Bezpłomieniowa metoda sterylizacji kilofów, szpatułek i skalpeli C. elegans

Protokół ten przedstawia technikę aseptyczną do stosowania z C.Elegans, która eliminuje potrzebę stosowania otwartego ognia. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zmniejsza zagrożenia bezpieczeństwa poprzez eliminację otwartego ognia i może być stosowana w pomieszczeniach laboratoryjnych bez przewodów gazowych oraz w okapach z przepływem laminarnym. Przesuwanie narzędzi do i z obszaru sterylizacji bez dotykania boków może być trudne, ale dodanie prowadnicy i ustabilizowanie ręki ułatwia ruch.

Zacznij od zamocowania prowadnicy akcesoriów uchwytu pętli do mikrospalarni, przypinając ją do lufy zewnętrznej. Podłącz mikrospalarkę do standardowego gniazdka elektrycznego 120 lub 230 V, w zależności od potrzeb. Ustaw mikrospalarkę na wysokie ustawienie i pozwól jej się rozgrzać przez 10 do 20 minut, aby osiągnąć optymalną temperaturę w zakresie od 800 do 825 stopni Celsjusza.

Włóż instrument do cylindrycznego obszaru sterylizacji bez dotykania boków, przesuwając go wzdłuż prowadnicy. Trzymaj instrument w obszarze sterylizacji przez pięć do siedmiu sekund. Wyjmij instrument bez dotykania boków, przesuwając go do tyłu wzdłuż prowadnicy.

W przypadku kilofów pozwól instrumentowi ostygnąć przez trzy do pięciu sekund przed dotknięciem robaka, aby uniknąć jego poparzenia. Po zerwaniu robaków włóż ponownie kilof do komory na pięć do siedmiu sekund, aby spalić wszelkie robaki na kilofie. Podłącz palnik Bunsena do przewodu gazowego za pomocą gumowej rurki.

Upewnij się, że rurka jest szczelnie zabezpieczona i ustaw palnik z dala od przedmiotów znajdujących się nad głową. Włącz gaz, przekręcając pokrętło na przewodzie gazowym. Zapal palnik za pomocą zaczepu lub zapalniczki.

Wyreguluj płomień za pomocą pokrętła gazu i wlotu powietrza, aż widoczny będzie niebieski stożek. Przytrzymaj kilof, szpatułkę lub skalpel w płomieniu, aż zaświeci się na czerwono. W przypadku kilofów pozwól instrumentowi ostygnąć przez trzy do pięciu sekund przed dotknięciem robaka, aby uniknąć jego poparzenia.

Po zerwaniu robaków włóż ponownie kilof do płomienia, aby spalić wszelkie robaki na kilofie. Posiew bakterii OP50 E.coli w bulionie Luria przez noc na wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po całonocnym posiewie rozcieńczyć kulturę w sterylnej wodzie w stosunku 1:100.

Zanurz wykałaczkę wysterylizowaną za pomocą palnika Bunsena lub mikrospalarni w roztworze bakteryjnym, ponownie wysterylizuj i zawiruj w 100 mikrolitrach sterylnej wody. W celu kontroli pozytywnej zanurz kilof w roztworze bakteryjnym, zawiruj w sterylnej wodzie, a w celu kontroli negatywnej wysterylizuj kilof bez zanurzania w roztworze bakteryjnym, a następnie zawiruj w sterylnej wodzie. Umieść 100 mikrolitrów wody na 10-centymetrowej szalce Petriego z bulionu Luria, rozprowadź wodę za pomocą sterylnego rozsiewacza komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 24 godziny pod przykryciem.

Policz kolonie ręcznie po okresie inkubacji. Względny współczynnik zanieczyszczenia mierzono poprzez zliczanie kolonii w próbce. Na płytkach kontroli ujemnej nie stwierdzono żadnych kolonii.

Średnią liczbę 4,7 kolonii z błędem standardowym 0,3 kolonii uzyskano, gdy do sterylizacji kilofów użyto palnika Bunsena. W warunkach mikrospalarni zaobserwowano średnią liczbę 3,3 kolonii z błędem standardowym wynoszącym 1,2 kolonii. Jednak średnią liczbę kolonii uzyskano 298,3 w warunkach kontroli pozytywnej.

W ten sposób mikrospalarnia osiągnęła wyniki sterylności równie skuteczne jak palnik Bunsena. Zgodnie z tą procedurą można wykonać dowolne metody, które obejmują zbieranie lub dzielenie C.Elegans na kawałki. W związku z tym ma zastosowanie do szerokiej gamy pytań badawczych.