Wysokoprzepustowy test kometowy do oceny uszkodzeń DNA komórkowego
10 maja 2022
Test kometarny jest popularnym sposobem wykrywania uszkodzeń DNA. W tym badaniu opisano podejście do przeprowadzania slajdów w reprezentatywnych wariantach testu komety. Takie podejście znacznie zwiększyło liczbę próbek przy jednoczesnym skróceniu czasu trwania testu, liczby manipulacji szkiełkami i ryzyka uszkodzenia żeli.
Test kometarny jest szeroko stosowany do oceny genotoksyczności. Nasz protokół oferuje szereg zalet metodologicznych w porównaniu ze standardowym testem komet. Nasza technologia koncentruje się na trzymaniu standardowych prowadnic komet w pionie i przetwarzaniu w partiach po 25 sztuk w specjalnie do tego przeznaczonym stojaku.
Obejmuje to elektroforezę, więc zbiornik jest mniejszy, zużywa mniej bufora i ma zintegrowane chłodzenie. Trzymane w stojaku delikatne żele na szkiełkach są lepiej chronione i przemieszczają się z roztworu do roztworu w ciągu 25 sekund. Korzystając z naszego protokołu dotyczącego komet krwi, naukowcy mogą użyć nakłucia krwi do zbadania uszkodzeń DNA u ludzi, innych gatunków i szerokiej gamy potencjalnie genotoksycznych ekspozycji środowiskowych.
Każdy z różnych formatów testu komety, który wykorzystuje szkiełka mikroskopowe jako solidne podłoże dla żeli kometarnych, jest podatny na nasze podejście. Kluczową częścią tej techniki jest ładowanie próbek po zmieszaniu z agarozą LMP. Próbki należy szybko załadować bez tworzenia pęcherzyków powietrza i przykryć szkiełkiem nakrywkowym natychmiast przed zestaleniem.
Na początek przygotuj 0,6% agarozę o niskiej temperaturze topnienia w PBS i umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Oznacz matowy koniec wstępnie powlekanych szkiełek nazwą, datą i informacjami o leczeniu za pomocą markera permanentnego lub ołówka. Umieść talerz chłodzący na płaskiej ławce i włóż dwa zamrożone pakiety chłodzące do wysuwanej szuflady pod metalową powierzchnią.
Następnie umieść szkiełka na płycie chłodzącej, aby wstępnie schłodzić przez jedną do dwóch minut. Odwirować i usunąć supernatant z probówek z próbkami i natychmiast umieścić je z powrotem na lodzie. Zawiesić osad komórkowy z 200 mikrolitrami 0,6% agarozy o niskiej temperaturze topnienia i wymieszać przez pipetowanie.
Następnie dodaj 80 mikrolitrów komórek zawierających agarozę na schłodzone szkiełko i szybko umieść szkiełko nakrywkowe na żelu. Pozostaw żel na płycie chłodzącej na jedną do dwóch minut. W międzyczasie przygotuj 500 mililitrów roztworu roboczego buforu do lizy i wlej go do naczynia do lizy.
Po stwardnieniu żeli szybko usuń szkiełka nakrywkowe, delikatnie przytrzymując szkiełko między kciukiem a palcem wskazującym i zsuwając szkiełko nakrywkowe z żelu. Następnie umieść slajdy w uchwycie na slajdy tak, aby wszystkie czarne kropki na slajdach były skierowane w tym samym kierunku. Umieść nośnik szkiełka w naczyniu do lizy.
Zamknij pokrywę naczynia do lizy i umieść je do inkubacji. Ostrożnie wyjmij nośnik szkiełka z naczynia do lizy, nie naruszając żeli. Delikatnie umieść nosidełko szkiełka w naczyniu do mycia wypełnionym lodowatą wodą podwójnie destylowaną.
Upewnij się, że szkiełka są całkowicie zanurzone i pozostaw ustawienie na 30 minut. Umieść zamrożony pakiet chłodzący pod zbiornikiem do elektroforezy, aby utrzymać optymalną temperaturę bufora. Następnie dodaj do zbiornika lodowaty roztwór roboczy do elektroforezy i przenieś do niego nośnik szkiełka.
Ustaw szkiełka w taki sposób, aby żele zawierające ogniwa były skierowane w stronę katody. Inkubuj szkiełka w zbiorniku do elektroforezy przez 20 minut, aby umożliwić rozwinięcie DNA. Następnie włącz zasilanie, aby wykonać elektroforezę przez 20 minut przy napięciu 1,19 V na centymetr.
Po zakończeniu elektroforezy wyłącz zasilanie i wyjmij nośnik szkiełka ze zbiornika do elektroforezy. Pozwól nośnikowi szkiełka spłynąć na bibułce przez 30 sekund. Następnie umieść nośnik szkiełka w naczyniu zawierającym bufor neutralizacyjny i pozostaw na 20 minut.
Następnie umieść go w naczyniu myjącym zawierającym lodowatą wodę podwójnie destylowaną i pozostaw na 20 minut. Po umyciu wyjmij nośnik szkiełka z wody i pozostaw szkiełka do wyschnięcia w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Aby nawodnić szkiełka, przenieś nośnik szkiełka do naczynia myjącego zawierającego lodowatą wodę podwójnie destylowaną i pozostaw na 30 minut.
Następnie umieść nośnik szkiełka w naczyniu barwiącym zawierającym 2,5 mikrograma na mililitr roztworu jodku propydyny. Zamknij pokrywkę naczynia do barwienia i inkubuj je przez 20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przenieść nośnik szkiełka do osobnego naczynia i myć go lodowatą wodą podwójnie destylowaną przez 20 minut.
Wyjmij szkiełko podstawowe z naczynia i całkowicie wysusz je w ciemności, w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza lub w temperaturze pokojowej. Po całkowitym wyschnięciu szkiełek przechowuj je w pudełku na szkiełka w ciemności, aż będą gotowe do analizy obrazu. Ludzkie keratynocyty naświetlano różnymi dawkami UVA i UVB lub traktowano 50-mikromolowym nadtlenkiem wodoru w celu wywołania uszkodzenia DNA.
Optymalne napięcie wynosiło 1,19 wolta na centymetr, ponieważ wywołuje najbardziej czułą odpowiedź i największy procent DNA ogona. Ludzka krew pełna była napromieniana różnymi dawkami UVA i traktowana różnymi stężeniami Fpg. Wysokoprzepustowy alkaliczny test komet wykazał, że optymalne poziomy uszkodzenia DNA zostały wywołane przy czterech jednostkach na mililitr Fpg.
Linia komórkowa raka jajnika SK-OV-3 była leczona kombinacją cisplatyny i nadtlenku wodoru. Nienaświetlone komórki nie wykazywały żadnych uszkodzeń. Ekspozycja na sam nadtlenek wodoru wygenerowała znaczący średni moment ogona Olive w porównaniu z komórkami, w których indukowano wiązania krzyżowe wewnątrzniciowe DNA.
Po leczeniu 100-mikromolową cisplatyną wiązania wewnątrzniciowe DNA wzrosły ze szczytem po 12 godzinach, po czym poziomy spadły do zera po 30 godzinach Konieczne jest umieszczenie okładu z lodu w zbiorniku do elektroforezy i inkubacja szkiełek przez 20 minut, aby rozwinąć DNA przed elektroforezą. Ten krok pomoże uszkodzonemu DNA przemieszczać się przez prąd. Przeprowadzenie testu ze szkiełkami umieszczonymi pionowo pozwoliło nam zautomatyzować test komety.
Dodatkowo, nasza technika uprościła test komety na potrzeby badań.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zaawansowane podejście do testu kometowego, powszechnie stosowanej metody wykrywania uszkodzeń DNA. Poprzez ustawienie szkiełek w pionie i przetwarzanie ich w partiach, metoda ta zwiększa przepustowość próbek, jednocześnie redukując czas oraz ryzyko związane z ich manipulacją.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Ocena genotoksyczności
- Wykrywanie uszkodzeń DNA
- Optymalizacja testu kometowego
Wprowadzenie
- Test kometowy jest krytycznym narzędziem w badaniach genetycznych.
- Standardowe metody mogą być czasochłonne i pracochłonne.
- Zwiększenie przepustowości i minimalizacja uszkodzeń żelu są niezbędne dla skutecznego prowadzenia badań.
Zastosowane metody
- Zmodyfikowany protokół testu komet wykorzystujący szkiełka pionowe.
- Zastosowanie w próbkach krwi ludzkiej i innych gatunków.
- Elektroforeza ze zintegrowanym chłodzeniem i optymalizowanym zużyciem buforu.
Główne wyniki
- Nowa metoda umożliwia jednoczesne przetwarzanie 25 próbek.
- Zwiększona ochrona żeli podczas manipulacji.
- Zwalidowana w badaniach nad odpowiedzią DNA na uszkodzenia wywołane ekspozycją na UVA/UVB oraz czynniki chemiczne.
Wnioski
- Badanie pomyślnie demonstruje usprawnione podejście do testu kometowego.
- Wyniki przyczyniają się do postępów w badaniach nad genotoksycznością oraz w opracowywaniu odpowiedniej metodologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowe platformy testu kometowego rozwiązują krytyczny problem wąskiego gardła w ocenie genotoksyczności, umożliwiając szybką i skalowalną kwantyfikację uszkodzeń DNA w różnych typach komórek. Innowacja ta zwiększa pewność prognostyczną w fazie wczesnego odkrywania oraz przesiewania toksyczności, wspierając decyzje dotyczące portfela projektów w oparciu o analizę ryzyka oraz mechanistyczną redukcję ryzyka. Uproszczone przepływy pracy oraz gotowość do automatyzacji sprawiają, że podejście to stanowi wielokrotnego użytku zasób dla ruroprzewodów B+R w skali przedsiębiorstwa.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceuticals
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia rzetelną analizę szlaków uszkodzeń DNA w celu walidacji celu terapeutycznego.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez kwantyfikację odpowiedzi genotoksycznych na związki kandydackie.
- Ułatwia funkcjonalną ocenę mechanizmów naprawy DNA w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Zwiększa pewność prognostyczną podczas selekcji zasobów we wczesnej fazie rozwoju na podstawie profili genotoksyczności.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia ustandaryzowaną, wysokoprzepustową kwantyfikację uszkodzeń DNA do przesiewania związków.
- Zmniejsza zmienność testu oraz potrzebę ręcznego przenoszenia próbek, co wspiera powtarzalność i skalowalność.
- Umożliwia szybką, równoległą ocenę wielu warunków lub ekspozycji.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego przesiewu mechanistycznego lub fenotypowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie wyników uszkodzeń DNA ze strategiami biomarkerów translacyjnych w modelach przedklinicznych.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkryć in vitro do walidacji efektów genotoksycznych in vivo.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez kwantyfikację kinetyki naprawy i uszkodzeń DNA.
- dostarcza wglądu w mechanizmy genotoksyczności indukowanej związkami, istotnych dla patogenezy chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten wysokoprzepustowy test kometowy integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając wczesne wykrywanie właściwości genotoksycznych oraz wspierając identyfikację i optymalizację związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie pęknięć i wiązań krzyżowych nici DNA w celu wyjaśnienia mechanizmów genotoksycznych i ryzyka biologicznego.
- Przesiewanie: Zapewnienie powtarzalnych, ilościowych wyników w celu priorytetyzacji związków i segregacji toksyczności.
- Analityka: Generowanie zestandaryzowanych pomiarów (np. moment ogona Olive, % DNA w ogonie) do porównań między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączenie wyników in vitro z modelami in vivo w celu dopasowania biomarkerów i oceny ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferowanie skalowalnej, kompatybilnej z automatyzacją platformy do powtarzalnych testów genotoksyczności w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w ocenie genotoksyczności.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływy pracy, zmniejsza zużycie odczynników i minimalizuje ręczną manipulację preparatami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz poprawia efektywność kapitałową dzięki wczesnej identyfikacji ryzyka genotoksyczności.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów o korzystnych profilach uszkodzeń DNA.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie kwantyfikacji uszkodzeń DNA i interpretacji testu kometowego.
- Wymaga specjalistycznych kaset do szkiełek, zintegrowanego chłodzenia oraz kompatybilnej infrastruktury do elektroforezy.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania próbek i analizy pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych typów komórek i warunków ekspozycji przy zastosowaniu zwalidowanych kontroli.
- Zależność od rzetelnej analizy obrazu i oceny statystycznej w celu uzyskania wiarygodnych wyników.
