Ocena utleniania substratu energetycznego in vitro z pułapkowaniem ¹⁴CO₂

Stosowanie różnych substratów energetycznych jest zarówno specyficzne dla typu komórki, jak i wskazuje na chorobę. Pomiar zużycia określonych substratów może rzucić światło zarówno na normalną biologię, jak i patologię. Technika nie wymaga specjalistycznego sprzętu i jest łatwa do skalowania.

Jest również łatwiejszy w użyciu niż poprzednio opublikowane metody. Zrozumienie zmian w szybkości utleniania substratów pozwoli na opracowanie interwencji dietetycznych i farmakologicznych w przypadku zaburzeń metabolicznych. Chociaż wykazano to w przypadku tkanki kostnej, technikę tę można łatwo dostosować do badania elastyczności metabolicznej we wszystkich typach komórek, zapewniając zrozumienie zarówno przyczyn, jak i konsekwencji zmian metabolicznych.

Po złożeniu w ofierze szczeniąt w ciągu trzech do pięciu dni po urodzeniu, przenieś je do lodowatego roztworu podwójnego antybiotyku D PBS zawierającego penicylinę streptomycynę. Odsłoń kalwarię, usuwając skórę i tkankę miękką. Zbierz środkowy obszar, przecinając otaczające tkanki od tyłu do przodu w D PBS.

Delikatnie podrap wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię kalwarii za pomocą pęsety, aby pomóc uwolnić komórki po późniejszym trawieniu. Przygotować 2 i 4 miligramy na mililitr roztworów kolagenazy typu dwa w D PBS i przefiltrować każdy roztwór świeżym filtrem 0,22 mikrometra. Najpierw przetrawić oczyszczoną kalwarię dwoma miligramami na mililitr roztworu kolagenazy przez 15 minut, a następnie wyrzucić roztwór do wytrawiania.

Następnie trawić czyste próbki w czterech miligramach na mililitr roztworu kolagenazy trzy razy przez 15 minut za każdym razem. Następnie wyciągnij roztwór wytrawiający i zachowaj go. Przefiltrować roztwór wytrawiający przez sitka komórkowe o średnicy 70 mikrometrów i odwirować filtrat o temperaturze 300 RCF przez pięć minut.

Ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnym pożywce MEM alfa zawierającej 10% FBS i podwójnego roztworu antybiotyku streptomycyny penicyliny. Policz i zasiej komórki na 10-centymetrowej płytce. Hoduj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy dni.

Następnie dysocjuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą 0,25 trypsyny EDTA. Po strawieniu policz i wysiew komórki na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej z kompletną pożywką MEM alfa zawierającą 10% FBS i podwójny roztwór antybiotyku streptomycyny penicyliny. Wysiewać co najmniej cztery studzienki na typ komórki na substrat i co najmniej trzy dodatkowe studzienki dla każdego typu komórek w celu zliczenia przed testem.

Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po usunięciu mięśni i tkanki łącznej od ośmiotygodniowych myszy i zebraniu kości udowych i piszczelowych, odetnij i odrzuć oba końce kości ostrymi nożyczkami. Wypłucz szpik kostny z jednej kości udowej i jednej kości piszczelowej do świeżej 10-centymetrowej szalki Petriego za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 23 zawierającą 15 mililitrów kompletnej pożywki MEM alfa z 10% penicyliną FBS, podwójnym roztworem antybiotyku streptomycyny i 10% pożywką kondycjonowaną CGM 14 12.

Hoduj komórki na szalce Petriego w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po trzech dniach wyrzucić pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki D PBS. Oddziel przyłączone komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą 0,25% trypsyny EDTA przez pięć minut.

Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce BMM. Policz i zasiej komórki na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej zgodnie z procedurą opisaną wcześniej. Hodowla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w pożywce BMM przed rozpoczęciem testów.

Umyj komórki w dodatkowych studzienkach dwukrotnie za pomocą D PBS. Oddziel komórki za pomocą 0,25% trypsyny EDTA. Ponownie zawiesić 20 mikrolitrów strawionych komórek w D PBS.

Za pomocą 20 mikrolitrów roztworu barwnika pomarańczy akrydynowej i jodku propidyny określ liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i zapisz liczbę. Umyć komórki w studzienkach testowych dwukrotnie za pomocą D PBS. Dodaj 500 mikrolitrów gorącej pożywki do każdego dołka testowego w kapturze do hodowli tkankowych wyznaczonym przez RAM.

Po uszczelnieniu płytki parafilmem inkubować komórki w inkubatorze wyznaczonym do pamięci RAM w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 4 godziny. Podczas inkubacji pokrój bibułę filtracyjną na okrągłe kawałki, nieco większe niż obszar wewnątrz nasadki 1,5-mililitrowej mikrorurki wirówkowej i włóż papier ciasno do nasadki. Dodać 200 mikrolitrów jednego 1 molowego kwasu nadchlorowego do każdej probówki i 20 mikrolitrów wodorotlenku sodu do bibuły filtracyjnej umieszczonej wewnątrz nakrętki.

Po inkubacji komórek przenieś 400 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej studzienki do przygotowanych probówek i natychmiast zamknij nakrętki. Pozostaw probówki w stojaku na probówki w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Parallelae podczas inkubacji ustaw fiolkę scyntylacyjną dla każdej probówki i napełnij ją czterema mililitrami płynu scyntylacyjnego.

Przenieś każdy kawałek bibuły filtracyjnej do fiolki scyntylacyjnej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Wykonaj testy wycierania okapu do hodowli tkankowej, łaźni wodnej, lodówki, inkubatora, zlewu, ziemi i dowolnego innego obszaru roboczego pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia pamięci RAM. Chusteczki papierowe należy włożyć do fiolek scyntylacyjnych zawierających płyn scyntylacyjny.

Zmierz aktywność radiacyjną węgla 14 w fiolkach scyntylacyjnych za pomocą licznika scyntylacyjnego i zapisz wyniki odczytu. W razie potrzeby należy odkazić środowisko pracy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa radiologicznego. Rysunek porównuje utlenianie substratu przez pierwotne preosteoblasty kalwarii z BMM.

Po przejściu przez noc komórek pierwotnych i hodowli w kompletnej pożywce MEM alfa, zwykle osiągają one 80 do 90% konfluencji i wykazują charakterystyczną morfologię. Preosteoblasty kalwaryczne są znacznie większe niż BMM. Wyniki utleniania substratu wykazały, że szybkość utleniania każdego substratu jest znacznie wyższa w preosteoblastach kalwaryjnych niż w BMM, co prawdopodobnie wskazuje na wyższą produkcję energii przez fosforylację oksydacyjną w preosteoblastach.

Włożony trzeci papier powinien być nieco większy niż 1.7 mililitrowa nasadka górnej rurki ebin. Metoda ta może być stosowana w połączeniu ze zużyciem tlenu oraz do określenia ogólnego tempa fosforylacji oksydacyjnej i produkcji laktatywnej w komórkach. Protokół ten może być wykorzystany do określenia wykorzystania substratu podczas różnych etapów różnicowania lub ustawień chorobowych.

Dzięki tej wiedzy możemy opracować interwencje w przypadku zaburzeń metabolicznych.