Name: Bezpłomieniowa metoda sterylizacji kilofów, szpatułek i skalpeli C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Poznaj bezpłomieniową metodę sterylizacji narzędzi do badań z C. elegans przy użyciu mikro-palnika. Technika ta zwiększa bezpieczeństwo laboratoryjne i eliminuje ryzyko związane z otwartym płomieniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Suzanne Howard i Justinowi Finne. Praca ta została sfinansowana przez Wydział Neuronauki Wellesley College. Robaki N2 zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Opłaty za publikację tego artykułu zostały pokryte przez Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fund.

1. Przygotuj mikro-spalarnię.
<ol>
	<li>Przymocuj prowadnicę akcesoriów uchwytu pętli do mikrospalarni, przypinając ją do lufy zewnętrznej.</li>
	<li>Podłącz mikrospalarkę do standardowego gniazdka elektrycznego 120 V lub 230 V, w zależności od potrzeb. 
	UWAGA: Można to zrobić na blacie stołowym lub w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Ustaw mikrospalarkę na wysokie ustawienie i pozwól jej się rozgrzać przez 10-20 minut, w zależności od instrukcji producenta, aby osiągnąć optymalną temperaturę 800-825 oC. 
	UWAGA: W przypadku pozostawienia spalarni włączonej przez okres dłuższy niż 3 godziny, niższe ustawienie temperatury (500 oC) może być używane jako ustawienie czuwania. Zgodnie z instrukcjami obsługi producentów wydłuża to żywotność sprzętu.</li>
</ol>
2. Wysterylizuj kilof, szpatułkę lub skalpel
<ol>
	<li>Włóż instrument do cylindrycznego obszaru sterylizacji bez dotykania boków, przesuwając wzdłuż prowadnicy21. 
	UWAGA: Podczas sterylizacji skalpela bardzo ważne jest, aby unikać dotykania ostrzami ceramicznej ścianki. Skrobanie ściany ceramicznej może zagrozić integralności urządzenia grzewczego.</li>
	<li>Trzymaj instrument w obszarze sterylizacji przez 5-7 sekund.</li>
	<li>Wyjmij instrument bez dotykania boków, przesuwając go do tyłu wzdłuż prowadnicy.</li>
	<li>W przypadku kilofów pozwól instrumentowi ostygnąć przez 3-5 sekund przed dotknięciem robaka, aby uniknąć jego poparzenia. 
	UWAGA: Skalpele lub szpatułki, które nie mogą ostygnąć, przypalą agar.</li>
	<li>Po zebraniu robaków ponownie włóż kilof do komory na 5-7 sekund, aby spalić wszelkie robaki na kilofie.</li>
</ol>
3. Metoda porównawcza - sterylizacja narzędzi za pomocą palnika Bunsena
<ol>
	<li>Podłącz palnik Bunsena do przewodu gazowego za pomocą gumowej rurki. Upewnij się, że rurka jest szczelnie zabezpieczona i ustaw palnik z dala od przedmiotów znajdujących się nad głową.</li>
	<li>Włącz gaz, przekręcając pokrętło na przewodzie gazowym.</li>
	<li>Zapal palnik za pomocą zaczepu lub zapalniczki.</li>
	<li>Wyreguluj płomień za pomocą pokrętła gazu i wlotu powietrza, aż widoczny będzie niebieski stożek.</li>
	<li>Przytrzymaj kilof, szpatułkę lub skalpel w płomieniu, aż zaświeci się na czerwono.</li>
	<li>W przypadku kilofów pozwól instrumentowi ostygnąć przez 3-5 sekund przed dotknięciem robaka, aby uniknąć jego poparzenia. 
	UWAGA: Skalpele lub szpatułki, które nie mogą ostygnąć, przypalą agar.</li>
	<li>Po zerwaniu robaków ponownie włóż kilof do płomienia, aby spalić wszelkie robaki na kilofie.</li>
</ol>
4. Eksperyment
<ol>
	<li>Hodowla bakterii OP50 Escherichia coli (E. coli) w Luria Broth22 przez noc na wytrząsarce o temperaturze 37 oC.</li>
	<li>Po całonocnym posiewie rozcieńczyć kulturę w sterylnej wodzie w stosunku 1:100, 
	UWAGA: Ten współczynnik rozcieńczenia został wybrany, aby zapewnić oddzielenie kolonii po posiewie.</li>
	<li>Zanurz wykałaczkę wysterylizowaną za pomocą palnika Bunsena w roztworze bakteryjnym, ponownie wysterylizuj palnikiem Bunsena i zamieszaj w 100 ml sterylnej wody.</li>
	<li>Umieść 100 μl wody na 10 cm agarze LB 22,23 Szalka Petriego, rozprowadź wodę za pomocą sterylnego rozsiewacza komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 24 godziny pod przykryciem.</li>
	<li>Wykonaj kroki 4.3-4.4 za pomocą wykałacza ślimakowego wysterylizowanego za pomocą mikrospalarni.</li>
	<li>Jako kontrolę pozytywną należy wykonać kroki 4.3-4.4 bez ponownej sterylizacji.</li>
	<li>Jako kontrolę ujemną należy wykonać kroki 4.3-4.4 używając sterylnej wody zamiast roztworu bakteryjnego.</li>
	<li>Policz kolonie ręcznie po okresie inkubacji.</li>
</ol>

<ol><li>Attix, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+caught+nematode+identification+and+early+embryo+development%3A+An+accessible+undergraduate+research+experience%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">Wild caught nematode identification and early embryo development: An accessible undergraduate research experience.</a> microPublication Biology. 2021, (2021).</li>
<li>Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+connections+between+neuron+signaling+and+behavior+using+C.+elegans+learning+assays+and+optogenetics+in+a+laboratory+class%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">Demonstrating connections between neuron signaling and behavior using C. elegans learning assays and optogenetics in a laboratory class.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 16 (3), 223-231 (2018).</li>
<li>Lemons, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inquiry-based+approach+to+study+the+synapse%3A+Student-driven+experiments+using+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%3A+JUNE%3A+A+Publication+of+FUN%2C+Faculty+for+Undergraduate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education: JUNE: A Publication of FUN, Faculty for Undergraduate Neuroscience. 15 (1), 44-55 (2016).</li>
<li>Raley-Susman, K. M., Gray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+gerontogenes+in+the+nervous+system%3A+a+multi-level+neurogenomics+laboratory+module+for+an+intermediate+neuroscience+and+behavior+course%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">Exploration of gerontogenes in the nervous system: a multi-level neurogenomics laboratory module for an intermediate neuroscience and behavior course.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 8 (2), 108-115 (2010).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-11 (2006).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019(2012).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+I%3A+yeast%2C+Drosophilia%2C+and+C.+Elegant.+C.+Elegans+Maintenace%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Biology I: yeast, Drosophilia, and C. Elegant. C. Elegans Maintenace.</a> JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%3A+A+Practical+Approach%22">C. elegans: A Practical Approach</a>. , IRL. Oxford University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+Worms%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+Model+Organism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">Working with Worms: Caenorhabditis elegans as a Model Organism.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35(2019).</li>
<li>Waechter-Brulla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+safety+in+the+microbiology+laboratory+through+active+learning+and+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+for+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Improving safety in the microbiology laboratory through active learning and investigation.</a> American Society for Microbiology. , (2000).</li>
<li>Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It+says+in+the+books+that+ethanol+burns+with+a+cool+flame%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">It says in the books that ethanol burns with a cool flame.</a> Journal of Chemical Education. 77 (11), 1488(2000).</li>
<li>Mojtabai, F., Kaufman, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMojtabai%2C+F+%22Learning+by+accident.+V.+2%22">Learning by accident. V. 2</a>. , Laboratory Safety Institute. Natick, MA. (2005).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Laboratory+Techniques.+Introduction+to+the+Bunsen+Burner%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">General Laboratory Techniques. Introduction to the Bunsen Burner.</a> JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Bykowski, T., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aseptic Technique.</a> Current Protocols in Microbiology. 56 (1), 98(2020).</li>
<li>Katz, D. S. The streak plate protocol. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKatz%2C+DS+%22American+Society+for+Microbiology+Laboratory+Protocols%22">American Society for Microbiology Laboratory Protocols</a>. , (2008).</li>
<li>Public Health Agency of Canada. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agency+of+Canada+Canadian+Biosafety+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22Government+of+Canada%22%5BJournal%5D)">Agency of Canada Canadian Biosafety Handbook.</a> Government of Canada. , Ottawa, ON. (2016).</li>
<li>Emmert, E. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASM+Task+Committee+on+Laboratory+Biosafety+Biosafety+guidelines+for+handling+microorganisms+in+the+teaching+laboratory%3A+development+and+rationale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%26+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">ASM Task Committee on Laboratory Biosafety Biosafety guidelines for handling microorganisms in the teaching laboratory: development and rationale.</a> Journal of Microbiology & Biology Education. 14 (1), 78-83 (2013).</li>
<li>Collins, C. H. Health Hazards in Microbiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCollins%2C+CH+%22Handbook+of+Laboratory+Health+and+Safety+Measures%22">Handbook of Laboratory Health and Safety Measures</a>. Pal, S. B. , Springer. Dordrecht. (1990).</li>
<li>Laboratory Biosafety Manual. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/I/item/9789240011311">https://www.who.int/publications/I/item/9789240011311</a> (2020).</li>
<li>Fleming, D. O. Laboratory Safety Principles and Practices. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFleming%2C+DO+%22American+Society+for+Microbiology%22">American Society for Microbiology</a>. , ASM Press. Washington, D.C. (1995).</li>
<li>Gordon, R. C., Davenport, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+modification+to+improve+usefulness+of+the+Bacti-Cinerator%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Simple modification to improve usefulness of the Bacti-Cinerator.</a> Applied Microbiology. 26 (3), 423(1973).</li>
<li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LB+%28Luria-Bertani%29+liquid+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">LB (Luria-Bertani) liquid medium.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Media+containing+agar+or+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Media containing agar or agarose.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
</ol>

Nie ujawniono żadnych konfliktów interesów.

C. elegans jest organizmem modelowym dobrze nadającym się do ćwiczeń w laboratoriach dydaktycznych na studiach licencjackich. Stosowanie mikrospalarni zamiast otwartego ognia przynosi korzyści zarówno w laboratoriach badawczych, jak i w laboratoriach stacjonarnych. W rzeczywistości studia laboratoryjne na poziomie licencjackim mogą stwarzać większe ryzyko przypadkowych pożarów, biorąc pod uwagę liczbę nowo wyszkolonych naukowców w pomieszczeniu. Ponadto ryzyko pożaru wzrasta, gdy etanol jest używany do sterylizacji narzędzi w pobliżu źródła płomienia, ponieważ opary etanolu są łatwopalne. Przenośność jest również zaletą w salach lekcyjnych, w których przewody gazowe nie są zainstalowane na każdym stanowisku. Metoda ta została zastosowana w laboratoriach dydaktycznych i badawczych w naszej instytucji, co spowodowało brak wzrostu zanieczyszczeń i zero wypadków związanych z bezpieczeństwem laboratoryjnym od czasu jej powstania w 2016 roku. 
Aby zapewnić kompatybilność z mikrospalarniami, przetestowano szereg kilofów o różnych mocowaniach, składach przewodów i grubościach drutu. Skład drutu obejmował 100% platyny, a także 90% platyny/10% irydu o grubości drutu 30-32 G, a niezależnie od grubości i składu, metoda ogrzewania nie naruszała integralności drutu. Mocowania obejmowały dwa różne typy dostępnych na rynku uchwytów do wybierania oraz wykonane przez nas szklane mocowania z pipet Pasteura. Zwróć uwagę, że kilofy nie świecą się na czerwono, tak jak w płomieniu. Jednak wystarczająca sterylizacja jest nadal osiągana, o ile sterylizator osiągnął odpowiednią temperaturę. Dlatego bardzo ważne jest, aby mikrospalarnia rozgrzała się przez 10 lub 20 minut, jak wskazano w instrukcjach producenta. Kluczowe znaczenie ma również trzymanie narzędzia w komorze przez co najmniej 5 sekund w celu sterylizacji. Pozostawienie instrumentu w komorze dłużej niż 7 s nie spowoduje uszkodzenia instrumentu, ale jest niepotrzebne. Chociaż jest to stosunkowo prosta procedura z minimalnymi krokami i jest mało prawdopodobne, aby wymagała rozwiązywania problemów, nauczenie się stabilizowania instrumentu w lufie bez dotykania boków może wymagać trochę praktyki.
Aby zastąpić otwarty płomień, metoda sterylizacji musi obejmować wszystkie zastosowania stosowane w laboratorium. Oprócz narzędzi sterylizujących, laboratoria C. elegans mogą również używać palników Bunsena do tworzenia sterylnego pola do wykonywania innych zadań, takich jak nalewanie płytek lub zaszczepianie kultur13. Jednak to, czy tworzy to sterylne pole, czy też wciąga wciąż żywe zanieczyszczenia, pozostaje kontrowersyjne14. Chociaż nie jest to możliwe we wszystkich instytucjach, do tych celów można użyć komory bezpieczeństwa biologicznego lub okapu z przepływem laminarnym, dzięki czemu laboratorium może funkcjonować bez użycia otwartego ognia. Instrukcje obsługi większości mikrospalarni odradzają stosowanie ostrzy skalpela do sterylizacji, ponieważ skrobanie wewnętrznych ścianek uszkadza sterylizator. Jeśli jednak ostrożnie korzysta się z prowadnicy, można wysterylizować ostrze skalpela lub szpatułkę bez dotykania wewnętrznych ścianek. Rozszerza to zastosowanie tej techniki, aby umożliwić dzielenie na kawałki bez użycia płomienia i pozwala laboratorium C. elegans funkcjonować bez przełączania technik między sterylizacją różnych przedmiotów.
Jak przedstawiono w tabeli 1, mikrospalarnie zapewniają większe bezpieczeństwo, zwiększoną kompatybilność z okapami z przepływem laminarnym oraz większą przenośność w porównaniu z metodami opartymi na płomieniu, ale mają ograniczenia. Są one bardziej kosztowne niż inne metody i wymagają czasu nagrzewania przed osiągnięciem temperatury sterylizacji. Podsumowując, ta metoda, która jest rutynowo stosowana w wielu laboratoriach mikrobiologicznych, może być stosowana w niektórych laboratoriach badawczych i dydaktycznych C. elegans dążących do poprawy bezpieczeństwa laboratoryjnego bez uszczerbku dla sterylności.

Organizm modelowy C. elegans doskonale nadaje się zarówno do badań, jak i edukacji w instytucjach głównie licencjackich (PUI) ze względu na niski koszt, łatwość utrzymania i zakres zastosowań1,2,3,4. Aby poradzić sobie z robakami - na przykład, aby przenieść robaka z jednej płytki na drugą, eksperymentatorzy mogą użyć wykałaczki do robaków. Można wykonać lub kupić różne kilofy do użytku z C. elegans. Kostelki są najczęściej wykonywane przy użyciu platynowej lub platynowo-irydowej końcówki, zamontowanej w szklanej, metalowej lub drewnianej rączce. Szklane uchwyty można wykonać we własnym zakresie, topiąc pipetę Pasteura wokół platynowego drutu, aż drut będzie bezpieczny. Dodatkowe informacje na temat hodowli C. elegans, w tym jak hodować i utrzymywać robaki oraz ich źródła pożywienia, można znaleźć w WormBook5 i innych źródłach6,7,8.
Podczas pracy z C. elegans, zazwyczaj stosuje się techniki aseptyki, aby zapobiec skażeniu mikrobami i grzybami. Przykłady technik aseptycznych obejmują sterylizację narzędzi, autoklawowanie odczynników i prowadzenie prac na sterylnych polach. Wytrychy do robaków są zazwyczaj sterylizowane przy użyciu otwartego ognia9. Dodatkowo sterylizacja ślimaka spala robaki, zapobiegając w ten sposób przypadkowemu pomieszaniu szczepów podczas pracy z wieloma szczepami robaków. Typowe metody sterylizacji wytrychów robaków obejmują otwarty płomień z palnika Bunsena, latarni etanolowej lub standardowej zapalniczki (tabela 1). Zostaliśmy zmotywowani do poszukiwania bezpieczniejszych alternatyw dla istniejących metod w laboratorium, gdy student studiów licencjackich nieświadomie rozlał etanol podczas napełniania latarni etanolowej i przypadkowo wzniecił mały pożar podczas zapalania latarni. Niestety, zgłoszono wiele wypadków z użyciem latarni etanolowych10,11,12. Na szczęście alternatywne metody sterylizacji zostały zatwierdzone do stosowania w mikrobiologii, a celem tego artykułu jest pokazanie, jak używać tego sprzętu do sterylizacji narzędzi do użytku z C. elegans.
W laboratoriach mikrobiologicznych technika aseptyczna jest również krytyczna. Serologiczne pętle i druty wykonane z platyny są sterylizowane za pomocą otwartego ognia13 lub mikrospalarki14,15,16. Inne nazwy mikrospalarni to mikrosterylizatory lub spalarnie bakterii. Zalety mikrospalarni w porównaniu z tradycyjnymi metodami spalania obejmują zmniejszone zagrożenie pożarowe, eliminację rozprysków spalanych materiałów oraz możliwość pracy w okapie z przepływem laminarnym/szafie bezpieczeństwa biologicznego16,17,18. W rzeczywistości zarówno Amerykańskie Towarzystwo Mikrobiologii, jak i Światowa Organizacja Zdrowia zalecają stosowanie mikrospalarni zamiast otwartego ognia17,19,20. W porównaniu z palnikami Bunsena, mikrospalarnie nie wymagają również przewodu gazowego, którego niektóre laboratoria mogą nie mieć lub mogą nie znajdować się przy każdym stanowisku do użytku przez studentów. Zainspirowany tymi zaletami, opracowano protokół mający na celu zastąpienie stosowania płomienia mikrospalarniami do sterylizacji powszechnie używanych narzędzi, takich jak kilofy, szpatułki i skalpele w laboratorium C. elegans. Metoda ta może być odpowiednia dla instruktorów i badaczy dążących do zwiększenia bezpieczeństwa i/lub elastyczności podczas pracy z C. elegans.

<table><tbody><tr><td>90% platyna 10% drut irydowy</td><td>Tritech</td><td>PT-9010</td><td>Można stosować inne źródła i składy drutu.</td></tr><tr>Składnik <td>agaru</td> <td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6013</td> LB</tr><tr><td>Palnik Bunsena Fisher</td><td>Scientific</td><td>50-110-1225</td><td>Można używać innych palników Bunsena</td></tr><tr><td>Lampa</td> etanolowa <td>Carolina</td><td>706604</td><td>Zamieszczona tutaj jako odniesienie do Tabeli 1</td></tr><tr><td>Zapalniczka</td><td>Carolina</td><td>706636</td><td>Dołączona tutaj jako odniesienie do Tabeli 1</td></tr><tr><td>Akcesorium do uchwytu pętli</td><td>Fisher</td><td>22-630-002</td><td>Określany w manuskrypcie jako "przewodnik"</td></tr><tr><td>Mikrospalarnia</td><td>Thomas Scientific</td><td>1154J15</td><td>Istnieje wiele firm, które sprzedają podobny sprzęt. Podobne modele sprzedawane również przez Benchmark Scientific (B1001),&nbsp; Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400) i BT Lab Systems (BT1702).</td></tr><tr><td>Robaki N2</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td>LB składnik</td></tr><tr><td>OP50 E. coli</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Fisher</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt picka</td><td>Tritech</td><td>TWPH1</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Fisher</td><td>12-000-161</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Fisher</td><td>12-000-164</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Fisher</td><td>14-374</td><td>Inne szpatułki będą działać</td></tr><tr><td>Sterylne rozsiewacze komórek</td><td>VWR</td><td>76206-438</td><td>Inne rozsiewacze komórek mogą być używane, o ile są sterylne</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7293</td><td>LB składnik</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Składnik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>LB</td></tr></tbody></table>

bezpłomieniowa metoda sterylizacji kilofów, szpatułek i skalpeli c. elegans

A Flame-Free Method for Sterilizing C. elegans Picks, Spatulas, and Scalpels

Caenorhabtidis elegans (C. elegans) jest optymalnym organizmem modelowym do badań i edukacji głównie na uczelniach licencjackich. Studenci mogą szybko nauczyć się sterylnej techniki wymaganej do utrzymania kultur C. elegans. Sterylizacja platynowych kilofów używanych do przenoszenia robaków z jednej płytki na drugą odbywa się tradycyjnie poprzez trzymanie kilofa w płomieniu z palnika Bunsena lub latarni etanolowej. Palniki Bunsena wymagają jednak źródła gazu, a oba elementy wyposażenia stwarzają ryzyko przypadkowego pożaru związanego z otwartym ogniem. Zademonstrowano tutaj technikę sterylizacji robaków, szpatułek i skalpeli za pomocą mikrospalarni pętli bakteriologicznej na podczerwień. To urządzenie wymaga jedynie gniazdka elektrycznego i minimalizuje potencjalne zagrożenie pożarowe. Obniżając ryzyko i zapotrzebowanie na gaz, technika ta doskonale nadaje się do badań i nauczania na studiach licencjackich.

Zaprojektowano prosty eksperyment (rozdział 4), aby zademonstrować względne poziomy kontaminacji przy użyciu mikrospalarki w porównaniu z płomieniem (Rysunek 1, Tabela 2). Chociaż wyniki te reprezentują poziomy kontaminacji dla poszczególnych metod, powtarzanie tej procedury nie jest konieczne do zastosowania techniki z użyciem mikrospalarki. Eksperyment przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Kontrolą negatywną była sterylna woda bez bakterii. W kontroli pozytywnej nie zastosowano żadnej z technik sterylizacji: pętlę zanurzono w rozcieńczonej kulturze OP50, a następnie przeniesiono bezpośrednio do sterylnej wody. Wszystkie powtórzenia i warunki testowano równolegle tego samego dnia. Na wszystkich trzech płytkach kontroli negatywnej odnotowano zero kolonii. Średnia liczba kolonii wyniosła 4,7 (± 0,3 SEM) w przypadku sterylizacji pętli palnikiem Bunsena. W warunkach z użyciem mikrospalarki zaobserwowano średnią liczbę 3,3 (±1,2 SEM) kolonii. Natomiast w kontroli pozytywnej uzyskano średnią liczbę 298,3 (±17,9 SEM) kolonii. Dwustronny test t przy założeniu równości wariancji, porównujący palnik Bunsena z mikrospalarką, nie wykazał statystycznie istotnej różnicy, p = 0,35. Zatem mikrospalarka zapewniła wyniki sterylizacji równie skuteczne jak palnik Bunsena.
<img alt="Wykres porównawczy kolonii bakteryjnych: mikro-incinerator, palnik Bunsena, analiza grup kontrolnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63578/63578fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Liczba bakterii w zależności od metody sterylizacji. Pętle zanurzano w kulturze OP50 w sterylnej wodzie (rozcieńczenie 1:100), a następnie sterylizowano za pomocą palnika Bunsena lub mikro-incineratora. Następnie pętle zanurzono w sterylnej wodzie, wysiano na agar LB22,23 i inkubowano przez 24 h w temperaturze pokojowej, po czym dokonano ręcznego przeliczenia kolonii. Kontrola pozytywna nie była sterylizowana, a w kontroli negatywnej zastosowano sterylną wodę bez bakterii. n = 3 powtórzeń dla każdego warunku. Uwaga: oś y jest przerwana, aby umożliwić rozdzielenie punktów danych w odpowiednich częściach wykresu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63578/63578fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metoda sterylizacji</td>
			<td>Koszt</td>
			<td>Wymagania laboratoryjne</td>
			<td colspan="2">Zalety</td>
			<td colspan="3">Wady</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrospalarka</td>
			<td>$365–530</td>
			<td>gniazdo zasilania 120 V lub 230 V</td>
			<td colspan="2">• Przenośny 
			• Zakaz używania otwartego ognia lub odsłoniętych elementów grzejnych 
			• Możliwość stosowania w dygestoriach z laminarnym przepływem powietrza oraz w komorach bezpieczeństwa biologicznego</td>
			<td colspan="3">• Czas rozgrzewania 
			• Wyższy koszt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palnik Bunsena</td>
			<td>$24–169</td>
			<td>Linia gazowa</td>
			<td colspan="2">• Szybka konfiguracja 
			• Niski koszt</td>
			<td colspan="3">• Otwarty ogień 
			• Nie zaleca się stosowania w dygestorium z przepływem laminarnym ani w komorze bezpieczeństwa biologicznego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lampa etanolowa</td>
			<td>$11</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td colspan="2">• Szybka konfiguracja 
			• Niski koszt 
			• Wielorazowy</td>
			<td colspan="3">• Otwarty ogień 
			• Zagrożenie bezpieczeństwa podczas uzupełniania 
			• Nie zaleca się stosowania w komorze z laminarnym przepływem powietrza ani w komorze bezpieczeństwa biologicznego 
			• Niedozwolone w niektórych instytucjach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zapalniczka</td>
			<td>$5–8</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td colspan="2">• Niski koszt 
			• Dostępny 
			• Jednorazowy 
			• Wielorazowy</td>
			<td colspan="3">• Otwarty ogień 
			• Ręcznie obsługiwane 
			• Nie zaleca się stosowania w dygestorium z przepływem laminarnym ani w komorze bezpieczeństwa biologicznego</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Porównanie metod sterylizacji instrumentów. Porównano cztery metody sterylizacji instrumentów pod kątem zalet, wad, kosztów oraz wymagań laboratoryjnych.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Powtórz</td>
			<td colspan="4">Warunek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrospalarka</td>
			<td>Palnik Bunsena</td>
			<td>Kontrola negatywna</td>
			<td>Kontrola pozytywna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>0</td>
			<td>278</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>0</td>
			<td>334</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>0</td>
			<td>283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia</td>
			<td>3.3</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0.0</td>
			<td>298.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.0</td>
			<td>17.9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Surowe dane dotyczące liczby bakterii dla poszczególnych metod sterylizacji.Wymiatałki zanurzano w kulturze OP50 w sterylnej wodzie w stosunku 1:100, a następnie sterylizowano za pomocą palnika Bunsena lub mikrospalarki. Następnie wymiatałki zanurzano w sterylnej wodzie, wysiewano na agar LB22,23 i inkubowano przez 24 h w temperaturze pokojowej, po czym kolonie policzono ręcznie. Kontrola pozytywna nie była sterylizowana, a w kontroli negatywnej zastosowano sterylną wodę bez bakterii. n = 3 powtórzenia dla każdego wariantu. Średnia i SEM podane poniżej poszczególnych wartości.

Ten artykuł opisuje metodę sterylizacji robaków, szpatułek i skalpeli za pomocą mikro-spalarki zamiast otwartego ognia.

Bezpłomieniowa metoda sterylizacji kilofów, szpatułek i skalpeli C. elegans

Caenorhabtidis elegans (C. elegans) is an optimal model organism for research and education at primarily undergraduate institutions. Undergraduates can ...

Protokół ten przedstawia technikę aseptyczną do stosowania z C.Elegans, która eliminuje potrzebę stosowania otwartego ognia. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zmniejsza zagrożenia bezpieczeństwa poprzez eliminację otwartego ognia i może być stosowana w pomieszczeniach laboratoryjnych bez przewodów gazowych oraz w okapach z przepływem laminarnym. Przesuwanie narzędzi do i z obszaru sterylizacji bez dotykania boków może być trudne, ale dodanie prowadnicy i ustabilizowanie ręki ułatwia ruch.Zacznij od zamocowania prowadnicy akcesoriów uchwytu pętli do mikrospalarni, przypinając ją do lufy zewnętrznej. Podłącz mikrospalarkę do standardowego gniazdka elektrycznego 120 lub 230 V, w zależności od potrzeb. Ustaw mikrospalarkę na wysokie ustawienie i pozwól jej się rozgrzać przez 10 do 20 minut, aby osiągnąć optymalną temperaturę w zakresie od 800 do 825 stopni Celsjusza.Włóż instrument do cylindrycznego obszaru sterylizacji bez dotykania boków, przesuwając go wzdłuż prowadnicy. Trzymaj instrument w obszarze sterylizacji przez pięć do siedmiu sekund. Wyjmij instrument bez dotykania boków, przesuwając go do tyłu wzdłuż prowadnicy.W przypadku kilofów pozwól instrumentowi ostygnąć przez trzy do pięciu sekund przed dotknięciem robaka, aby uniknąć jego poparzenia. Po zerwaniu robaków włóż ponownie kilof do komory na pięć do siedmiu sekund, aby spalić wszelkie robaki na kilofie. Podłącz palnik Bunsena do przewodu gazowego za pomocą gumowej rurki.Upewnij się, że rurka jest szczelnie zabezpieczona i ustaw palnik z dala od przedmiotów znajdujących się nad głową. Włącz gaz, przekręcając pokrętło na przewodzie gazowym. Zapal palnik za pomocą zaczepu lub zapalniczki.Wyreguluj płomień za pomocą pokrętła gazu i wlotu powietrza, aż widoczny będzie niebieski stożek. Przytrzymaj kilof, szpatułkę lub skalpel w płomieniu, aż zaświeci się na czerwono. W przypadku kilofów pozwól instrumentowi ostygnąć przez trzy do pięciu sekund przed dotknięciem robaka, aby uniknąć jego poparzenia.Po zerwaniu robaków włóż ponownie kilof do płomienia, aby spalić wszelkie robaki na kilofie. Posiew bakterii OP50 E.coli w bulionie Luria przez noc na wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po całonocnym posiewie rozcieńczyć kulturę w sterylnej wodzie w stosunku 1:100.Zanurz wykałaczkę wysterylizowaną za pomocą palnika Bunsena lub mikrospalarni w roztworze bakteryjnym, ponownie wysterylizuj i zawiruj w 100 mikrolitrach sterylnej wody. W celu kontroli pozytywnej zanurz kilof w roztworze bakteryjnym, zawiruj w sterylnej wodzie, a w celu kontroli negatywnej wysterylizuj kilof bez zanurzania w roztworze bakteryjnym, a następnie zawiruj w sterylnej wodzie. Umieść 100 mikrolitrów wody na 10-centymetrowej szalce Petriego z bulionu Luria, rozprowadź wodę za pomocą sterylnego rozsiewacza komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 24 godziny pod przykryciem.Policz kolonie ręcznie po okresie inkubacji. Względny współczynnik zanieczyszczenia mierzono poprzez zliczanie kolonii w próbce. Na płytkach kontroli ujemnej nie stwierdzono żadnych kolonii.Średnią liczbę 4,7 kolonii z błędem standardowym 0,3 kolonii uzyskano, gdy do sterylizacji kilofów użyto palnika Bunsena. W warunkach mikrospalarni zaobserwowano średnią liczbę 3,3 kolonii z błędem standardowym wynoszącym 1,2 kolonii. Jednak średnią liczbę kolonii uzyskano 298,3 w warunkach kontroli pozytywnej.W ten sposób mikrospalarnia osiągnęła wyniki sterylności równie skuteczne jak palnik Bunsena. Zgodnie z tą procedurą można wykonać dowolne metody, które obejmują zbieranie lub dzielenie C.Elegans na kawałki. W związku z tym ma zastosowanie do szerokiej gamy pytań badawczych.

a-flame-free-method-for-sterilizing-c-elegans-picks-spatulas

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przesiewowe poszukiwanie mutantów z defektami fenotypowymi jest prostą metodą identyfikacji genów funkcjonujących w danym procesie biologicznym. W niniejszym artykule opisujemy sposób hodowli wolnożyjących nicieni (np. Pristionchus pacificus) w warunkach laboratoryjnych i przedstawiamy dwie różne metody mutagenezy: EMS oraz TMP/UV.

Wprowadzenie do laboratorium nicieni: od hodowli nicieni do mutagenezy

Podczas pracy w laboratorium niezbędne jest zminimalizowanie źródeł kontaminacji. Technika aseptyczna odnosi się do procedur umożliwiających przenoszenie kultur i odczynników przy jednoczesnym unikaniu kontaktu z powierzchniami nieszterylnymi. Pipety serologiczne i mikropipety są wykorzystywane do odmierzania precyzyjnych objętości bez naruszania sterylności roztworów stosowanych w eksperymentach.

Aseptyczne techniki laboratoryjne: przenoszenie objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipet

Ten film przedstawia metodę izolowania blastomerów C. elegans z wczesnych zarodków. Otrzymane komórki nadają się do hodowli komórkowej lub eksperymentów ex vivo.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie blastomerów: metoda usuwania skorupki jaja i dysocjacji komórek embrionalnych

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

Obuzd Parhyale hawaiensis jest obiecującym organizmem modelowym do badań embriologii skorupiaków oraz porównawczego rozwoju i ewolucji stawonogówów. Protokół ten opisuje metodę ręcznego usuwania pojedynczych blastomerów z zarodków Parhyale we wczesnym stadium rozszczepienia.

Ablacja pojedynczej komórki z ośmiokomórkowych zarodków skorupiaka z rodziny Amphipod Parhyale hawaiensis

Ten artykuł opisuje metodę generowania embrionów chimerycznych, które są przeznaczone do testowania specyficznego dla gatunku wkładu grzebienia nerwowego i/lub innych tkanek w rozwój twarzoczaszki.<br...

Ocena specyficznego dla gatunku wkładu w rozwój twarzoczaszki za pomocą chimer kaczki przepiórczej

Złożoność tkanek systemów wielokomórkowych utrudnia identyfikację związku przyczynowego między sygnałami zewnątrzkomórkowymi a indywidualnymi zachowaniami komórek. W tym miejscu przedstawiamy metodę badania bezpośredniego związku między wskazówkami zależnymi od kontaktu a osiami podziału przy użyciu blastomerów zarodkowych C. elegans i adhezyjnych kulek polistyrenowych.

Rekonstrukcja in vitro przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi blastomerami zarodkowymi Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

W tym filmie zaprezentowano technikę mikroiniekcji do gonady C. elegans w celu stworzenia zwierząt transgenicznych.

Generowanie stabilnych transgenicznych *C. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

Poznaj bezpłomieniową metodę sterylizacji narzędzi do badań z C. elegans przy użyciu mikro-palnika. Technika ta zwiększa bezpieczeństwo laboratoryjne i eliminuje ryzyko związane z otwartym płomieniem.

Bezpłomieniowa metoda sterylizacji kilofów, szpatułek i skalpeli C. elegans

Przeglądaj więcej filmów