Name: Badanie bezbliznowatej regeneracji tkanek w zarodkach zranionych rogówek piskląt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj metodę zranienia rogówki zarodków kurczaka in ovo w celu badania regeneracji bez bliznowatej. Technika ta pozwala analizować molekularne i komórkowe mechanizmy gojenia, oferując wgląd w procesy leczenia uszkodzeń rogówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant na rozwój artystyczny i naukowy przez Illinois Wesleyan University dla TS i częściowo finansowana przez NIH-R01EY022158 (PL).

Szczepem jaj użytym w tym protokole był White Leghorn, a wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie Illinois Wesleyan.
1. Inkubacja jaj piskląt
<ol>
	<li>Jaja należy przechowywać w temperaturze ~10 °C przez okres do 1 tygodnia po ich złożeniu, aby zatrzymać rozwój. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia rozwoju zarodka pisklęcia, przetrzyj całą skorupkę jajka niestrzępiącymi się chusteczkami (patrz Tabela materiałów) nasączonymi wodą o temperaturze pokojowej w celu usunięcia brudu i zanieczyszczeń.</li>
	<li>Upewnij się, że skorupka jajka jest zdezynfekowana. Przetrzyj całą powierzchnię jajka niestrzępiącymi się chusteczkami zwilżonymi 70% etanolem. Szybko zetrzyj etanol, aby wysuszyć jajo i uniknąć wchłaniania etanolu przez skorupkę jajka do zarodka.</li>
	<li>Ułóż jajka poziomo na tacy. Zaznacz górną część komórki jajowej, aby wskazać oczekiwaną pozycję zarodka. Jaja należy inkubować poziomo, z włączoną funkcją kołysania, w inkubatorze z wilgotnością powietrza o temperaturze 38 °C.</li>
</ol>
2. Oknowiercenie jaj w celu przygotowania do rozbioru błony
<ol>
	<li>Usunąć jaja z inkubatora w trzecim dniu rozwoju zarodkowego (E3). Wysterylizuj wierzch jaj niestrzępiącymi się chusteczkami zwilżonymi 70% etanolem. Wysuszyć etanol z powierzchni skorupki jajka. 
	UWAGA: Aby upewnić się, że rozwój nie został opóźniony podczas procedury okienkowania, usunięto 6-12 jaj, a procedurę szybko przeprowadzono na nich, podczas gdy pozostałe jaja pozostawiono w inkubatorze.</li>
	<li>Umieść jajko poziomo w bezpiecznym uchwycie na jajka (patrz tabela materiałów). Używając ostrego końca nożyczek do preparowania, utwórz mały otwór w górnej części skorupki jajka w pobliżu spiczastego końca jajka. 
	UWAGA: Otwór ten ułatwi usunięcie białka, które jest niezbędne do upuszczenia żółtka i zarodka z wewnętrznej powierzchni skorupki jaja. W przypadku pojemników na jajka stosowano płaskie wypełniacze do jaj z pulpy papierowej, w których jaja są wysyłane.</li>
	<li>Przez otwór (Krok 2.2) wprowadzić igłę podskórną o splocie 18 G. Z igłą wciśniętą w dolną wewnętrzną powierzchnię jaja i skośną stroną igły skierowaną w stronę spiczastego końca jaja (np. z dala od oczekiwanego położenia żółtka i zarodka w pobliżu środka jaja), usuń 2-3 ml białka z jaja kurzego i wyrzuć. 
	UWAGA: Jeśli igła nadrapie zarodek lub związane z nim naczynia krwionośne podczas tego etapu, spowoduje to zasysanie krwi z białkiem. Spowoduje to śmierć zarodka. Co więcej, jeśli żółtko zostanie przypadkowo zaaspirowane wraz z białkiem na tym etapie, zarodek nie będzie zdolny do życia. W obu przypadkach zarodek należy wyrzucić, jeżeli zarodek nie może być natychmiast wykorzystany do innych celów.</li>
	<li>Oczyść powierzchnię skorupki jajka otaczającą otwór niestrzępiącymi się chusteczkami lekko zwilżonymi 70% etanolem i wytrzyj do sucha. Uszczelnij otwór przeznaczony do usuwania białka przezroczystą taśmą.</li>
	<li>Ostrym końcem nożyczek do preparowania wykonaj drugi otwór "okienkowy" w górnej części skorupki jajka w miejscu znakowania (krok 1.3.). Upewnij się, że nożyczki nie sięgają zbyt głęboko w skorupkę jaja, aby uniknąć kontaktu i uszkodzenia zarodka lub układu naczyniowego zarodka, który często będzie umieszczony w jaju bezpośrednio poniżej miejsca drugiego otworu.</li>
	<li>Za pomocą zakrzywionych kleszczyków do tęczówki poszerz otwór "okienka" o średnicy ~2-3 cm i służy jako "okno" dla rozwijającego się zarodka pod skorupą.
	<ol>
		<li>Włóż jeden koniec kleszczy do otworu, trzymając go równolegle do skorupki jajka i ściśle przylegając do niej. Trzymając drugi koniec kleszczyków na zewnątrz skorupki jajka, ostrożnie ściśnij oba końce kleszczy razem, pozwalając im złamać się i usunąć małe kawałki skorupki jajka. Kontynuuj rozbijanie i usuwanie fragmentów skorupek jaj, aż pozostanie 2-3 cm okienko, które bezpośrednio nakłada się na zarodek. 
		UWAGA: Jaja, w których zarodki nie leżą bezpośrednio pod otworem wykonanym w kroku 2.6. Nie wolno ich stosować, ponieważ nadchodzące sekcje membranowe byłyby trudne do wykonania. Nawet przy kołysaniu jaj w poziomie, około 10% jaj nie nadaje się do użytku z powodu złego ułożenia zarodka. Zarodki te mogą być wykorzystywane do innych celów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu ograniczenia skażenia bakteryjnego należy dodać przez otwór okienny (np. do jajka) ~100-200 μL roztworu Ringera (8 g NaCl, 0,37 g KCl i 0,23 g CaCl2,2H 20 na L destylowanegoH20) zawierającego antybiotyki penicylinowe/streptomycynę (50 j./ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny, patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Uszczelnij otwór okienny za pomocą przezroczystej taśmy klejącej. Uszczelnienie jajka należy wykonać wyrównując róg taśmy na dłuższej osi otworu i dociskając taśmę do skorupki w odległości ~1-2 cm od krawędzi otworu.
	<ol>
		<li>Kontynuuj uszczelnianie wokół otworu, aż po jednej stronie pozostanie zwisająca klapka taśmy. Ściśnij dwa kawałki taśmy razem, tworząc kopulasty kształt nad otworem, a następnie dociśnij klapkę zwisającej taśmy do skorupki, aby zakończyć uszczelnianie jajka. 
		UWAGA: Jaja muszą być okienko w oknie E2 lub E3. Jak wynika z doświadczenia, okienkowanie przed E2 powoduje niską żywotność zarodków. Co więcej, w E4 zarodek i błony pozaembrionalne zostają przyczepione do skorupki jaja10, a wszelkie próby okna na E4 lub później często kończą się uszkodzeniem zarodka lub rozerwaniem pozaembrionalnych naczyń krwionośnych, przy czym każde zdarzenie prowadzi do śmierci zarodka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść "okienkowane" jaja w inkubatorze w celu dalszego rozwoju. Upewnij się, że jaja są ułożone poziomo i wyłącz funkcję kołysania inkubatora.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.2.-2.9. dla każdego jajka.</li>
</ol>
3. Mikrodyssekcje błon pozazarodkowych
<ol>
	<li>Wyjąć jajo z okienkiem E5.5 z inkubatora. Odsłoń zarodek, odcinając taśmę od okna wysterylizowanymi nożyczkami preparacyjnymi.</li>
	<li>Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby obserwować zarodek i jego błony pozazarodkowe przez okno. W razie potrzeby użyj nożyczek lub zakrzywionych kleszczyków do tęczówki, aby poszerzyć okienko, aby zarodek był dobrze umieszczony pod oknem, uważając, aby nie uszkodzić unaczynienia zarodka.
	<ol>
		<li>Dodaj dwie krople roztworu Ringera zawierającego antybiotyki penicylinowe/streptomycynę, aby nawodnić zarodek i wysterylizować komórkę jajową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że zarodek jest we właściwym stadium rozwoju (Hamburger Hamilton etap 27, ~E5.5)11,12 i zlokalizuj pozycje błony owodniowo-smówkowej (ACM) i błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM). 
	UWAGA: Na tym etapie zarodek jest otoczony przez ACM, który składa się z błony owodniowej i leżącej nad nią błony kosmówkowej połączonych i częściowo pokrytych wysoce unaczynioną allantois, która rozciąga się z obszaru jelitowego zarodka i łączy się z nakładającą się kosmówką, tworząc CAM11,12. ACM nie jest silnie unaczyniony, co umożliwia wypreparowanie tych błon w celu odsłonięcia zarodka bez uszkadzania naczyń krwionośnych i uszkadzania zarodka.</li>
	<li>Na tym etapie należy wykonać pozazarodkowe wycięcia błony (E5.5). 
	UWAGA: E5.5 to idealny czas na przeprowadzenie pozazarodkowych rozwarstwień błony. Wcześniejsze preparowanie błon (np. w E4) przed utworzeniem CAM zmniejsza dostępność zarodka na późniejszych etapach11. Co więcej, w E5.5 zarodek jest tylko częściowo pokryty przez wysoce unaczyniony CAM, ale w ciągu następnych 1-2 dni CAM szybko otacza i uniemożliwia dalszy dostęp do zarodka11,12. Z tego powodu rozwarstwienie błony w E6 lub później jest trudne, ponieważ wzrasta ryzyko rozerwania naczyń krwionośnych.
	<ol>
		<li>Użyj pary wysterylizowanych cienkich kleszczy, aby delikatnie chwycić ACM i odciągnąć go od zarodka. Następnie użyj wysterylizowanych nożyczek do mikropreparowania, aby wyciąć otwór w ACM bezpośrednio nad kończyną przednią, który rozciąga się od błony pokrywającej kończynę przednią do błony pokrywającej głowę. 
		UWAGA: Ten krok rozluźnia błony kosmówkowe i owodniowe, ułatwiając w ten sposób ich chwytanie i dalsze preparowanie kleszczami w kolejnych krokach. Zobacz Rysunek 1 zawiera pomocny schemat tego, jak membrany są preparowane przez okno skorupki jajka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj dwóch par cienkich, sterylnych kleszczy, aby delikatnie chwycić owodnię w dwóch sąsiednich pozycjach między ACM a CAM (np. obszar między nacięciem wykonanym nad kończyną przednią a najbliższą krawędzią CAM).
	<ol>
		<li>Ostrożnie odsuń każdą parę kleszczy, obie mocno ściskając błonę owodniową, od siebie, przy czym jedna para przesuwa się grzbietowo do zarodka, a druga brzusznie. 
		UWAGA: Ten ruch służy dalszemu rozerwaniu owodni, jednocześnie oddzielając ACM (który jest ciągnięty w kierunku grzbietowym w stosunku do zarodka przez jedną parę kleszczy) i CAM (który jest ciągnięty w kierunku brzusznym w stosunku do zarodka przez drugą parę kleszczy).</li>
		<li>Upewnij się, że błony są oddzielone, gdy CAM nie pokrywa już zarodka, a tętnica i żyła omocznikowa, które emanują z jelita zarodkowego do CAM, są łatwo widoczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj wysterylizowanych cienkich kleszczy, aby wypreparować i usunąć pozostałą błonę owodniową pokrywającą zarodek. Najczęściej obserwuje się, że pozostała owodnia częściowo pokryje ogonową połowę zarodka.
	<ol>
		<li>Za pomocą wysterylizowanych kleszczy chwyć owodnię w pobliżu środkowej części czaszki zarodka i ostrożnie pociągnij owodnię w kierunku ogonowym w stosunku do zarodka w kierunku wcześniej przemieszczonego CAM. Zarodek będzie teraz w pełni odsłonięty, a dalszy wzrost CAM będzie następował głównie z dala od rozwijającego się zarodka. 
		UWAGA: Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z pomocnym schematem pokazującym, jak będzie wyglądał odsłonięty zarodek po rozwarstwieniu błony. Zapoznaj się również z wcześniej opublikowanym raportem11, aby uzyskać pomocne schematy Kroków 3.3.-3.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj kilka kropli roztworu Ringera zawierającego antybiotyki penicylinę/streptomycynę, aby nawodnić zarodek i wysterylizować komórkę jajową.</li>
	<li>Ponownie uszczelnij otwór okienny za pomocą przezroczystej taśmy, zgodnie z opisem w kroku 2.8. Umieść jajo z powrotem w inkubatorze w celu dalszego rozwoju, utrzymując jajo poziomo i utrzymując funkcję kołysania inkubatora w stanie nieaktywnym.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1.-3.8. dla każdego jajka. 
	UWAGA: Opisane powyżej wycięcia błony pozaembrionalnej w E5.5 umożliwią dostęp do zarodka przez E7, czyli wtedy, gdy można przeprowadzić zranienie8,9. W E8 ciągły wzrost tkanki CAM zaczyna pokrywać obszar czaszki zarodka, uniemożliwiając w ten sposób dalszy dostęp do rogówki. Jeśli ktoś chce przeprowadzić zranienie w starszych rogówkach E8-E9, możliwe jest przestawienie rosnącego CAM brzusznie w stosunku do zarodka (Krok 3.10.). Jeśli ktoś chce zranić się na E7, Krok 3.10. nie jest konieczne do wykonania i można przejść do Kroku 4, zranienia rogówki.</li>
	<li>Usunąć jajo E7 z inkubatora, którego błony pozazarodkowe zostały wcześniej wycięte w E5.5 (kroki 3.1.-3.8). Chwyć wysterylizowanymi kleszczami wszystkie dostępne tkanki błony owodniowej połączone z CAM i delikatnie odciągnij błonę owodniową od obszaru czaszki zarodka w kierunku brzusznym w stosunku do zarodka. 
	UWAGA: Ponieważ błona owodniowa przemieszczana z dala od zarodka jest zrośnięta z CAM, rosnący i silnie unaczyniony CAM będzie podążał za kleszczami chwytającymi owodni i odsunie się od obszaru czaszki. Powtarzaj ten krok codziennie, aby stale przemieszczać CAM z dala od zarodka, aż zarodek osiągnie pożądany wiek do zranienia.</li>
</ol>
4. Ranie rogówki
<ol>
	<li>Pobrać komórkę jajową z inkubatora do zranienia w pożądanym wieku embrionalnym, E7-E9. Odsłoń zarodek, odcinając taśmę od okna wysterylizowanymi nożyczkami preparacyjnymi. Dodaj kilka kropli roztworu Ringera zawierającego antybiotyki penicylinę/streptomycynę, aby nawodnić zarodek i wysterylizować komórkę jajową.</li>
	<li>Użyj noża do mikropreparacji, aby wykonać nacięcie, które rozciąga się na długość rogówki prawego oka (ze względu na to, jak zarodek składa się w jaju, lewe oko nie jest dostępne, ale może służyć jako niezraniona kontrola), która jest równoległa i zgodna ze szczeliną naczyniówki (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Pierwsze cięcie przejdzie przez nabłonek rogówki.
	<ol>
		<li>Użyj noża do mikropreparacji, aby ponownie zranić rogówkę w tym samym miejscu, co pierwsze nacięcie 2 razy więcej (np. w sumie trzy cięcia, przy czym cięcie 2 i cięcie 3 następuje w tej samej pozycji rogówki, co cięcie 1)11. Druga rana szarpana przejdzie przez błonę podstawną, a trzecia przeniknie do zrębu przedniego. 
		UWAGA: Jeśli zarodek osiadł pod wypreparowanym CAM, można użyć wysterylizowanych zakrzywionych kleszczy tęczówkowych, aby ostrożnie wysunąć głowę spod CAM. Umieść zakrzywione kleszczyki tęczówki pod głową, dotykając lewej strony głowy. Przyciągnij całą głowę na zamkniętych zakrzywionych kleszczach tęczówki i delikatnie podnieś głowę wokół i nad CAM. Aby pomóc w osiągnięciu żywotności, użyj podobnej techniki z zakrzywionymi kleszczami tęczówki, aby schować zarodek z powrotem pod CAM po operacji, aby promować prawidłowy wzrost CAM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 3-4 krople roztworu Ringera zawierającego antybiotyki penicylinowe/streptomycynowe, aby nawodnić zarodek i wysterylizować komórkę jajową.</li>
	<li>Ponownie uszczelnij otwór okienny przezroczystą taśmą i wróć do inkubatora, pozostawiając jajo poziomo. Pozwól zarodkowi się rozwinąć, a rana rogówki zagoiła się przez pożądany okres (np. 0,5-11 dni), a następnie humanitarnie poddaj zarodek eutanazji przez dekapitację.</li>
	<li>Użyj zakrzywionych kleszczyków do tęczówki, aby pobrać oko z uśpionego zarodka unoszącego się na szalce Petriego z roztworem soli fizjologicznej Ringera, delikatnie chwytając oko po jego tylnej stronie, gdzie spotykają się oko i tkanka twarzy, i ostrożnie odsuwając całe oko i uwalniając je od tkanki twarzy.
	<ol>
		<li>Za pomocą cienkich kleszczyków zrób mały otwór (3-5 cm) w tylnej części całego oka i utrwal całe oko w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez noc z lekkim mieszaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wilson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+blindness%3A+a+global+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Corneal blindness: a global perspective.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).</li>
<li>Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+cornea+as+a+model+of+wound+healing+and+neuronal+re-innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation.</a> Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).</li>
<li>Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+sutures+and+dendritic+polymer+adhesives+for+corneal+laceration+repair+in+an+in+vivo+chicken+model%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model.</a> Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).</li>
<li>Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+paradigm+for+corneal+wound+healing+research%3A+the+white+leghorn+chicken+%28Gallus+gallus+domesticus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus).</a> Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).</li>
<li>Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+TGF-%CE%B2+isoforms+and+signaling+intermediates+in+corneal+fibrotic+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).</li>
<li>Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounded+embryonic+corneas+exhibit+nonfibrotic+regeneration+and+complete+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).</li>
<li>Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+normal+collagen+architecture+in+embryonic+wounded+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13815(2020).</li>
<li>Luo, J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+for+gene+transfer+into+older+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).</li>
<li>Spurlin, J., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+increase+accessibility+to+late-stage+chick+embryos+for+in+ovo+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations.</a> Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+pressure+dependent+and+independent+growth+phases+of+the+embryonic+chick+eye+and+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).</li>
<li>Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+wound+healing+in+tenascin+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Corneal wound healing in tenascin knockout mouse.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).</li>
<li>Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+enhancement+of+corneal+epithelial+wound+healing+of+rabbits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo.</a> Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).</li>
<li>Sumioka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+cornea+wound+healing+in+a+tenascin+C-deficient+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model.</a> Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).</li>
<li>Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+tenascin+and+cellular+fibronectin+in+the+rabbit+cornea+after+anterior+keratectomy.+Immunohistochemical+study+of+wound+healing+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).</li>
<li>Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens-derived+Semaphorin3A+regulates+sensory+innervation+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea.</a> Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).</li>
<li>Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+corneal+innervation%3A+interactions+between+nerves+and+specialized+apical+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).</li>
<li>Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+sulfated+glycosaminoglycans+and+their+effects+on+trigeminal+nerve+growth+cone+behavior+in+vitro%3A+roles+for+ECM+in+cornea+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).</li>
<li>Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+and+posttranslational+modification+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+isotype+during+chick+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).</li>
<li>Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+generation+microscopy+for+quantitative+analysis+of+collagen+fibrillar+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure.</a> Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).</li>
<li>Waldvogel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bird%27s+eye+view%5BTitle%5D)+AND+%22American+Scientist%22%5BJournal%5D)">The bird's eye view.</a> American Scientist. 78, 342-353 (1990).</li>
<li>Martin, P., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallels+between+tissue+repair+and+embryo+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis.</a> Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).</li>
<li>Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+wound+healing+response%3A+cytokine-mediated+interaction+of+the+epithelium%2C+stroma%2C+and+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych w odniesieniu do informacji przedstawionych w niniejszym manuskrypcie.

Pisklę jest idealnym systemem modelowym do badania gojenia się ran rogówki płodu, bez blizn. W przeciwieństwie do ssaków, pisklę jest łatwo dostępne przez cały okres rozwoju, stosując strategie in ovo8 lub ex ovo 24. Embrionalna rogówka pisklęcia jest znacznie większa niż rogówki gryzoni, przy czym prawie 50% objętości czaszki jest przeznaczone na oko25, co czyni ją wysoce podatną na manipulacje fizyczne, takie jak zranienia. Co wię...

Rogówka jest przezroczystą, najbardziej zewnętrzną tkanką oka, która przepuszcza i załamuje światło sprzyjające ostrości widzenia. W dorosłej rogówce uszkodzenie lub zakażenie zrębu rogówki prowadzi do szybkiej i silnej reakcji gojenia się ran charakteryzującej się proliferacją keratocytów, zwłóknieniem, zwiększonym stanem zapalnym prowadzącym do apoptozy wywołanej cytokinami, wytwarzaniem miofibroblastów naprawczych i ogólną przebudową macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)1,2. Po urazie taka naprawa tkanki rogówki powoduje powstanie nieprzezroczystej tkanki bliznowatej, która zmniejsza przezroczystość rogówki i blokuje przepływ światła, zniekształcając w ten sposób widzenie, a w najcięższych przypadkach prowadząc do ślepoty rogówki3. W związku z tym istnieje wyraźna potrzeba opracowania wiarygodnych modeli zwierzęcych w celu rozwiązania problemów związanych ze złożonością gojenia się ran oraz zidentyfikowania czynników komórkowych i molekularnych odpowiedzialnych za zamykanie ran i regenerację tkanek.
Do tej pory większość badań nad gojeniem się ran rogówki wykorzystywała post-natal 4 lub dorosłe modele zwierzęce1,2,5,6,7. Chociaż badania te doprowadziły do znacznego postępu w zrozumieniu reakcji na gojenie się ran rogówki i mechanizmów leżących u podstaw powstawania blizn, uszkodzone tkanki rogówki w tych modelach gojenia nie są w pełni zregenerowane, co ogranicza ich użyteczność w identyfikacji czynników molekularnych i mechanizmów komórkowych odpowiedzialnych za pełne przywrócenie morfologii i struktury rogówki po urazie. W przeciwieństwie do tego, rany płodu wygenerowane nożem w embrionalnej rogówce kurcząt mają wewnętrzną zdolność do pełnego gojenia się w sposób bezbliznowy8. W szczególności embrionalna rogówka pisklęcia wykazuje niezwłóknieniową regenerację z pełną rekapitulacją struktury macierzy zewnątrzkomórkowej i wzorców unerwienia8,9.
Obecny protokół opisuje sekwencję kroków związanych z uszkodzeniem rogówki embrionalnego pisklęcia in ovo. Po pierwsze, jaja są umieszczane w oknie we wczesnym wieku embrionalnym, aby ułatwić dostęp do zarodka. Po drugie, przeprowadza się serię fizycznych manipulacji błon pozaembrionalnych in ovo, aby zapewnić utrzymanie dostępu do oka przez późniejsze etapy rozwoju, odpowiadające momentowi, w którym tworzą się trzy warstwy komórkowe rogówki i pożądane jest zranienie. Po trzecie, liniowe centralne nacięcia rogówki przenikające przez nabłonek rogówki i do zrębu przedniego wykonuje się za pomocą noża mikrochirurgicznego. Proces regeneracji lub w pełni odbudowane rogówki mogą być analizowane pod kątem potencjału regeneracyjnego przy użyciu różnych technik komórkowych i molekularnych po zabiegu zranienia.

<table><tbody><tr><td>Igła podskórna 18 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5D</td><td></td></tr><tr><td>30-stopniowy nóż do mikropreparacji</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td> <td>Sondy molekularne</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Przeciwciała</td> <td>wtórne znakowane fluoremSondy molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2-H20)</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Tacki na jajka kurze</td><td>GQF</td><td>O246</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne, z cienką końcówką, ząbkowane</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne, ostra końcówka</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Irys 1 x 2 Tkanka zębowa Kleszcze, w pełni zakrzywione</td><td>VWR</td><td>100494-908</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji</td><td></td> Kimwipes Sigma Z188956 <td>VWR 470315-228</td><td></td></tr><tr><td>Mysia antyfibronektyna (IgG1)</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>B3/D6</td><td></td></tr><tr><td>Mysia antylamina (IgG1)</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>3H11</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Specyficzna dla neuronów &beta;-tubulina dla myszy (Tuj1, IgG2a)</td><td>Biolegend</td><td>801213</td><td></td></tr><tr><td>Mysia anty-tenascyna (IgG1)</td><td>Badania rozwojowe Bank hybrydoma</td><td>M1-B4</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Sportsman 1502 inkubator do jaj</td><td>GQF</td><td>1502</td><td></td></tr><tr><td>Opakowanie ręczne do rozdzierania (szerokość 1,88 cala)</td><td>Szkocka</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie bezbliznowatej regeneracji tkanek w zarodkach zranionych rogówek piskląt

Investigating Scarless Tissue Regeneration in Embryonic Wounded Chick Corneas

Embrionalne rany rogówki piskląt wykazują niezwykłą zdolność do pełnej i szybkiej regeneracji, podczas gdy dorosłe uszkodzone rogówki doświadczają utraty przezroczystości z powodu zwłóknienia blizn. Integralność tkankowa uszkodzonej rogówki embrionalnej jest samoistnie przywracana bez wykrywalnego tworzenia się blizn. Ze względu na swoją dostępność i łatwość manipulacji, zarodek pisklęcia jest idealnym modelem do badania gojenia ran rogówki bez blizn. Protokół ten pokazuje różne etapy związane z ranieniem rogówki embrionalnego pisklęcia in ovo. Po pierwsze, jaja są otwierane we wczesnym wieku embrionalnym, aby uzyskać dostęp do oka. Po drugie, przeprowadza się szereg fizycznych manipulacji błon pozaembrionalnych in ovo, aby zapewnić utrzymanie dostępu do oka przez późniejsze etapy rozwoju, odpowiadające okresowi formowania się trzech warstw komórkowych rogówki. Po trzecie, liniowe rany rogówki, które przenikają do zewnętrznej warstwy nabłonka i przedniego zrębu, wykonuje się za pomocą noża mikrochirurgicznego. Proces regeneracji lub w pełni odbudowane rogówki mogą być analizowane pod kątem potencjału regeneracyjnego przy użyciu różnych technik komórkowych i molekularnych po zabiegu zranienia. Dotychczasowe badania z wykorzystaniem tego modelu wykazały, że zranione rogówki embrionalne wykazują aktywację różnicowania keratocytów, przechodzą skoordynowaną przebudowę białek ECM do ich natywnej trójwymiarowej makrostruktury i zostają odpowiednio unerwione przez nerwy czuciowe rogówki. W przyszłości potencjalny wpływ czynników endogennych lub egzogennych na proces regeneracji może być analizowany w leczeniu rogówek za pomocą technik biologii rozwojowej, takich jak przeszczep tkanki, elektroporacja, infekcja retrowirusowa czy implantacja koralików. Obecna strategia identyfikuje pisklę embrionalne jako kluczowy paradygmat eksperymentalny dla wyjaśnienia czynników molekularnych i komórkowych koordynujących gojenie się ran rogówki bez blizn.

Po wcześniejszej sekcji ACM i CAM w stadium E5.5 w celu odsłonięcia regionu czaszkowego rozwijającego się embrionu, wykonano serię nacięć obejmujących centralną część rogówki w stadium E7 in ovo (Rysunek 1). Idealna rana do badania regeneracji rogówki powstaje po trzech nacięciach, z których każde wykonano w tym samym miejscu rogówki. Pierwsze nacięcie przechodzi przez nabłonek rogówki, natomiast drugie i trzecie nacięcie penetrują odpowiednio podścielającą go błonę podstawną oraz p...

Obecny protokół pokazuje różne etapy związane z uszkodzeniem rogówki embrionalnego pisklęcia in ovo. Regenerujące się lub w pełni odbudowane rogówki mogą być analizowane pod kątem potencjału regeneracyjnego przy użyciu różnych technik komórkowych i molekularnych po zabiegu zranienia.

Badanie bezbliznowatej regeneracji tkanek w zarodkach zranionych rogówek piskląt

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of ...

Uszkodzenie zrębu rogówki osoby dorosłej prowadzi do szybkiego gojenia się ran, które pogarsza wzrok z powodu tworzenia się nieprzezroczystej tkanki bliznowatej. Protokół ten generuje rany w zarodkowych rogówkach piskląt, które w przeciwieństwie do dorosłych mogą goić się bez blizny. Biorąc pod uwagę wewnętrzną zdolność uszkodzonej rogówki embrionalnej do całkowitego podsumowania natywnej struktury rogówki bez wykrywalnych blizn, pisklę zarodkowe służy ważnemu modelowi zwierzęcemu do wyjaśnienia czynników molekularnych i komórkowych dla gojenia się ran rogówki bez blizn.Najtrudniejszym aspektem tej techniki jest wygenerowanie spójnej rany, która penetruje zarówno najbardziej zewnętrzny nabłonek, jak i głębsze zrąb rogówki. W miarę uczenia się, pomocne może być obejrzenie uszkodzonych rogówek w przekroju poprzecznym, aby można było ocenić głębokość wniknięcia rany w zrąb rogówki. Na początek ułóż jaja poziomo na tacy i zaznacz je na górze jajka, aby wskazać oczekiwaną pozycję zarodka.Wysiaduj te jaja w inkubatorze nawilżanym o temperaturze 38 stopni Celsjusza z aktywną funkcją kołysania. Wyjąć komórkę jajową z inkubatora w trzecim dniu rozwoju zarodka i umieścić ją poziomo w bezpiecznym uchwycie na jaja. Zrób mały otwór w górnej części skorupki jajka w pobliżu spiczastego końca jajka za pomocą ostrego końca nożyczek do preparowania.Włóż przez otwór igłę podskórną ze skosem w rozmiarze 18. Z igłą wciśniętą w dno wewnętrznej powierzchni jaja i skośną stroną igły skierowaną w stronę spiczastego końca jajka, usuń od dwóch do trzech mililitrów albuminy z jaja kurzego i wyrzuć. Oczyść powierzchnię skorupki jajka otaczającą otwór niestrzępiącymi się chusteczkami, lekko zwilżonymi 70% etanolem i wytrzyj do sucha.Uszczelnij otwór przeznaczony do usuwania albuminy przezroczystą taśmą. Ostrym końcem nożyczek do preparowania zrób drugi otwór w górnej części skorupki jajka. Upewnij się, że nożyczki nie sięgają zbyt głęboko w skorupkę jaja, aby uniknąć kontaktu i uszkodzenia zarodka lub układu naczyniowego zarodka umieszczonego bezpośrednio pod bokiem drugiego otworu.Za pomocą zakrzywionych kleszczy poszerz otwór okienny tak, aby miał średnicę około dwóch do trzech centymetrów, aby odsłonić i uzyskać dostęp do rozwijającego się zarodka pod skorupą. Teraz włóż jeden koniec kleszczy do otworu, trzymając go równolegle do skorupki jajka i ściśle przylegając do niej. Trzymając drugi koniec kleszczyków na zewnątrz skorupki jajka, ostrożnie ściśnij oba końce kleszczy razem, pozwalając im złamać się i usunąć małe kawałki skorupki jajka.Kontynuuj rozbijanie i usuwanie fragmentów skorupek jaj, aż pozostanie dwu- lub trzycentymetrowe okno, które bezpośrednio nakłada się na zarodek. Aby ograniczyć zanieczyszczenie bakteryjne, dodaj od 100 do 200 mikrolitrów roztworu Ringera zawierającego 50 jednostek na mililitr penicyliny i 50 mikrogramów na mililitr streptomycyny przez otwór okienny. Uszczelnij otwór okienny za pomocą przezroczystej taśmy klejącej.Wykonaj to uszczelnianie jajek, wyrównując róg taśmy na długiej osi otworu i dociskając taśmę do skorupki w odległości od jednego do dwóch centymetrów od krawędzi otworu. Kontynuuj uszczelnianie wokół otworu, aż po jednej stronie pozostanie zwisająca klapka taśmy. Ściśnij dwa kawałki taśmy razem, tworząc kopulasty kształt nad otworem i dociśnij klapkę zwisającej taśmy do skorupki, aby zakończyć uszczelnianie jajka.Umieść jaja w oknach z okienkami w inkubatorze w celu dalszego rozwoju. Upewnij się, że jaja są ustawione poziomo i wyłącz funkcję kołysania inkubatora. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że zarodek jest we właściwym stadium rozwoju i zlokalizować pozycje błony owodniowej i błony omoczniowo-omoczniowej.Następnie za pomocą wysterylizowanych nożyczek do mikropreparowania wyciąć otwór w błonie owodniowo-kosmówkowej bezpośrednio nad kończyną przednią, która rozciąga się od błony, nakładając kończynę przednią na błonę przylegającą do głowy. Użyj dwóch par cienkich sterylnych kleszczyków i delikatnie chwyć owodnię w dwóch sąsiednich pozycjach między błoną owodniową ACM a błoną kosmówkowo-omoczniową. Ostrożnie odsuń każdą parę kleszczy, obie mocno chwytające błonę owodniową, od siebie, przy czym jedna para porusza się grzbietowo do zarodka, a druga brzusznie.Użyj wysterylizowanych cienkich kleszczy, aby wypreparować i usunąć pozostałą błonę owodniową pokrywającą zarodek. Za pomocą wysterylizowanych kleszczy chwyć owodnię w pobliżu środkowej części czaszki zarodka i ostrożnie pociągnij owodnię w kierunku rozpieszczania w stosunku do zarodka w kierunku wcześniej przemieszczonej błony kosmówkowo-omoczniowej. Ponownie uszczelnij otwór w okienku przezroczystą taśmą, jak opisano w manuskrypcie i umieść jajo z powrotem w inkubatorze w celu dalszego rozwoju.Dodatkowe błony embrionalne mogą wymagać zmiany położenia, aby zapewnić dostęp do prawego oka. Jeśli prawe oko nie jest dostępne do zranienia ze względu na położenie zarodka w jaju, może służyć jako niezraniona kontrola. Użyj noża do mikropreparacji, aby wykonać nacięcie obejmujące długość rogówki prawego oka, która jest równoległa i w jednej linii z tkanką naczyniówki.Za pomocą mikronoża preparacyjnego ponownie zranić rogówkę w tym samym miejscu, w którym nastąpiło pierwsze nacięcie, dwa razy więcej w taki sposób, aby przecięcie było dwa i trzy, a następnie nastąpiło w tej samej pozycji w rogówce, co przecięcie pierwsze. Aby pomóc w żywotności, użyj zakrzywionych kleszczyków tęczówki, aby schować zarodek z powrotem pod błoną kosmówkowo-omoczniową po operacji, aby promować prawidłowy wzrost błony kosmówkowo-omoczniowej. Następnie dodaj trzy do czterech kropli roztworu dzwonka zawierającego antybiotyki, aby nawodnić zarodek i wysterylizować jajo.Ponownie uszczelnij otwór okienny przezroczystą taśmą i wróć do inkubatora, pozostawiając jajo poziomo. Pozwól zarodkowi się rozwinąć, a rana rogówki zagoiła się przez pożądany okres. Po inkubacji poddaj zarodek eutanazji i użyj zakrzywionych kleszczyków do tęczówki, aby pobrać oko na szalce Petriego z roztworem soli fizjologicznej Ringera, delikatnie chwytając oko po jego tylnej stronie, gdzie spotykają się oko i tkanka twarzy, i ostrożnie odsuwając całe oko i uwalniając je od tkanki twarzy.Użyj cienkich kleszczy, aby zrobić mały otwór o długości od trzech do pięciu centymetrów w tylnej części całego oka i przymocuj całe oko w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z łagodnym mieszaniem. Aby uzyskać idealną ranę, ważne jest, aby użyć ostrego noża do mikropreparowania i wywrzeć odpowiedni nacisk podczas rany szarpanej. Zastosowanie zbyt małego nacisku spowoduje płytką ranę, która rozrywa nabłonek rogówki, nie penetrując wystarczająco przedniego zrębu.Zbyt duży nacisk powoduje, że rana w pełni penetruje całe zrąb i wystawia ciecz wodnistą na działanie środowiska zewnętrznego. Wykonanie odpowiednich nacięć szarpanych daje idealną ranę, która początkowo powiększa się od zera do trzech dni po zranieniu. Następnie następuje ponowna epitelializacja i tworzenie nowej tkanki, aby ostatecznie zamknąć ranę w sposób wolny od blizn przez 11 dni po zranieniu.Stwierdzono, że czasoprzestrzenna lokalizacja białek macierzy zewnątrzkomórkowej, fibronektyny i tenascyny w gojącej się ranie jest podwyższona w punktach czasowych odpowiadających reepitelializacji rogówki, co sugeruje ich udział w zamykaniu rany, migracji komórek nabłonka i przeżyciu. Cała immunohistochemia gór wykazała, że nerwy, które bezpośrednio przeciwstawiały się uszkodzonej centralnej rogówce, są tymczasowo hamowane przez gojącą się tkankę rogówki. Pomimo wcześniejszego zahamowania, nerwy rogówki ostatecznie unerwiają w pełni zagojoną tkankę rogówki 11 dni po zranieniu do podobnych poziomów gęstości i w podobny sposób do stadium dopasowanego nieuszkodzonego kontrolnego dnia 18.Jak wykazano w obrazowaniu harmonicznym drugiej generacji, wiązki włókien kolagenowych na różnych głębokościach centralnej rany rogówki są ułożone ortogonalnie, dopasowując się do natywnej makrostruktury nieuszkodzonej centralnej tkanki rogówki. W połączeniu z klasycznymi podejściami biologii rozwojowej, takimi jak przeszczep tkanek i implantacja koralików, a także nowoczesnymi podejściami do manipulacji genami, takimi jak infekcje retrowirusowe i elektroporacja DNA, ten model zwierzęcy może ujawnić czynniki molekularne i mechanizmy komórkowe niezbędne do promowania gojenia się ran rogówki bez blizn. Określenie kluczowych czynników molekularnych w białkach macierzy, które regulują gojenie się ran płodu bez blizn, utoruje drogę do terapii, które sprzyjają bardziej regenerującemu procesowi gojenia z mniejszą ilością blizn i lepszą rekapitulacją normalnej architektury tkanki.

investigating-scarless-tissue-regeneration-embryonic-wounded-chick

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiamy technikę wytwarzania mikrokieszeni w membranach elektroprzędzonych, w których można badać zachowanie komórek. W szczególności opisujemy połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu produkcji urządzeń z biomateriału rogówki PLGA (poli(laktyd-ko-glikolid)) wyposażonych w mikrocechy.

Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

Opisane tutaj jest ustanowienie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów reakcji na uszkodzenia tkanek nabłonkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku.

Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku

W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.

Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Ten protokół opisuje metodę polegającą na otarciu powierzchni oka myszy i śledzeniu procesu gojenia się ran. Protokół wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka powierzchniowego oka u znieczulonych myszy.

Otarcie nabłonka rogówki z zadziorem ocznym jako model gojenia się ran rogówki

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Tutaj opisany jest protokół tworzenia centralnej rany po otarciu nabłonka rogówki u myszy za pomocą trepanacji i kija golfowego. Ten model gojenia się ran rogówki jest wysoce powtarzalny i jest obecnie wykorzystywany do oceny upośledzonego gojenia się ran rogówki w kontekście chorób.

Model ścierania nabłonka do badania gojenia się ran rogówki

Ten artykuł opisuje nowy model zwierzęcy opracowany do badania anatomii i histologii rogówki oraz procesów jej gojenia. Ten nowy model zwierzęcy wykorzystuje myszoskoczka mongolskiego, który ma rogówkę z wieloma podobieństwami do rogówki ludzkiej.

Myszoskoczki mongolskie jako zwierzęcy model gojenia się ran

Stripping Only Descemeta to eksperymentalna procedura, w której pacjenci z centralnym gutem rogówki wynikającym z dystrofii śródbłonka Fuchsa mają usuniętą błonę Descemeta na potrzeby komórek obwodowych w celu regeneracji warstwy śródbłonka. Przedstawiono nowatorską metodologię symulującą DSO w dystroficznych rogówkach ludzkich ex vivo z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez eFGF1 (NM141).

Model hodowli ludzkiego narządu rogówki z usuwaniem Descemeta tylko z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez zmodyfikowany czynnik wzrostu fibroblastów 1

Tutaj proponujemy trzy różne metody uszkadzania włókien czuciowych unerwiających rogówkę. Metody te ułatwiają badanie regeneracji aksonów u myszy. Te trzy metody, które można dostosować do innych modeli zwierzęcych, są idealne do badania fizjologii i regeneracji unerwienia rogówki.

Trzy strategie wywoływania neurotroficznego zapalenia rogówki i regeneracji nerwów w rogówce myszy

Hodowla narządów ex vivo rogówki świń i gojenie ran nabłonkowych dostarczają ekonomicznego, etycznego, powtarzalnego i ilościowego sposobu testowania toksyczności ocznej chemikaliów. Pomagają również w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw regulacji nabłonka i naprawy tkanek oraz w ocenie terapii stosowanych w leczeniu keratopatii cukrzycowej i opóźnionego gojenia się ran.

Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

Przedstawiono protokół powtarzalny do przygotowania, wzbogacania i zastosowania in situ żelu żelatynowo-ryboflawinowego krzyżowalnego światłem niebieskim do naprawy ran stromalnych rogówki u królików, w tym kroki proceduralne dotyczące postępowania chirurgicznego, częściowej tarzoraphii i opieki pooperacyjnej.

Produkcja i chirurgiczne zastosowanie wzbogaconych żeli żelatynowych przekształconych światłem i riboflawiny do naprawy ran rogówki u królików

Poznaj metodę zranienia rogówki zarodków kurczaka in ovo w celu badania regeneracji bez bliznowatej. Technika ta pozwala analizować molekularne i komórkowe mechanizmy gojenia, oferując wgląd w procesy leczenia uszkodzeń rogówki.

Badanie bezbliznowatej regeneracji tkanek w zarodkach zranionych rogówek piskląt

Przeglądaj więcej filmów