 (Krok 2).</li>
	<li>Aby uwzględnić tylko pierwszy izotopolog gatunku CLm 72:7, jak w28, należy obliczyć poprawkę izotopową dla nakładania się izotopologii M + 2 CLm 72:8 i monoizotopowego piku CLm 72:7, jak pokazano w Rysunek 1 (Krok 4).</li>
	<li>Na koniec oblicz stosunek (MLCL + CLi)/CLm, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1 (Krok 5).</li>
</ol>

<ol><li>Barth, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-linked+cardioskeletal+myopathy+and+neutropenia+%28Barth+syndrome%29%3A+respiratory-chain+abnormalities+in+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).</li>
<li>Steward, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((syndrome+%28X+linked+cardiac+and+skeletal+myopathy%2C+neutropenia%2C+and+organic+aciduria%29%3A+rarely+recognised%2C+frequently+fatal+%5Babstract%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract].</a> Archives of Disease in Childhood. 89, 48(2004).</li>
<li>Clarke, S. L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Barth syndrome.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 8, 23(2013).</li>
<li>Zegallai, H. M., Hatch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barth+syndrome%3A+cardiolipin%2C+cellular+pathophysiology%2C+management%2C+and+novel+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Barth syndrome: cardiolipin, cellular pathophysiology, management, and novel therapeutic targets.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1605-1629 (2021).</li>
<li>Taylor, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+presentation+and+natural+history+of+Barth+Syndrome%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical presentation and natural history of Barth Syndrome: An overview.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 7-16 (2022).</li>
<li>Miller, P. C., Ren, M., Schlame, M., Toth, M. J., Phoon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+analysis+to+determine+the+prevalence+of+Barth+syndrome+in+the+pediatric+population%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Bayesian analysis to determine the prevalence of Barth syndrome in the pediatric population.</a> The Journal of Pediatrics. 217, 139-144 (2020).</li>
<li>Bione, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+X-linked+gene%2C+G4.5.+is+responsible+for+Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome.</a> Nature Genetics. 12 (4), 385-389 (1996).</li>
<li>Whited, K., Baile, M. G., Currier, P., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven+functional+classes+of+Barth+Syndrome+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Seven functional classes of Barth Syndrome mutation.</a> Human Molecular Genetics. 22 (3), 483-492 (2013).</li>
<li>Schlame, M., Ren, M., Xu, Y., Greenberg, M. L., Haller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+symmetry+in+mitochondrial+cardiolipins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Molecular symmetry in mitochondrial cardiolipins.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 138 (1-2), 38-49 (2005).</li>
<li>Schlame, M., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+Tafazzin%2C+a+mitochondrial+phospholipid-lysophospholipid+acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The function of Tafazzin, a mitochondrial phospholipid-lysophospholipid acyltransferase.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (18), 5043-5051 (2020).</li>
<li>Schlame, M., Rua, D., Greenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+and+functional+role+of+cardiolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis and functional role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 39 (3), 257-288 (2000).</li>
<li>Mileykovskaya, E., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+membrane+domains+in+prokaryotes+and+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (10), 2084-2091 (2009).</li>
<li>Claypool, S. M., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+cardiolipin+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The complexity of cardiolipin in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 37 (1), 32-41 (2011).</li>
<li>Ren, M., Phoon, C. K., Schlame, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+function+of+mitochondrial+cardiolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 55, 1-16 (2014).</li>
<li>Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cardiolipin+in+mitochondrial+function+and+dynamics+in+health+and+disease%3A+Molecular+and+pharmacological+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Role of cardiolipin in mitochondrial function and dynamics in health and disease: Molecular and pharmacological aspects.</a> Cells. 8 (7), 728(2019).</li>
<li>Acoba, M. G., Senoo, N., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+ebb+and+flow+makes+mitochondria+go%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipid ebb and flow makes mitochondria go.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (8), 03131(2020).</li>
<li>Schlame, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+abnormalities+in+children+with+Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 42 (11), 1994-1999 (2003).</li>
<li>Wortmann, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+metabolism+with+3-methylglutaconic+aciduria+as+discriminative+feature%3A+proper+classification+and+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of metabolism with 3-methylglutaconic aciduria as discriminative feature: proper classification and nomenclature.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (6), 923-928 (2013).</li>
<li>Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+3-methylglutaconic+acid+in+disorders+of+mitochondrial+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">On the origin of 3-methylglutaconic acid in disorders of mitochondrial energy metabolism.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 39 (5), 749-756 (2016).</li>
<li>Kulik, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bloodspot+assay+using+HPLC-tandem+mass+spectrometry+for+detection+of+Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bloodspot assay using HPLC-tandem mass spectrometry for detection of Barth syndrome.</a> Clinical Chemistry. 54 (2), 371-378 (2008).</li>
<li>Vaz, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+functional+assay+in+blood+spot+to+diagnose+Barth+syndrome+using+the+monolysocardiolipin%2Fcardiolipin+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">An improved functional assay in blood spot to diagnose Barth syndrome using the monolysocardiolipin/cardiolipin ratio.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 29-37 (2022).</li>
<li>Bowron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Barth+syndrome+using+a+novel+LC-MS%2FMS+method+for+leukocyte+cardiolipin+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Barth syndrome using a novel LC-MS/MS method for leukocyte cardiolipin analysis.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (5), 741-746 (2013).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometric+analysis+of+cellular+glycerophospholipids+enabled+by+multiplexed+solvent+dependent+analyte-matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of cellular glycerophospholipids enabled by multiplexed solvent dependent analyte-matrix interactions.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7576-7585 (2008).</li>
<li>Leopold, J., Popkova, Y., Engel, K. M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+of+useful+MALDI+matrices+for+the+mass+spectrometric+characterization+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids.</a> Biomolecules. 8 (4), 173(2018).</li>
<li>Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF%2FMS+analysis+of+archaebacterial+lipids+in+lyophilized+membranes+dry-mixed+with+9-aminoacridine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine.</a> The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).</li>
<li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+of+intact+mitochondria+by+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS.</a> The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).</li>
<li>Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+method+for+the+determination+of+PC%2FLPC+ratio+in+intact+horse+serum+by+MALDI-TOF-MS%3A+an+easy-to-follow+lipid+biomarker+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).</li>
<li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+fingerprinting+of+leukocytes+by+MALDI-TOF%2FMS+as+a+screening+tool+for+Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome.</a> The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).</li>
<li>Lobasso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipidomic+approach+to+identify+potential+biomarkers+in+exosomes+from+melanoma+cells+with+different+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential.</a> Frontiers in Physiology. 12, 748895(2021).</li>
<li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cholesterol+in+the+brain+by+on-tissue+derivatization+and+quantitative+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging.</a> Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).</li>
<li>Greco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics.</a> Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).</li>
<li>Duncan, M., DeMarco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-MS%3A+Emerging+roles+in+pathology+and+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Mass+Spectrometry+%28Del+Mar%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine.</a> Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Zespół Bartha jest wrodzonym błędem metabolizmu i stanem zmieniającym życie, który prawdopodobnie będzie niedostatecznie zdiagnozowany 2,6. Jak wspomniano wcześniej, czynnikiem przyczyniającym się do tego może być brak prostego testu diagnostycznego. W tym artykule opisano prostą i szybką metodę pomiaru stosunku MLCL/CL za pomocą MALDI-TOF/MS w leukocytach do badań przesiewowych BTHS. Ponadto spektrometry masowe MALDI-TOF są szeroko rozpowszechnione w labora...

Zespół Bartha (BTHS) jest rzadką chorobą sprzężoną z chromosomem X, charakteryzującą się kardiomiopatią o wczesnym początku, miopatią mięśni szkieletowych, opóźnieniem wzrostu, neutropenią, zmienną dysfunkcją mitochondrialnego łańcucha oddechowego i nieprawidłową strukturą mitochondriów1,2,3,4,5. Częstość występowania BTHS wynosi jeden przypadek na milion mężczyzn, a obecnie na całym świecie jest mniej niż 250 znanych przypadków, chociaż powszechnie przyjmuje się, że choroba jest niedostatecznie zdiagnozowana2,6. BTHS wynika z mutacji powodujących utratę funkcji genu Tafazzin (TAFAZZIN) zlokalizowanego na chromosomie Xq28.127,8 powodując niedostateczną przebudowę mitochondrialnej fosfolipidowej kardiolipiny (CL), proces, który zwykle prowadzi do wysoce symetrycznego i nienasyconego składu acylowego9,10. CL został uznany za charakterystyczny lipid mitochondriów, gdzie jest ważnym składnikiem błony wewnętrznej, niezbędnym do fosforylacji oksydacyjnej (tj. metabolizmu energii mitochondrialnej), tworzenia nadkompleksów, importu białek i bierze udział w dynamice mitochondriów, mitofagii i apoptozie11,12,13,14,15,16. Po utracie funkcji TAFAZZYNY, przebudowa CL kończy się niepowodzeniem i w mitochondriach pacjentów z BTHS powstają specyficzne nieprawidłowości fosfolipidowe: poziom dojrzałej CL (CLm) jest obniżony, podczas gdy zwiększony poziom monolizokardiolipiny (MLCL) i zmieniony skład acylowy CL (tj. niedojrzałe gatunki CL, CLi) występują. Prowadzi to do znacznego wzrostu stosunku MLCL/CL17.
Diagnoza BTHS jest często trudna, ponieważ zaburzenie ma bardzo zmienne cechy kliniczne i biochemiczne i może się różnić między dotkniętymi osobami z tej samej rodziny i w obrębie pacjenta w czasie3,5. Wielu chłopców z BTHS wykazuje bardzo wysoki poziom wydalania z moczem kwasu 3-metyloglutakonowego (3-MGCA), ale poziom moczu może być normalny lub tylko nieznacznie zwiększony u pacjentów w miarę upływu czasu3. Jednak zwiększony poziom 3-MGCA jest cechą różnych innych zaburzeń mitochondrialnych i niemitochondrialnych, takich jak niedobór hydratazy 3-metyloglutakonylo-CoA (defekt AUH), acyduria 3-metyloglutakonowa, dystonia-głuchota, encefalopatia, zespół podobny do Leigha (MEGDEL), zespół Costeffa i zespół kardiomiopatii rozstrzeniowej z ataksją (DCMA)18,19. W związku z tym słaba swoistość 3-MCGA jako markera BTHS i ogromna zmienność u pacjentów sprawiają, że diagnoza biochemiczna jest niejednoznaczna.
Ponadto, opisano ponad 120 różnych mutacji TAFAZZIN powodujących to zaburzenie5, a zatem diagnoza genetyczna może być skomplikowana, powolna i kosztowna. Co więcej, analiza molekularna genu TAFAZZIN może prowadzić do wyników fałszywie ujemnych w obecności mutacji w sekwencjach niekodujących lub regulujących3. BTHS można jednoznacznie przebadać poprzez określenie względnych ilości i rozmieszczenia gatunków (monolizo-)CL i potwierdzić za pomocą sekwencjonowania genu TAFAZZIN lub odwrotnie.
Praktycznym testem diagnostycznym jest pomiar stosunku MLCL/CL za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i analizy jonizacji elektrorozpylającej / spektrometrii mas (ESI/MS) w plamce krwi20,21. Sam pomiar CL nie jest wystarczający do postawienia diagnozy, ponieważ niektórzy pacjenci mają prawie normalny poziom CL, ale zmieniony stosunek MLCL/CL. W związku z tym pomiar stosunku MLCL/CL ma 100% czułość i swoistość dla diagnozy BTHS21. Inna zwalidowana metoda oparta na analizie HPLC i ESI/MS została opracowana na leukocytach22, ale skomplikowane techniki chromatograficzne do separacji wcześniej wyekstrahowanych lipidów i koszt instrumentów ograniczają tę analizę do kilku laboratoriów klinicznych. Wszystkie te czynniki, wraz z brakiem prostego testu diagnostycznego, przyczyniły się do niedostatecznej diagnozy choroby.
MALDI-TOF/MS to kolejne ważne narzędzie do analizy lipidów23,24. Ta technika analityczna może być wykorzystana do bezpośredniego uzyskania profili lipidowych różnych próbek biologicznych, pomijając w ten sposób etapy ekstrakcji i separacji25,26,27,28,29, w tym w sekcjach tkanek do zastosowań obrazowania MS30. Biorąc pod uwagę tę przewagę, opracowano prostą i szybką metodę diagnozowania BTHS poprzez profilowanie mitochondrialnego CL w nienaruszonych leukocytach za pomocą MALDI-TOF/MS28. Izolacja leukocytów z zaledwie 1 ml krwi pełnej przez sedymentację i lizę erytrocytów jest prosta i nie wymaga specjalnego sprzętu ani odczynników. Ponadto opisano protokół szybkiej "mini-ekstrakcji" lipidów mający zastosowanie do niewielkich ilości leukocytów, aby zagwarantować pomyślne uzyskanie widm z czystszymi sygnałami MS o wyższym stosunku sygnału do szumu (S / N) niż w przypadku widm uzyskanych z nienaruszonych leukocytów28. Ten kolejny krok zajmuje niewiele czasu i pozwala na powtarzalność analiz nawet w przypadku przeprowadzania ich na urządzeniach MS o słabej czułości. Podsumowując, opisana tutaj metoda analityczna wymaga minimalnego przygotowania próbki, ponieważ czasochłonne i pracochłonne chromatograficzne rozdzielanie lipidów można pominąć, przyspieszając w ten sposób badanie.

<table><tbody><tr><td>1,1&prime;,2,2&-tetratetradecanoyl cardiolipina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>750332</td><td>Lipid Standard lipidowy do kalibracji MALDI-TOF</td></tr><tr><td>1,1&prime; 2,2&-tetra-(9Z-oktadecenoilo)kardiolipina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>710335</td><td>Wzorzec lipidowy do kalibracji MALDI-TOF</td></tr><tr><td>1,2-di-(9Z-heksadecenoilo)-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>878130</td><td>Standard lipidowy do kalibracji MALDI-TOF</td></tr><tr><td>1,2-ditetradekanoilo-sn-glicero-3-fosforan</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>830845</td><td>Lipidy do kalibracji MALDI-TOF</td></tr><tr><td>1,2-ditetradekanoilo-snglycero-3-fosfo-(1&prime;-rac-glycerol)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840445</td><td>Wzorzec lipidowy do kalibracji MALDI-TOF</td></tr><tr><td>1,2-ditetradekanoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryna</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840033</td><td>Wzorzec lipidowy do kalibracji MALDI-TOF</td></tr><tr><td>2-propanol, odczynnik ACS, &ge; 99,5%</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td></td><td></td>190764</tr><tr><td>9-aminoakrydyna półhydrat, 98%</td><td>Acros Organics</td><td>134410010</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, odczynnik ACS, &ge; 99,5%</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td></td><td></td>360457</tr><tr><td>Chloroform, odczynnik ACS, &ge; 99,8%</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td></td><td></td>319988</tr><tr><td>Dekstran z Leuconostoc spp. Pan 450 000-650 000</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>Analiza flex 3.3</td><td>Oprogramowanie Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy MALDI-TOF Microflex LRF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Oprogramowanie</td><td>Microsoft Office</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur 10X PBS Płynny koncentrat</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td>6505-OP</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu, odczynnik ACS, 99,0-100,5%</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, odczynnik ACS, &ge; 99.0%</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td>Numer katalogowy S9888</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

pobieranie odcisków palców kardiolipiny w leukocytach za pomocą spektrometrii mas w celu szybkiej diagnozy zespołu bartha

Fingerprinting Cardiolipin in Leukocytes by Mass Spectrometry for a Rapid Diagnosis of Barth Syndrome

Kardiolipina (CL), dimeryczny fosfolipid niosący w swojej strukturze cztery łańcuchy kwasów tłuszczowych, jest markerem lipidowym mitochondriów, w którym odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu błony wewnętrznej. Jego metabolit monolizokardiolipina (MLCL) jest fizjologicznie prawie nieobecna w ekstrakcie lipidowym komórek zwierzęcych, a jej pojawienie się jest cechą charakterystyczną zespołu Bartha (BTHS), rzadkiej i często błędnie diagnozowanej choroby genetycznej, która powoduje ciężką kardiomiopatię w okresie niemowlęcym. Opisana tutaj metoda generuje "odcisk palca kardiolipiny" i umożliwia proste oznaczenie względnych poziomów gatunków CL i MLCL w komórkowych profilach lipidowych. W przypadku leukocytów wystarczy 1 ml krwi do zmierzenia stosunku MLCL/CL za pomocą jonizacji desorpcji laserowej wspomaganej matrycą - spektrometria czasu przelotu/spektrometrii mas (MALDI-TOF/MS) w ciągu zaledwie 2 godzin od pobrania krwi. Test jest prosty i można go łatwo zintegrować z rutynową pracą laboratorium biochemii klinicznej w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w kierunku BTHS. Test wykazuje 100% czułość i swoistość dla BTHS, co czyni go odpowiednim testem diagnostycznym.

W niniejszym badaniu opisano prostą i szybką metodę izolacji leukocytów z 1 ml krwi pełnej oraz uzyskiwania profilu kardiolipin (CL) za pomocą MALDI-TOF/MS (patrz Rycina 2). Rysunek 3 przedstawia porównanie reprezentatywnych odcisków palców (fingerprinting) kardiolipiny (CL) leukocytów, uzyskanych od osób kontrolnych oraz młodych chłopców z BTHS, w masach CL i MLCL (m/zzakres. Tabela 1 wymienia gatunki CL i MLCL wykryte w tych widmach m...

Ten protokół pokazuje, jak uzyskać "odcisk palca" kardiolipiny leukocytów za pomocą spektrometrii mas do diagnozy zespołu Bartha. Ocena podwyższonego stosunku monolizokardiolipiny do kardiolipiny odróżnia pacjentów z zespołem Bartha od pacjentów z kontrolną niewydolnością serca ze 100% czułością i swoistością.

Pobieranie odcisków palców kardiolipiny w leukocytach za pomocą spektrometrii mas w celu szybkiej diagnozy zespołu Bartha

Cardiolipin (CL), a dimeric phospholipid carrying four fatty acid chains in its structure, is the lipid marker of mitochondria, wherein it plays a crucial ...

Metoda ta generuje odcisk palca leukocytów kardiolipiny za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF i umożliwia pomiar stosunku między monolizolipolipiną a kardiolipiną w celu szybkiej diagnozy zespołu Bartha. Główną zaletą tej techniki jest wykrywanie diagnostycznych form lipidów za pomocą pojedynczej rundy spektrometrii mas bezpośrednio po wyizolowaniu leukocytów z jednego mililitra krwi. Te cechy oraz czułość i swoistość oka sprawiają, że test ten jest odpowiednim testem diagnostycznym, który należy włączyć do rutynowej pracy laboratoriów klinicznych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w kierunku zespołu Bartha.Zacznij od umieszczenia próbek krwi na wytrząsarce orbitalnej na 10 minut. Następnie do 0,9 mililitra krwi pełnej w probówce o pojemności 1,5 mililitra dodaj 0,1 mililitra 20% dekstranu. Teraz delikatnie odpipetować i rozprowadzić zawiesinę 20 razy, unikając pęcherzyków powietrza, i pozostawić erytrocyty na osadzanie się przez około godzinę w temperaturze pokojowej.Za pomocą strzykawki zebrać i przenieść żółty supernatant do 15-mililitrowej probówki, a następnie odwirować przy 400 razy G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesi

fingerprinting-cardiolipin-leukocytes-mass-spectrometry-for-rapid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.

Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów

Ten film demonstruje protokół testu immunologicznego elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkera białkowego związanego ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) z płytek krwi ludzkiej. Potwierdzenie obecności białka biomarkerowego ALS uzyskuje się poprzez rozdzielenie białek płytek krwi na podstawie wielkości, a następnie detekcję chemiluminescencyjną.

Test immunologiczny elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkerów białkowych

Spektrometria mas z jonizacją metodą desorpcji (DESI-MS) to metoda otoczenia, za pomocą której próbki, w tym tkanki biologiczne, mogą być obrazowane przy minimalnym przygotowaniu próbki. Poprzez rasterowanie próbki poniżej sondy jonizacyjnej, ta technika oparta na rozpylaniu zapewnia wystarczającą rozdzielczość przestrzenną, aby dostrzec interesujące cechy molekularne w obrębie skrawków tkanki.

Obrazowanie tkanek biologicznych metodą spektrometrii mas z desorpcją i jonizacją metodą elektrorozpylania

Pomiar biomarkerów w złożonych próbkach biologicznych coraz częściej pomaga w podejmowaniu decyzji klinicznych. Opisujemy wysoce czułą metodę jednoczesnego pomiaru białka C wiążącego miozynę sercową, kinazy kreatynowej MB i troponiny sercowej I w próbkach surowicy od osób z zawałem mięśnia sercowego i zdrowych osób z grupy kontrolnej.

Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

Biomarkery są bezpośrednio mierzonymi biologicznymi wskaźnikami choroby lub zdrowia. W naukach populacyjnych i społecznych biomarkery muszą być łatwe do uzyskania, transportu i analizy. Pobieranie suszonych plam krwi (DBS) spełnia tę potrzebę, może być zbierane w terenie z wysokimi wskaźnikami odpowiedzi i analizowane pod kątem różnych biomarkerów.

Pobieranie biomarkerów zdrowotnych z wysuszonej kropli krwi w celu maksymalizacji udziału w badaniach populacyjnych

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Biomarkery chorób neurodegeneracyjnych oparte na krwi są niezbędne do prowadzenia badań klinicznych na dużą skalę. Wiarygodne i zwalidowane badanie krwi powinno wymagać małej objętości próbki, a także być mniej inwazyjną metodą pobierania próbek, przystępną cenowo i powtarzalną. W artykule wykazano, że wysokoprzepustowy test immunologiczny elektroforezy kapilarnej spełnia kryteria potencjalnego rozwoju biomarkerów.

Zastosowanie testu immunologicznego elektroforezy kapilarnej w celu poszukiwania potencjalnych biomarkerów stwardnienia zanikowego bocznego w ludzkich płytkach krwi

Tutaj opisujemy protokoły pomiaru ilości fluorescencyjnego fosfolipidu specjalnie usuwanego z cząstek dawcy lipidów za pomocą lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) obecnej w całym ludzkim osoczu lub surowicy. Wykazaliśmy, że ten wskaźnik funkcjonalności HDL przewiduje występ chorób sercowo-naczyniowych.

Testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Poznaj metodę analizy kardiolipiny w leukocytach za pomocą spektrometrii MALDI-TOF do szybkiej diagnozy zespołu Bartha. Technika mierzy stosunek monolizokardiolipiny do kardiolipiny z 100% czułością i swoistością.

Pobieranie odcisków palców kardiolipiny w leukocytach za pomocą spektrometrii mas w celu szybkiej diagnozy zespołu Bartha

Przeglądaj więcej filmów