Name: Ocena utleniania substratu energetycznego in vitro z pułapkowaniem 14CO2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę pomiaru utleniania substratów energetycznych in vitro z wykorzystaniem pułapkowania 14CO2. Technika ta pozwala badać elastyczność metaboliczną różnych typów komórek i zaburzenia metaboliczne bez specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była częściowo wspierana przez grant NIH R01 AR060456 (FL). Dziękujemy dr Michaelowi Robinsonowi i Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) za ich hojną pomoc przy liczniku scyntylacyjnym.

Stosowanie materiałów radioaktywnych (RAM) wymaga uprzedniej zgody wyznaczonego komitetu ds. bezpieczeństwa w każdej instytucji. Materiały RAM użyte w tym protokole zostały zatwierdzone przez Environmental Health &amp; Radiation Safety (EHRS) na Uniwersytecie Pensylwanii. Wykorzystanie zwierząt wymaga uprzedniej zgody Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w macierzystej instytucji. Poniższa analiza została zatwierdzona przez IACUC w The Children's Hospital of Philadelphia.
1. Przygotowanie roztworów zapasowych dla substratów znakowanych 14C
<ol>
	<li>Przygotuj 4 mM roztwór zapasu albuminy surowicy bydlęcej (BSA), mieszając 11 g BSA i 33,1 mL buforu fosforanowego Dulbecco (DPBS), a następnie delikatnie wstrząsaj w temperaturze pokojowej przez ok. 3 h, aż BSA całkowicie się rozpuści. Przed użyciem podgrzej roztwór zapasu BSA w kąpieli wodnej o temperaturze 70 °C.</li>
	<li>Wysusz na powietrzu 50 µCi 14C-oleinianu (50 µCi/µmol w etanolu) w fiolce z otwartą pokrywką przez 8 h w wyznaczonym wyciągu do pracy z materiałami promieniotwórczymi (RAM). Dodaj 312,5 µL H2O, a następnie 3,5 mg (11,5 µmol) oleinianu sodu. Wymieszaj dokładnie.</li>
	<li>Podgrzej otrzymany roztwór do 70 °C w kąpieli wodnej. Dodaj 0,9375 mL uprzednio podgrzanego roztworu zapasu BSA, aby uzyskać 10 mM gorący roztwór zapasu oleinianu (zawierający stosunek 1:11,5 14C-oleinianu do oleinianu nieznakowanego). Rozdziel roztwór zapasu na aliquoty i przechowuj w temperaturze -20 °C do długotrwałego użytku.</li>
	<li>Używaj 14C-glukozy i 14C-glutaminy bezpośrednio po rozmrożeniu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki zawierającej substraty znakowane 14C
UWAGA: Aby zapewnić wiarygodne stężenia substratów energetycznych w pożywce, należy stosować pożywki przygotowane specjalnie do tego celu, z dodatkiem świeżych substratów bezpośrednio przed użyciem. W niniejszej procedurze zastosowano specjalnie przygotowaną pożywkę Minimum Essential Medium (MEMα) bez glukozy, pirogronianu, glutaminy, czerwieni fenolowej oraz wodorowęglanu sodu. Należy jednak dobrać optymalną pożywkę dla każdego rodzaju komórek.
<ol>
	<li>Rozpuścić 8,67 g proszku pożywki w 1 L wody oczyszczonej. Dodać 2,2 g wodorowęglanu sodu, aby uzyskać pH 7,4, a następnie przefiltrować roztwór za pomocą filtracji próżniowej przez filtr 0,22 µm.</li>
	<li>Dodać świeże składniki, aby otrzymać kompletną pożywkę (cMEMα) o końcowych stężeniach 5,5 mM glukozy, 2 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Następnie uzupełnić cMEMα o 100 mM L-karnityny i 10 µM HEPES w celu ułatwienia utleniania kwasów tłuszczowych.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem dodać substraty znakowane 14C do świeżo przygotowanej pożywki cMEMα, aby przygotować pożywkę „gorącą”. Aby przygotować gorącą pożywkę z oleinianem, dodać roztwór stokowy gorącego oleinianu o stężeniu 10 mM do cMEMα do uzyskania końcowego stężenia 100 µM oleinianu (rozcieńczenie 1:100, końcowa radioaktywność 0,4 µCi/mL). 
	UWAGA: Roztwór stokowy gorącego oleinianu 10 mM zawierający stosunek oleinianu gorącego do zimnego 1:11,5 (patrz krok 1.3) jest stosowany w celu osiągnięcia fizjologicznego poziomu 100 µM całkowitego oleinianu w pożywce przy jednoczesnym zminimalizowaniu ilości materiału radioaktywnego.</li>
	<li>Przygotować roztwór stokowy nieznakowanego oleinianu 10 mM, dodając 24,36 mg oleinianu sodu do 2 mL H2O w łaźni wodnej w temperaturze 70 °C przez ok. 20 min, aż do całkowitego rozpuszczenia, a następnie szybko wymieszać z 6 mL roztworu stokowego BSA 4 mM uprzednio podgrzanego do 70 °C. Przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 h i przefiltrować przez filtr 0,22 µm. Rozdzielić na aliquoty i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego użytku.</li>
	<li>Aby przygotować gorącą pożywkę z glukozą, dodać glukozę znakowaną 14C do końcowego stężenia 1,333 µM (rozcieńczenie 1:4 125, końcowa radioaktywność 0,4 µCi/mL). Aby przygotować gorącą pożywkę z glutaminą, dodać glutaminę znakowaną 14C do końcowego stężenia 2 µM (rozcieńczenie 1:1 000, końcowa radioaktywność 0,4 µCi/mL).</li>
	<li>Uzupełnić gorącą pożywkę z glukozą i glutaminą roztworem stokowym nieznakowanego oleinianu 10 mM z kroku 2.4, aby uzyskać końcowe stężenie 100 µM oleinianu, analogicznie jak w gorącej pożywce z oleinianem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek
UWAGA: W niniejszym przykładzie wykorzystano preosteoblasty czaszkowe oraz makrofagi szpiku kostnego. Użytkownicy powinni przygotować wybrany typ komórek zgodnie z odpowiednimi protokołami. Należy zoptymalizować stężenie kolagenazy II stosowanej do trawienia w eksperymentach pilotażowych, ponieważ aktywność enzymatyczna może różnić się w zależności od partii.
<ol>
	<li>Izolacja i hodowla przedosteoblastów z czaszki
	<ol>
		<li>Uśmiercić szczenięta w 3–5 dobie po urodzeniu (P3-5) poprzez dekapitację i przenieść je do schłodzonego DPBS zawierającego penicylinę i streptomycynę (P/S).</li>
		<li>Odsłonić kalwarię poprzez usunięcie skóry i tkanek miękkich. Pobrać region środkowy, odcinając otaczające tkanki od tyłu do przodu w DPBS (Rysunek 1A). Delikatnie podrapać wewnętrzne i zewnętrzne powierzchnie kalwarii za pomocą pęsety, aby ułatwić uwalnianie komórek podczas późniejszego trawienia.</li>
		<li>Przygotować roztwory kolagenazy typu II w DPBS o stężeniu 2 mg/mL oraz 4 mg/mL i przefiltrować każdy z nich przez nowy filtr 0,22 µm. Trawić oczyszczoną kalwarię najpierw roztworem kolagenazy 2 mg/mL przez 15 min, a następnie wylać roztwór trawienny. Trawić oczyszczone próbki w roztworze kolagenazy 4 mg/mL trzykrotnie po 15 min za każdym razem, łącząc i zachowując roztwory trawienne.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór trawienny przez sita komórkowe 70 µm i odwirować filtrat przy 300 × g przez 5 min. Resuspendować osad komórkowy w cMEMα (patrz krok 2.2) zawierającym 10% FBS i P/S.</li>
		<li>Policzyć i wysiać komórki w zagęszczeniu 4 × 104 komórek/cm2 na płytkach 10 cm. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 3 dni.</li>
		<li>Dysocjować komórki w 37 °C przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA. Policzyć i wysiać komórki na 24-dołkowe płytki hodowlane w cMEMα zawierającym 10% FBS i P/S w zagęszczeniu 7,5 × 105/cm2. Wysiać co najmniej 4 dołki na typ komórki i podłoże oraz co najmniej trzy dodatkowe dołki dla każdego typu komórek do policzenia komórek przed analizą.</li>
		<li>Hodować komórki w 37 °C przez noc przed przeprowadzeniem analiz utleniania podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja i hodowla BMM 
	UWAGA: Hodowla BMM wymaga czynnika stymulującego kolonie makrofagów (M-CSF), który można nabyć w handlu jako białko rekombinowane. Ekonomiczną alternatywą zastosowaną w tej procedurze jest pożywka warunkowana z linii komórkowej CMG14-12 zmodyfikowanej tak, aby ekspresować M-CSF13.
	<ol>
		<li>Pobrać kości udowe i piszczele od 8-tygodniowych myszy po usunięciu mięśni i tkanek łącznych. Odciąć i usunąć oba końce kości za pomocą ostrych nożyczek.</li>
		<li>Wypłukać szpik kostny z jednej kości udowej i jednej piszczeli do 10-centymetrowej szalki Petriego za pomocą strzykawki z igłą 23 G zawierającej 15 mL cMEMα z 10% FBS, P/S i 10% pożywki warunkowanej CMG14-12 (pożywka BMM). Hodować komórki w szalce Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.</li>
		<li>Po 3 dniach usunąć pożywkę hodowlaną i wypłukać DPBS. Dysocjować przyczepione komórki w 37 °C za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA przez 5 min. Odwirować i resuspendować osad komórkowy w pożywce BMM.</li>
		<li>Policzyć i wysiać komórki na 24-dołkowe płytki hodowlane w zagęszczeniu 7,5 × 105/cm2 w ten sam sposób, jak opisano w punkcie 3.1.6. Hodować w 37 °C przez noc w pożywce BMM przed rozpoczęciem analiz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test utleniania podłoża z pułapką CO2
UWAGA: Dla każdego typu komórek należy określić odpowiednią gęstość wysiewu, aby uzyskać 80-90% konfluencji przed rozpoczęciem testu. Należy pamiętać, że gęstość komórek może wpływać na ich stan metaboliczny.
<ol>
	<li>Przemyj komórki w dodatkowych dołkach dwukrotnie przy użyciu DPBS. Zdysocjuj komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i zmieszaj 20 µL komórek resuspendowanych w DPBS z 20 µL gotowego komercyjnego roztworu barwnika pomarańczowego akrydyny/jodku propidyny (AO/PI). Oznacz liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i zapisz tę liczbę do końcowych obliczeń.</li>
	<li>Przemyj komórki w dołkach analitycznych dwukrotnie przy użyciu DPBS. Do każdego dołka analitycznego dodaj 500 µL gorącej pożywki w wyznaczonej do RAM komorze do hodowli tkankowej. Uszczelnij płytki parafinną i inkubuj komórki w wyznaczonym do RAM inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 h.</li>
	<li>Podczas inkubacji potnij papier filtracyjny na okrągłe kawałki nieco większe niż powierzchnia wewnątrz nakrętki probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i ciasno wsuń papier do nakrętki (Rysunek 1B). Do każdej probówki dodaj 200 µL 1 M kwasu nadchlorowego, a do papieru filtracyjnego umieszczonego w nakrętce dodaj 20 µL wodorotlenku sodu.</li>
	<li>Po inkubacji komórek przenieś 400 µL pożywki hodowlanej z każdego dołka do przygotowanych probówek i natychmiast zamknij nakrętki. Pozostaw probówki w statywie w temperaturze pokojowej przez 1 h.</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotuj fiolkę scyntylacyjną dla każdej probówki i napełnij ją 4 mL płynu scyntylacyjnego. Przenieś każdy kawałek papieru filtracyjnego do fiolki scyntylacyjnej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
	<li>Wykonaj testy wymazowe komory do hodowli tkankowej, łaźni wodnej (użytej do przygotowania 14C-oleanu), lodówki, inkubatora, zlewu, podłoża oraz każdego innego obszaru roboczego pod kątem potencjalnego skażenia RAM. Włóż wymazy papierowe do fiolek scyntylacyjnych zawierających płyn scyntylacyjny.</li>
	<li>Zmierz radioaktywność 14C w fiolkach scyntylacyjnych za pomocą licznika scyntylacyjnego. Zapisz wyniki pomiarów. W razie potrzeby przeprowadź dekontaminację środowiska pracy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa radiacyjnego.</li>
</ol>
5. Analiza danych
UWAGA: Przy założeniu, że każdy substrat ulega pełnemu utlenieniu z wydzieleniem CO2, szybkość utleniania substratu można obliczyć na podstawie radioaktywności uwięzionego CO2.
<ol>
	<li>Oblicz szybkość utleniania substratu, korzystając z równania (1) oraz wartości X, Y i Z podanych w tabeli 1 dla różnych substratów. 
	Szybkość utleniania substratu (µmol/cell/h) = <img alt="Równanie ilustrujące formułę matematyczną ze zmiennymi X, Y, Z i odniesieniami do komórek; obliczenie statyczne." src="/files/ftp_upload/63568/63568eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">   (1)
	<ol>
		<li>Oblicz całkowitą liczbę rozpadów na minutę (DPM) dla każdej studni reakcyjnej. Dla X przyjmij wartość DPM (odczyt z licznika scyntylacyjnego) z 0,4 mL medium reakcyjnego użytego do wychwytywania CO2 z całkowitej objętości 0,5 mL medium reakcyjnego. Zatem całkowita wartość DPM z każdej studni reakcyjnej wynosi X × 1,25.</li>
		<li>Podziel całkowitą wartość DPM przez współczynnik 2 220 000, aby przeliczyć ją na µCi.</li>
		<li>Przelicz radioaktywność w µCi na liczbę cząsteczek znakowanych 14C. Podziel wartość w µCi przez aktywność właściwą (Y) każdego znakowanego substratu. Użyj następujących wartości Y (tabela 1): 14C-glukoza: 300 mCi/mmol; 14C-glutamina: 200 mCi/mmol; 14C-oleinian: 50 mCi/mmol.</li>
		<li>Oblicz całkowitą liczbę utlenionych cząsteczek na podstawie liczby utlenionych cząsteczek znakowanych 14C, mnożąc tę ostatnią przez współczynnik rozcieńczenia izotopu do całkowitej ilości substratu (Z). Użyj następujących wartości Z (tabela 1): glukoza: 4125; glutamina: 1000; oleinian: 12,5.</li>
		<li>Podziel otrzymany wynik przez liczbę komórek (cell#) oraz przez 4 (dla czasu reakcji wynoszącego 4 h), aby wyznaczyć szybkość utleniania substratu na komórkę. Użyj liczby komórek (cell#) wyznaczonej w równoległych studniach na początku analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li>
<li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li>
<li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glucose+fatty-acid+cycle.+Its+role+in+insulin+sensitivity+and+the+metabolic+disturbances+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus.</a> Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).</li>
<li>Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+uptake+by+muscle.+8.+Effects+of+fatty+acids%2C+ketone+bodies+and+pyruvate%2C+and+of+alloxan-diabetes+and+starvation%2C+on+the+uptake+and+metabolic+fate+of+glucose+in+rat+heart+and+diaphragm+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li>
<li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li>
<li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li>
<li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+osteoblast%3A+implications+for+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li>
<li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108(2020).</li>
<li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704(2017).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li>
<li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li>
<li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+glucose%2C+glutamate%2C+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li>
<li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li>
<li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li>
<li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li>
<li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195(2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół zapewnia łatwą w użyciu metodę określania szybkości utleniania głównych substratów energetycznych. Jest to prostsza alternatywa dla innych protokołów, które wykorzystują kolby zawierające centralną studzienkę i zakryte gumowymi korkami 14,15,16. Chociaż przykładowe badanie tutaj jest przeprowadzane z hodowlą komórkową, metodę można łatwo dostosować do eksplantatów tkanek lub homogenatów tkankowych zawierających nienarus...

Fosforylacja oksydacyjna (OXPHOS) u eukariontów to proces, w którym składniki odżywcze są rozkładane wewnątrz mitochondriów w celu uwolnienia energii chemicznej w postaci ATP poprzez zużycie tlenu. Katabolizm różnych substratów wewnątrz mitochondriów poprzez cykl kwasu trikarboksylowego (TCA) generuje bezpośrednio niewiele cząsteczek ATP, ale raczej magazynuje energię poprzez redukcję nośników elektronów dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD+) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD+). Zredukowane nośniki są następnie utleniane przez ETC znajdujące się na wewnętrznej błonie mitochondriów w celu wytworzenia gradientu stężenia protonów w poprzek błony. Protony ostatecznie spływają w dół swojego gradientu z powrotem do macierzy mitochondrialnej przez syntazę ATP, aby wytworzyć ATP. OXPHOS jest najbardziej wydajnym sposobem produkcji ATP z substratów energetycznych i ogólnie preferowanym w środowisku tlenowym. Wcześniej uważano, że glikoliza tlenowa - produkcja mleczanu z glukozy, gdy obecny jest tlen - jest patofizjologiczna, często jest cechą charakterystyczną komórek rakowych. Coraz częściej odkrywa się, że niektóre normalne typy komórek wykorzystują glikolizę tlenową z powodów, które nie zostały jeszcze w pełni rozszyfrowane.
Elastyczność metaboliczna to zdolność komórek lub organizmów do przystosowania się do zmieniającego się zapotrzebowania na energię i dostępnych źródeł paliwa. Na przykład zapotrzebowanie energetyczne mięśni szkieletowych jest zaspokajane głównie przez OXPHOS w stanie ustalonym, ale przez glikolizę beztlenową podczas ćwiczeń o wysokiej intensywności1. Wraz ze wzrostem czasu trwania ćwiczeń, utlenianie glukozy i kwasów tłuszczowych w większym stopniu przyczynia się do ogólnej produkcji energii2. Wykorzystanie substratu nie zależy jednak tylko od dostępności, ponieważ substraty antagonistycznie konkurują ze sobą podczas utleniania. Przede wszystkim wykazano, że utlenianie kwasów tłuszczowych hamuje wykorzystanie glukozy przez mięśnie szkieletowe w zjawisku znanym jako efekt Randle'a3. Efekt odwrotności wykazano w kolejnych badaniach4,5. Ponadto wiele chorób wiąże się ze zmianą preferencji substratów i rozwojem nieelastyczności metabolicznej w komórkach. Na przykład utlenianie kwasów tłuszczowych jest zmniejszone w mięśniach szkieletowych pacjentów z cukrzycą typu II w porównaniu z normalnymi osobami z grupy kontrolnej6. Zmiany metaboliczne w warunkach chorobowych są przedmiotem intensywnych badań, ponieważ mogą przyczyniać się do patogenezy.
Metabolizm energetyczny w typach komórek szkieletowych jest stosunkowo słabo zbadany, ale zyskał na popularności w ostatnich latach7. Wcześniejsze prace wykazały, że glikoliza tlenowa jest dominującym szlakiem energetycznym w osteoblastach kalwarii, podczas gdy utlenianie glukozy w cyklu TCA odgrywa rolę w tworzeniu osteoklastów8,9. Inni dostarczyli dowodów na to, że kwasy tłuszczowe są źródłem energii dla osteoblastów10. Wykazano również, że katabolizm glutaminy wspiera różnicowanie osteoblastów od progenitorów11,12. Jednak nadal brakuje kompleksowego zrozumienia wykorzystania substratów przez różne typy komórek szkieletowych. Ponadto oczekuje się, że zmiany w metabolizmie komórkowym podczas różnicowania komórek lub w odpowiedzi na sygnały patologiczne zmienią wykorzystanie substratu paliwowego. Poniżej opisano łatwy w użyciu protokół oznaczania utleniania substratu in vitro.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m filtry</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVM33RS</td><td>Służy do filtrowania roztworu BSA</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Dysocjacja komórek z płytek do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki Eppendorfa</td><td>PR1MA</td><td>PR MCT17 RB</td><td>Używane do inkubacji reakcji</td></tr><tr><td>Płytki 10 cm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Używane do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>10 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>302995</td><td>Służy do płukania szpiku kostnego z kości długich</td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Atlanta biologiczne</td><td>S11550</td><td>Do przygotowania pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>14C-Glukoza</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042X050UC</td><td>Służy do wytwarzania gorących pożywek</td></tr><tr><td>14C-glutamina</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC451050UC</td><td>Służy do wytwarzania gorących pożywek</td></tr><tr><td>14C-oleate</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC317050UC</td><td>Służy do wytwarzania gorących pożywek</td></tr><tr><td>Igła 23 G</td><td>BD</td><td>305120</td><td>Służy do płukania szpiku z kości długich</td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>Służy do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>70 &mu; m sitka komórkowe</td><td>MIDSCI</td><td>70CELL</td><td>Służy do filtrowania supernatantu podczas trawienia kawarnego</td></tr><tr><td>Barwnik Acridine Orange/Propidium Jodek (AO/PI)</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td>CS2-0106</td><td>Barwie żywe komórki w celu określenia gęstości nasion</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Ablumin</td><td>Proliant Biologicals</td><td>68700</td><td>Używany do koniugacji kwasów tłuszczowych</td></tr><tr><td>Celometr Auto 2000</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td></td><td>Określ liczbę żywotnych komórek</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Fisher</td><td>Legend Micro 21R</td><td>Służy do osadzania komórek</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Dysocjacja komórek od tkanki</td></tr><tr><td>Niestandardowa MEM alfa</td><td>GIBCO</td><td>SKU: ME 18459P1</td><td>Służy do tworzenia niestandardowych gorących mediów</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Służy do rozpuszczania i rozcieńczania odczynników oraz mycia naczyń hodowlanych</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>Pułapki CO2 z wodorotlenkiem sodu</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g7528</td><td>Służy do wytwarzania niestandardowych pożywek</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Pułapki CO2 podczas hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>L-karnityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td>Uzupełniony do utleniania kwasów tłuszczowych</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g3126</td><td>Używany do wytwarzania niestandardowych pożywek</td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Thermo</td><td>A10490</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pecheney Plastikowe opakowanie</td><td>PM998</td><td>Służy do uszczelniania naczyń do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>Zapobiega zanieczyszczeniu w kulturze komórkowej</td></tr><tr><td>Kwas nadchlorowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>Uwalnia CO2 podczas testu metabolicznego</td></tr><tr><td>Pirogronian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p5280</td><td>Służy do wytwarzania niestandardowych mediów</td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td>Określa radioaktywność bibuły filtracyjnej</td></tr><tr><td>Płyn scyntylacyjny</td><td>MP Biomedicals</td><td>882453</td><td>Absorbuj energię emitowaną przez pamięci RAM i emituj ją ponownie w postaci błysków światła</td></tr><tr><td>Fiolka scyntylacyjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td>Pojemniki reakcyjne na płyn scyntylacyjny</td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Bufor równowagi dla podłoża</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58045</td><td>Wychwytuje CO2 podczas testu metaboilc</td></tr><tr><td>Oleinian</td> <td>soduSANTA CRUZ</td><td>SC-215879</td><td>BSA preparat sprzężonych kwasów tłuszczowych Filtracja próżniowa</td></tr><tr><td>1000</td><td>TPP</td><td>99950</td><td>Filtr cMEM&alpha;</td></tr></tbody></table>

ocena utleniania substratu energetycznego in vitro z pułapkowaniem 14co2

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Mitochondria są gospodarzem maszynerii do cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA) i łańcucha transportu elektronów (ETC), które generują adenozynotrójfosforan (ATP) w celu utrzymania homeostazy energetycznej. Glukoza, kwasy tłuszczowe i aminokwasy są głównymi substratami energetycznymi napędzającymi oddychanie mitochondrialne w większości komórek somatycznych. Dowody wskazują, że różne typy komórek mogą mieć wyraźną preferencję dla określonych substratów. Jednak wykorzystanie substratu przez różne komórki w szkielecie nie zostało szczegółowo zbadane. Ponadto, ponieważ metabolizm komórkowy jest dostosowany do zmian fizjologicznych i patofizjologicznych, bezpośrednia ocena zależności od substratu w komórkach szkieletowych może dostarczyć ważnych informacji na temat patogenezy chorób kości.
Poniższy protokół opiera się na zasadzie uwalniania dwutlenku węgla z cząsteczek substratu po fosforylacji oksydacyjnej. Dzięki zastosowaniu substratów zawierających znakowane radioaktywnie atomy węgla (14C), metoda zapewnia czuły i łatwy w użyciu test szybkości utleniania substratu w hodowli komórkowej. Studium przypadku z pierwotnymi preosteoblastami kalwarycznymi w porównaniu z makrofagami pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMM) pokazuje różne wykorzystanie głównych substratów między tymi dwoma typami komórek.

W tym przykładzie metoda wychwytywania CO2 jest wykorzystywana do porównania utleniania substratu przez pierwotne preosteoblasty czaszkowe w stosunku do BMM, które są często stosowane odpowiednio do różnicowania osteoblastów lub osteoklastów in vitro. Po pasażowaniu pierwotnych komórek i ich inkubacji w cMEMα przez noc, zazwyczaj osiągają one 80-90% konfluencji i wykazują charakterystyczną morfologię. Preosteoblasty czaszkowe są zauważalnie większe niż BMM (Rysunek 2). Ka...

Ten protokół opisuje łatwą w użyciu metodę badania utleniania substratu poprzez śledzenie produkcji 14CO2 in vitro.

Ocena utleniania substratu energetycznego in vitro z pułapkowaniem 14CO2

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

Stosowanie różnych substratów energetycznych jest zarówno specyficzne dla typu komórki, jak i wskazuje na chorobę. Pomiar zużycia określonych substratów może rzucić światło zarówno na normalną biologię, jak i patologię. Technika nie wymaga specjalistycznego sprzętu i jest łatwa do skalowania.Jest również łatwiejszy w użyciu niż poprzednio opublikowane metody. Zrozumienie zmian w szybkości utleniania substratów pozwoli na opracowanie interwencji dietetycznych i farmakologicznych w przypadku zaburzeń metabolicznych. Chociaż wykazano to w przypadku tkanki kostnej, technikę tę można łatwo dostosować do badania elastyczności metabolicznej we wszystkich typach komórek, zapewniając zrozumienie zarówno przyczyn, jak i konsekwencji zmian metabolicznych.Po złożeniu w ofierze szczeniąt w ciągu trzech do pięciu dni po urodzeniu, przenieś je do lodowatego roztworu podwójnego antybiotyku D PBS zawierającego penicylinę streptomycynę. Odsłoń kalwarię, usuwając skórę i tkankę miękką. Zbierz środkowy obszar, przecinając otaczające tkanki od tyłu do przodu w D PBS.Delikatnie podrap wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię kalwarii za pomocą pęsety, aby pomóc uwolnić komórki po późniejszym trawieniu. Przy

assessing-energy-substrate-oxidation-in-vitro-with-14co2-trapping

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) zastosowano do wykrywania tlenku azotu z bydlęcych komórek śródbłonka aorty oraz anionorodnika ponadtlenkowego z ludzkich neutrofili, wykorzystując odpowiednio ditiokarbaminian żelaza (II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)2, oraz 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO.

Wykrywanie tlenku azotu i anionoradykału ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z użyciem pułapek spinowych

Ten film demonstruje technikę kwantyfikacji CO2 uwalnianego podczas utleniania substratu przy użyciu 14substratów znakowanych radioizotopem C. Uwolnione 14CO2 jest uwięzione w roztworze alkalicznym i oznaczane ilościowo za pomocą licznika scyntylacyjnego. Utlenianie różnych substratów różni się w zależności od tkanki i odzwierciedla stan patofizjologiczny tkanki.

Test utleniania substratu w hodowanych komórkach: Test in vitro do ilościowego określania utleniania substratu w komórkach poprzez pomiar sygnałów radioaktywnych z uwięzionego CO2

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Celem tego protokołu jest spektrofotometryczne monitorowanie transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną za pomocą zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów i analiza oddziaływań enzymatycznych, które mogą wystąpić z tymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów.

Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12

Ten protokół opisuje kalorespirometrię, bezpośredni i jednoczesny pomiar zarówno rozpraszania ciepła, jak i oddychania, co zapewnia nieinwazyjne podejście do oceny metabolizmu energetycznego. Technika ta służy do oceny udziału ścieżek tlenowych i beztlenowych w wykorzystaniu energii poprzez monitorowanie całkowitego przepływu energii komórkowej.

Kalorespirometria: potężne, nieinwazyjne podejście do badania metabolizmu energii komórkowej

Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest jednoznaczną metodą pomiaru wolnych rodników. Zastosowanie selektywnych sond spinowych pozwala na wykrywanie wolnych rodników w różnych przedziałach komórkowych. Przedstawiamy praktyczną, efektywną metodę pobierania próbek biologicznych, która ułatwia obróbkę, przechowywanie i przenoszenie próbek do pomiarów EPR.

Zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w próbkach biologicznych w temperaturze otoczenia i temperaturze 77 K

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Przedstawiamy protokół selektywnego przepuszczania błony plazmatycznej, umożliwiając ukierunkowane dostarczanie substratów i inhibitorów do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w hodowanych komórkach, pokonując bariery transportowe błony plazmatycznej, które zazwyczaj utrudniają takie analizy. Stosując tę technikę, wykazaliśmy, jak funkcja OXPHOS jest modulowana przez agonistów muskarynowych i antagonistów.

Modulacja ligandu cholinergiczna sprzężenia fosforylacji oksydacyjnej w komórkach neuroblastooma BE(2)-C z cyfrytoninami

Poznaj metodę pomiaru utleniania substratów energetycznych in vitro z wykorzystaniem pułapkowania 14CO2. Technika ta pozwala badać elastyczność metaboliczną różnych typów komórek i zaburzenia metaboliczne bez specjalistycznego sprzętu.

Ocena utleniania substratu energetycznego in vitro z pułapkowaniem ¹⁴CO₂

Przeglądaj więcej filmów