Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Protokół ten stanowi ważne narzędzie do badania interakcji między jelitowymi komórkami odpornościowymi a nabłonkiem oraz do analizy, w jaki sposób te interakcje mogą regulować homeostazę jelitową i stan zapalny. Główną zaletą tej techniki jest znakomita kontrola eksperymentalna, ułatwiona przez model redukcji in vitro, który można wykorzystać do odpowiedzi na pytania z zakresu biologii nabłonkowej i immunologicznej. System ten został już wykorzystany do określenia roli ILC1 w ekspansji CD44-dodatnich krypt nabłonkowych i ma potencjał, aby jeszcze bardziej pogłębić naszą wiedzę na temat chorób żołądkowo-jelitowych zależnych od stanu zapalnego.

Na początek umieść termiczną sieciowaną podstawową macierz zewnątrzkomórkową na lodzie w celu rozmrożenia i wstępnie ogrzej standardową 24-dołkową płytkę poddaną kulturze tkankowej, umieszczając ją w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie wyjąć płytkę zawierającą organoidy z inkubatora i wyrzucić pożywkę z dołka, który ma być przepuszczony. Następnie dodaj 500 mikrolitrów lodowatego zaawansowanego DMEM F12 do studzienek i za pomocą końcówki P-1000 zbierz organoidy ze wszystkich dołków do 15-mililitrowej probówki.

Przepłukać dno studzienek 250 do 300 mikrolitrami lodowatego zaawansowanego DMEM F12, upewniając się, że w studni nie pozostały żadne organoidy i zebrać się w 15-mililitrowej probówce zawierającej zebrane organoidy. Ponownie zawiesić jedno- lub dwudniowy zebrany osad organoidowy w jednym mililitrze lodowatego zaawansowanego DMEM F12. Wstępnie pokryj jedną 1,5-mililitrową probówkę PBS2 na wrodzone komórki limfoidalne replikuj próbkę, a następnie za pomocą wstępnie powlekanej końcówki PBS2 rozprowadź około 100 do 200 organoidów w probówce.

Używając końcówki P-1000 z powłoką PBS2, dodaj objętość nie mniejszą niż 500 ILC1 obliczoną na etapie sortowania do 1,5-mililitrowej probówki z powłoką PBS2 zawierającej organoidy. Odwiruj ILC1 i organoidy w temperaturze 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i upewnij się, że unikasz wirówek stołowych o małej średnicy, ponieważ będą one ciągnąć komórki wzdłuż krawędzi wnętrza probówki, zamiast tworzyć osad na końcu probówki. Następnie usunąć supernatant powoli i delikatnie, nie naruszając osadu, i umieścić próbkę na lodzie.

Trzymając probówkę na zimnej powierzchni, ponownie zawieś organoidy i ILC w 30 mikrolitrach termicznie sieciowanej podstawowej macierzy zewnątrzkomórkowej co najmniej 10 do 15 razy, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Nałożyć 30 mikrolitrów na studzienkę organoidów ILC w sieciowanej termicznie podstawowej macierzy zewnątrzkomórkowej na wstępnie podgrzaną 24- lub 48-dołkową płytkę, aby utworzyć pojedynczą kopułę. Następnie umieść płytkę bezpośrednio w inkubatorze na 10 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnie dodaj 550 mikrolitrów kompletnej pożywki ILC1 na studzienkę z dowolnymi cytokinami eksperymentalnymi lub przeciwciałami blokującymi i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Po 24 godzinach delikatnie wyjmij płytkę z inkubatora i pozostaw ją na minutę w kapturze do hodowli tkankowej, aby upewnić się, że limfocyty są osadzone. Usuń od 200 do 250 mikrolitrów pożywki i umieść ją w pustym dołku na 24-dołkowej płytce.

Za pomocą odwróconego mikroskopu sprawdź supernatant, aby upewnić się, że nie usunięto żadnych limfocytów. Jeśli supernatant jest klarowny, dodać 300 mikrolitrów świeżej pożywki ILC1 do kokultury w pierwotnym dołku. Jeśli limfocyty są obecne w supernatancie, odwirować w temperaturze 300 do 400 G przez trzy do pięciu minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach świeżej pożywki ILC1.

Następnie dodaj zawiesinę komórek do pozostałych 200 do 250 mikrolitrów pożywki w oryginalnej studzience. Przeprowadzić dalszą analizę za pomocą immunofluorescencji, cytometrii przepływowej lub oczyszczania FACS populacji docelowych do buforu lizy w celu analizy ekspresji genów przez poszukiwanie pojedynczej komórki lub masowego RNA lub RT-qPCR, jak opisano w tekście. Po pomyślnym zakończeniu przejścia, zdrowe i wytrzymałe hodowle organoidów ujawniły, że świeżo wyizolowane krypty powinny uformować pączkujące struktury krypt w ciągu dwóch do czterech dni.

Analizę cytometrii przepływowej przeprowadzono w celu wyizolowania ILC1 jelita cienkiego z mysiej transgenicznej linii reporterowej ROR gamma-T i stwierdzono, że oczekiwany zakres liczby ILC wynosi od 350 do 3 500 izolowanych komórek. Po zasianiu organoidami kokultury można uwidocznić za pomocą cytochemii immunochemicznej. Mikroskopia konfokalna ujawniła obrazy organoidów jelita cienkiego, które są hodowane samodzielnie i w obecności ILC1.

Barwienie immunocytochemiczne ujawnia obecność CD45-dodatniego ILC1 w bliskim sąsiedztwie komórek nabłonka Zonula occludens białko-1-dodatnich w organoidowych kokulturach ILC1. Cytometria przepływowa wykazała, że cząsteczka adhezji komórkowej nabłonka oznacza komórki nabłonka jelitowego w organoidach, podczas gdy CD45 oznacza ILC1s. Wykres cytometrii przepływowej i immunochemia wykazały zwiększoną ekspresję CD44 w komórkach nabłonka jelitowego podczas jednoczesnej hodowli z ILC1.

Badania RT-qPCR pokazują, że kohodowla ILC1 specyficznie zwiększyła poziom CD44 wariant 6, który był hamowany przez przeciwciało neutralizujące TGF-beta 1, 2, 3 i regulowany w górę przez rekombinowany TGF-beta 1 w hodowlach samych organoidów jelita cienkiego. Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas manipulowania organoidami, aby upewnić się, że całe struktury są w stanie utrzymać się i sprawdzić, czy struktury są wystarczająco granulowane po odwirowaniu. Zwiększając złożoność systemu poprzez dodawanie innych składników immunologicznych i nieimmunologicznych, ten system in vitro może być wykorzystany do odpowiedzi na dalsze pytania w biologii jelit.