Name: Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę współhodowli organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z komórkami ILC1. Technika umożliwia badanie wzajemnych interakcji między komórkami nabłonkowymi a komórkami limfoidalnymi w kontekście homeostazy jelit i stanów zapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

E.R. potwierdza stypendium doktoranckie od Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. potwierdza stypendium doktoranckie od Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. potwierdza stypendium doktoranckie z NIHR GSTT BRC. J.F.N. potwierdza stypendium Marie Skłodowska-Curie, stypendium King's Prize, stypendium RCUK/UKRI Rutherford Fund (MR/R024812/1), oraz Seed Award in Science od Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Dziękujemy również głównemu zespołowi cytometrii przepływowej BRC z siedzibą w Guy's Hospital. Myszy reporterskie Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 były hojnym prezentem od G. Eberla (Institut Pasteur, Paryż, Francja). Myszy CD45.1 C57BL/6 zostały podarowane przez T. Lawrence'a (King's College London, Londyn) i P. Barrala (King's College London, Londyn).

<ol><li>Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mend+your+fences%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mend your fences.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).</li>
<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cells%3A+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).</li>
<li>Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cell-epithelial+cell+modules+sustain+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis.</a> Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).</li>
<li>Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells%3A+major+players+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells%3A+10+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells: 10 years on.</a> Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).</li>
<li>Klose, C. S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+type+1+ILCs+from+a+common+progenitor+to+all+helper-like+innate+lymphoid+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages.</a> Cell. 157 (2), 340-356 (2014).</li>
<li>Bernink, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-12+and+-23+control+plasticity+of+CD127%2B+group+1+and+group+3+innate+lymphoid+cells+in+the+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria.</a> Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).</li>
<li>Jowett, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ILC1+drive+intestinal+epithelial+and+matrix+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling.</a> Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).</li>
<li>Wong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+ROR%CE%B1+is+critical+for+nuocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor RORα is critical for nuocyte development.</a> Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).</li>
<li>Neill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuocytes+represent+a+new+innate+effector+leukocyte+that+mediates+type-2+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity.</a> Nature. 464, 1367-1370 (2010).</li>
<li>Mjösberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA3+is+essential+for+the+function+of+human+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).</li>
<li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-25-responsive%2C+lineage-negative+KLRG1hi+cells+are+multipotential+%27inflammatory%27+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529, 221-225 (2016).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529, 226-230 (2016).</li>
<li>Eberl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+function+for+the+nuclear+receptor+RORgamma%28t%29+in+the+generation+of+fetal+lymphoid+tissue+inducer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells.</a> Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).</li>
<li>Spits, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells--a+proposal+for+uniform+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature.</a> Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).</li>
<li>Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+lymph+nodes+collect+CD4%2BCD3-+LTbeta%2B+cells+that+can+differentiate+to+APC%2C+NK+cells%2C+and+follicular+cells+but+not+T+or+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells.</a> Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).</li>
<li>Lindemans, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+promotes+intestinal-stem-cell-mediated+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration.</a> Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).</li>
<li>Meininger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+features+of+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific features of innate lymphoid cells.</a> Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).</li>
<li>Dutton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+innate+lymphoid+cell+populations+at+different+sites+in+mice+with+defective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity.</a> Wellcome Open Research. 2, 117(2018).</li>
<li>Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+innate+lymphoid+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of innate lymphoid cell subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).</li>
<li>Bernink, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+type+1+innate+lymphoid+cells+accumulate+in+inflamed+mucosal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues.</a> Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2012).</li>
<li>Date, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-gut+organoids%3A+reconstitution+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).</li>
<li>Bartfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+infectious+diseases+and+host-microbe+interactions+in+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids.</a> Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Tallapragada, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflation-collapse+dynamics+drive+patterning+and+morphogenesis+in+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lymphocytes+from+the+mouse+small+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281(2018).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+maintenance+of+mouse+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells.</a> Bio-protocol. 6 (4), 1733(2016).</li>
<li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).</li>
<li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li>
<li>Cardoso, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+type+2+innate+lymphoid+cells+via+neuromedin+U%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U.</a> Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).</li>
<li>Gury-BenAri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+and+regulatory+landscape+of+intestinal+innate+lymphoid+cells+are+shaped+by+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome.</a> Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).</li>
<li>Seehus, C., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+murine+innate+lymphoid+cells+from+common+lymphoid+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells.</a> Bio-protocol. 6 (6), 1770(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Protokół ten opisuje metody ustanawiania mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania rzadkiego ILC1 poprzez minimalizację utraty limfocytów podczas protokołu dysocjacji jelit oraz ustanawiania kokultur między tymi dwoma przedziałami. Protokół ten składa się z wielu etapów i chociaż niektóre z nich są specyficzne dla ILC1, podejście to można zastosować do innych typów jelitowych komórek odpornościowych, a konfiguracje kohodowli można modułowo dostosować do indywidualnych pytań badawczych. Podkreślono tutaj kilka krytyc...

Komunikacja między nabłonkiem jelitowym a układem odpornościowym rezydującym w jelitach jest kluczowa dla utrzymania homeostazy jelitowej1. Zakłócenia tych interakcji są związane zarówno z chorobami miejscowymi, jak i ogólnoustrojowymi, w tym nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD) i nowotworami przewodu pokarmowego2. Godny uwagi przykład jednego z niedawno opisanych krytycznych regulatorów homeostazy pochodzi z badania wrodzonych komórek limfoidalnych (ILC), które stały się kluczowymi graczami w krajobrazie immunologii jelitowej3. ILC to grupa heterogennych wrodzonych komórek odpornościowych, które regulują homeostazę jelit i koordynują stan zapalny głównie poprzez sygnalizację za pośrednictwem cytokin4.
Mysie ILC są szeroko podzielone na podtypy w oparciu o profile ekspresji czynników transkrypcyjnych, receptorów i cytokin5. ILC typu 1, które obejmują cytotoksyczne komórki NK (Natural Killer) i pomocnicze ILC typu 1 (ILC1), są definiowane przez ekspresję czynnika transkrypcyjnego (eomesoderminy) Eomes i białka T-box ulegającego ekspresji w limfocytach T (T-bet) 6, odpowiednio, i wydzielają cytokiny związane z odpornością T helper typu 1 (TH1): interferon-γ (IFNγ) i czynnik martwicy nowotworu (TNF), w odpowiedzi na interleukinę (IL)-12, IL-15 i IL-187. Podczas homeostazy rezydujące w tkankach ILC1 wydzielają transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β), aby stymulować proliferację nabłonka i przebudowę macierzy8. ILC typu 2 (ILC2) reagują głównie na zakażenie robakami pasożytniczymi poprzez wydzielanie cytokin związanych z T-pomocnikiem typu 2 (TH2): IL-4, IL-5 i IL-13 i charakteryzują się ekspresją receptora sierocego związanego z kwasem retinowym (ROR) α (ROR-α)9 i GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12. U myszy jelitowe "zapalne" ILC2 są dodatkowo charakteryzowane ekspresją receptora podobnego do lektyny komórki zabójczej (podrodzina G członek 1, KLRG)13, gdzie reagują na nabłonkowe komórki kępek pochodzące z IL-2514,15. Wreszcie, ILC typu 3, które obejmują komórki indukujące tkankę limfoidalną i pomocnicze ILC typu 3 (ILC3), są zależne od czynnika transkrypcyjnego ROR-γt16 i grupują się w grupy, które wydzielają czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF), IL-17 lub IL-22 w odpowiedzi na lokalne sygnały IL-1β i IL-2317. Komórki indukujące tkankę limfoidalną skupiają się w łatach Peyera i mają kluczowe znaczenie dla rozwoju tych wtórnych narządów limfatycznych podczas rozwoju18, podczas gdy ILC3 są najliczniejszym podtypem ILC w dorosłej mysiej blaszce jelita cienkiego właściwej. Jeden z najwcześniejszych mysich systemów kohodowli organoidów jelitowych z ILC3 został wykorzystany do zbadania wpływu cytokiny IL-22 na reprodukcję transduktora sygnału i aktywatora transkrypcji 3 (STAT-3) za pośrednictwem bogatego w leucynę powtórzenia zawierającego receptor sprzężony z białkiem G 5 (Lgr5) + proliferację jelitowych komórek macierzystych19, potężny przykład regeneracyjnej interakcji ILC-nabłonek. ILC wykazują niejednorodność odcisku między narządami20,21 i wykazują plastyczność między podzbiorami w odpowiedzi na polaryzację cytokin22. To, co napędza te specyficzne tkankowo odciski i różnice w plastyczności oraz jaką rolę odgrywają w chorobach przewlekłych, takich jak IBD23, pozostaje ekscytującymi tematami, które można rozwiązać za pomocą współkultur organoidowych.
Organoidy jelitowe okazały się udanym i wiarygodnym modelem do badania nabłonka jelitowego24,25. Są one generowane przez hodowlę komórek macierzystych Lgr5 + nabłonka jelitowego lub całych izolowanych krypt, które zawierają komórki Panetha jako endogenne źródło członka rodziny Wnt 3A (Wnt3a). Te struktury 3D są utrzymywane albo w syntetycznych hydrożelach26, albo w biomateriałach, które naśladują blaszkę pierwotną właściwą, na przykład Thermal-crosslinking Basal Zewnątrzcellular Matrix (TBEM), i są dalej uzupełniane czynnikami wzrostu, które naśladują otaczającą niszę, w szczególności nabłonkowym czynnikiem wzrostu (EGF), inhibitorem białka morfogenetycznego kości (BMP) Noggin oraz ligandem Lgr5 i agonistą Wnt R-Spondin127. W tych warunkach organoidy utrzymują nabłonkowo-podstawową polaryzację nabłonka i przypominają strukturę kosmków krypty nabłonka jelitowego z pączkującymi kryptami komórek macierzystych, które ostatecznie różnicują się w komórki absorpcyjne i wydzielnicze w środku organoidu, które następnie rozprzestrzeniają się do wewnętrznego pseudoświatła przez anoikis28. Chociaż same organoidy jelitowe okazały się niezwykle korzystne jako redukcjonistyczne modele rozwoju i dynamiki nabłonka w izolacji29,30, mają one ogromny potencjał w przyszłości do zrozumienia, w jaki sposób te zachowania są regulowane, wpływane, a nawet zakłócane przez przedział immunologiczny.
W poniższym protokole opisana jest metoda kohodowli pomiędzy mysimi organoidami jelita cienkiego a ILC1 pochodzącymi z blaszki właściwej, która została niedawno wykorzystana do określenia, jak ta populacja nieoczekiwanie zmniejsza jelitowe sygnatury stanu zapalnego, a zamiast tego przyczynia się do zwiększonej proliferacji nabłonka poprzez TGF-β w tym systemie8.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (BV510)</td><td>BioLegend</td><td>103137</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse NK1.1 (PE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-5941-83</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement (50X), bez surowicy</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD127 Przeciwciało monoklonalne (APC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD19 (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD3e (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD5 (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>COLLAGENASE D, 500MG</td><td>Merck</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells</td><td>Linia komórkowa została wykorzystana do zbioru kondycjonowanego supernatantu RSpondin1, linia komórkowa i umowa o transferze materiałów została dostarczona przez Radę Powierniczą Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DISPASE II (NEUTRALNA PROTEAZA, STOPIEŃ II)</td><td>Merck</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1X) Zmodyfikowana mieszanka składników odżywczych Eagle firmy Dulbecco F-12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DNASE I, GRADE II</td><td>Merck</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>Kwas tetraoctanu etylenodiaminy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2482-100</td><td></td></tr><tr><td>FC block</td><td>2B Scientific</td><td>BE0307</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, nieaktywowana</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>3050-038</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (10X)</td><td>Gibco</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1X)</td><td>Gibco</td><td>12549069</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T- mNoggin-Fc Komórki</td><td>Linia komórkowa została wykorzystana do zbioru kondycjonowanego supernatantu Noggin, linii komórkowej nabytej na mocy umowy o transferze materiałów z Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, Holandia i jest oparta na publikacji Farin, Van Es i Clevers Gastroenterology (2012).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne KLRG1 (PerCP eFluor-710)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5893-82</td><td></td></tr><tr><td>Żywy/martwy zestaw do naprawy niebieskich martwych komórek, do wzbudzenia UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne Ly-6G/Ly-6C (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Podstawna membrana macierzynna, Phenol Red-free, LDEV-free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina (500mM)</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NKp46 Przeciwciało monoklonalne (PE cyjaninina 7)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25-3351-82</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1 X) 7,2 pH</td><td>Thermo Fisher Naukowe</td><td>12549079</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF, białko wolne od zwierząt</td><td>R& D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko IL-15 GMP, CF</td><td>R& D Systems</td><td>247-GMP</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-2 (bez nośnika)</td><td>BioLegend</td><td>589106</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IL-7 (bez nośnika)</td><td>R& D Systems</td><td>407-ML-005/CF</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek (inhibitor ROCK)</td><td>Bio-techne</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Plastics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubka</td><td>Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 10 ml</td><td>StarLab</td><td>E4860-0010</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>Falcon</td><td>11507411</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Końcówki</td> do pipet <td>StarLab</td><td>E4860-0025</td><td></td></tr><tr><td>p10</td> końcówki do pipet <td>StarLab</td><td>S1121-3810-C</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Końcówki do pipet</td><td>StarLab</td><td>I1026-7810</td><td></td></tr><tr><td>p200 końcówki do pipet</td><td>StarLab</td><td>E1011-0921</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa 24-dołkowa płytka</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 i z kontrolowaną temperaturą</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R/S</td><td></td></tr><tr><td>Flow Assisted Cellular Sorter</td><td>BD</td><td>FACS Aria II</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewany shaker</td><td>Stuart Equipment</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik na lód</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mikroskop z odwróconym światłem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)</td><td></td></tr><tr><td>p10 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000016</td><td></td></tr><tr><td>p1000 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000063</td><td></td></tr><tr><td>p200 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000032</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet do pipet</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Mokry lód</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Złożone współkultury organoidów z komórkami odpornościowymi dostarczają wszechstronnego narzędzia do badania dwukierunkowych interakcji, które leżą u podstaw delikatnej równowagi homeostazy błony śluzowej. Te trójwymiarowe, wielokomórkowe systemy oferują redukcjonistyczny model rozwiązywania chorób wieloczynnikowych i rozwiązywania problemów technicznych, które pojawiają się podczas badania rzadkich typów komórek, takich jak wrodzone komórki limfoidalne rezydujące w tkance (ILC). W tym artykule opisano mysi system, który łączy organoidy jelita cienkiego i pomocnicze ILC typu 1 (ILC1) pochodzące z blaszki właściwej jelita cienkiego, które można łatwo rozszerzyć na inne ILC lub populacje odpornościowe. ILC to populacja zamieszkująca tkanki, która jest szczególnie wzbogacona w błonę śluzową, gdzie promują homeostazę i szybko reagują na uszkodzenia lub infekcje. Kohodowle organoidów z ILC zaczęły już rzucać światło na nowe moduły sygnalizacji nabłonkowo-immunologicznej w jelitach, ujawniając, w jaki sposób różne podzbiory ILC wpływają na integralność i regenerację bariery nabłonkowej jelit. Protokół ten umożliwi dalsze badania wzajemnych interakcji między komórkami nabłonkowymi i odpornościowymi, które mogą dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów homeostazy błony śluzowej i stanu zapalnego.

Po pomyślnym zakończeniu procedury, świeżo wyizolowane krypty powinny utworzyć pączkujące struktury krypt w ciągu 2-4 dni (Rycina 1A). Zdrowe i stabilne kultury organoidów powinny aktywnie rosnąć; mogą być one pasażowane i powiększane zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole.
Niniejszy protokół opisuje izolację komórek ILC1 z jelita cienkiego myszy z transgenicznej linii reporterowej RORγtGFP, co umożliwia izolację żywych komórek ILC1 za pomocą meto...

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Protokół ten stanowi ważne narzędzie do badania interakcji między jelitowymi komórkami odpornościowymi a nabłonkiem oraz do analizy, w jaki sposób te interakcje mogą regulować homeostazę jelitową i stan zapalny. Główną zaletą tej techniki jest znakomita kontrola eksperymentalna, ułatwiona przez model redukcji in vitro, który można wykorzystać do odpowiedzi na pytania z zakresu biologii nabłonkowej i immunologicznej. System ten został już wykorzystany do określenia roli ILC1 w ekspansji CD44-dodatnich krypt nabłonkowych i ma potencjał, aby jeszcze bardziej pogłębić naszą wiedzę na temat chorób żołądkowo-jelitowych zależnych od stanu zapalnego.Na początek umieść termiczną sieciowaną podstawową macierz zewnątrzkomórkową na lodzie w celu rozmrożenia i wstępnie ogrzej standardową 24-dołkową płytkę poddaną kulturze tkankowej, umieszczając ją w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie wyjąć płytkę zawierającą organoidy z inkubatora i wyrzucić pożywkę z dołka, który ma być przepuszczony. Następnie dodaj 500 mikrolitrów lodowatego zaawansowanego DMEM F12 do studzienek i za pomocą końcówki P-1000 zbierz organoidy ze wszystkich dołków do 15-mililitrowej probówki.Przepłukać dn

co-culture-murine-small-intestine-epithelial-organoids-with-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym protokole wideo krok po kroku wyjaśniamy transdukcję lentiwirusową w organoidach pierwotnego nabłonka jelitowego oraz przetwarzanie i dalszą analizę tych kultur za pomocą ilościowego RT-PCR, RNA-mikromacierzy i immunohistochemii.

Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

Kultury pochodzące z komórek macierzystych kryją w sobie ogromny potencjał do modelowania chorób zakaźnych. W tym miejscu opisano hodowlę mysich i ludzkich organoidów żołądkowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Organoidy są mikrowstrzykiwane z patogenem żołądkowym Helicobacter pylori.

Organoidy jako model chorób zakaźnych: hodowla organoidów żołądka ludzkiego i mysiego oraz mikroiniekcja Helicobacter pylori

Tutaj opisany jest protokół zbierania, utrzymywania i leczenia organoidów jelita cienkiego myszy z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) i Listeria monocytogenes, a także nacisk na ekspresję genów i właściwe techniki normalizacji białka.

Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

Obecny protokół opisuje ustanowienie systemu organoidów mysiego okrężnicy do badania aktywności i funkcjonowania komórek macierzystych okrężnicy w modelu nokautu klaudyny-7.

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Tutaj opisujemy protokół hodowli organoidów 3D jelit świń z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych. Opisujemy również metodę tworzenia monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów 3D, umożliwiających dostęp do wierzchołkowej strony komórek nabłonkowych.

Hodowla organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Opisujemy mikroskopię konfokalną i metody śledzenia zastosowane do dwóch strategii reporterowych: mozaikowych organoidali do rozdzielania zachowania i losu poszczególnych komórek oraz organoidali reporterowych typu komórkowego do monitorowania przemian typów komórek w ludzkich i mysich organoidach jelitowych.

Obrazowanie żywych komórek i śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania dynamiki klonalnej i przejść losu w ludzkich i mysich organoidach jelitowych

Poznaj metodę współhodowli organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z komórkami ILC1. Technika umożliwia badanie wzajemnych interakcji między komórkami nabłonkowymi a komórkami limfoidalnymi w kontekście homeostazy jelit i stanów zapalnych.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Przeglądaj więcej filmów