Name: Trójwymiarowy, bezsurowicowy system hodowli komórek macierzystych gruczołów łzowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj trójwymiarową, bezsurowicową metodę hodowli komórek macierzystych gruczołów łzowych z myszy BALB/c. Technika umożliwia długoterminową ekspansję i różnicowanie komórek, stanowiąc model do badań nad regeneracją gruczołów łzowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31871413) oraz dwa Programy Nauki i Technologii Guangdong (2017B020230002 i 2016B030231001). Jesteśmy naprawdę wdzięczni naukowcom, którzy pomogli nam podczas badania oraz pracownikom pracującym w centrum dla zwierząt za ich wsparcie w opiece nad zwierzętami.

<ol><li>Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+injection+of+interleukin-1+induces+reversible+aqueous+tear+deficiency%2C+lacrimal+gland+inflammation%2C+and+acinar+and+ductal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation.</a> Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).</li>
<li>Gromova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+repair+using+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland repair using progenitor cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).</li>
<li>Buzhor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+approaches%3A+the+hope+for+incurable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases.</a> Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PLoS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).</li>
<li>Ackermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+investigation+of+presumptive+murine+lacrimal+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lugli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+1+and+noggin+facilitate+expansion+of+resident+stem+cells+from+non-damaged+gallbladders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders.</a> EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1), 324-338 (2015).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B%28ve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Linnemann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regenerative+potential+in+primary+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells.</a> Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+expansion+of+salivary+gland+stem+cells+driven+by+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Xiao, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+long-term+serum-free+culture+for+lacrimal+gland+stem+cells+aiming+at+lacrimal+gland+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).</li>
<li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured%2C+adult+rat+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+side+population+cells+restores+the+function+of+damaged+exocrine+glands+through+clusterin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin.</a> Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).</li>
<li>Aluri, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+improves+tear+production+in+a+mouse+model+of+sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome.</a> Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).</li>
<li>Dietrich, J., Schrader, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+lacrimal+gland+regeneration%3A+current+concepts+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches.</a> Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+matrix+%28BME%29+has+multiple+uses+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Istnieją dobrze znane metody izolacji i hodowli in vitro łzowych komórek macierzystych w celu hodowli łzowych komórek macierzystych i naprawy uszkodzeń LG. Shatos i wsp.17 oraz Ackermanni wsp.6 pomyślnie hodowanych i subhodowanych łzowych komórek macierzystych szczurów i myszy odpowiednio metodami hodowli 2D, co umożliwia przeszczepienie łzowych komórek macierzystych w celu leczenia ADD. Badania na komórkach macierzystych18 i mezenc...

Komórki macierzyste gruczołów łzowych (LGSC) utrzymują odnowę komórek gruczołów łzowych (LG) i są źródłem komórek groniastych i przewodowych. Dlatego przeszczep LGSC jest uważany za alternatywne podejście do leczenia ciężkich uszkodzeń zapalnych i zespołu suchego oka z niedoborem wody wodnistej (DODANO)1,2,3. Zastosowano kilka metod hodowli w celu wzbogacenia LGSC. Tiwari i wsp. odseparowali i wyhodowali pierwotne komórki LG przy użyciu kolagenu I i żelu macierzy uzupełnionego kilkoma czynnikami wzrostu; jednak komórki LG nie mogły być hodowane w sposób ciągły4. Korzystając z dwuwymiarowej (2D) hodowli, mysie komórki macierzyste pochodzące z LG zostały wyizolowane przez You i wsp.5 oraz Ackermann i wsp.6, stwierdzono ekspresję genów markerów komórek macierzystych/progenitorowych, Oct4, Sox2, Nanog i nestin, i może być subkulturowany. Nie ma jednak wyraźnych przesłanek, że komórki te mogą różnicować się w komórki groniaste lub przewodowe, nie ma też eksperymentu transplantacyjnego w celu zweryfikowania potencjału różnicowania in vivo.
Niedawno, komórki c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- zostały wyizolowane z mysich LG za pomocą cytometrii przepływowej, stwierdzono ekspresję markerów komórek progenitorowych LG, takich jak Pax6 i Runx1, i zróżnicowano je w kanaliki i acini in vitro. U myszy z ADD, ortotopowe wstrzyknięcie tych komórek może naprawić uszkodzone LG i przywrócić funkcję wydzielniczą LGs2. Jednak liczba komórek macierzystych wyizolowanych tą metodą była niewielka i nie ma odpowiednich warunków hodowli do namnażania izolowanych LGSC. Podsumowując, należy ustanowić odpowiedni system hodowli, aby skutecznie izolować i hodować dorosłe LGSC ze stabilną i ciągłą ekspansją w celu badania LGSC w leczeniu ADD.
Organoidy pochodzące z komórek macierzystych lub pluripotencjalnych komórek macierzystych to grupa komórek, które są histologicznie podobne do pokrewnych narządów i mogą utrzymywać swoją własną odnowę. Po tym, jak organoid jelita myszy został pomyślnie wyhodowany przez Sato i wsp. w 2009 r. 7, organoidy z innych narządów zostały kolejno wyhodowane, w oparciu o system hodowli Sato, taki jak woreczek żółciowy8, wątroba9, pancreas10, żołądek11, pierś12, lung13, prostata14 i gruczoł ślinowy15. Ze względu na wysoki odsetek dorosłych komórek macierzystych przed różnicowaniem komórek w hodowli organoidów, metoda trójwymiarowej (3D) hodowli organoidów jest uważana za optymalną do izolacji i hodowli dorosłych komórek macierzystych LG.
System hodowli LGSC u dorosłych myszy został stworzony w niniejszym badaniu poprzez optymalizację metody hodowli 3D, bez surowicy. Udowodniono, że LGSC wyhodowane zarówno z myszy normalnych, jak i myszy z DODATKIEM wykazywały stabilną zdolność do samoodnawiania się i proliferacji. Po przeszczepie do mysich LG z ADDED, LGSC skolonizowały upośledzone LG i poprawiły produkcję łez. Ponadto czerwone fluorescencyjne LGSC wyizolowano od myszy ROSA26mT/mG i hodowano. Praca ta stanowi wiarygodne odniesienie dla wzbogacania LGSC in vitro i autoprzeszczepu LGSC w zastosowaniach klinicznych w terapii ADD.

<table><tbody><tr><td>Animal(Mouse)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal B/C</td><td>Model Centrum Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu w Nankinie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu</td><td></td><td></td>Sun Yat-sen</tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>Model Centrum Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu</td><td></td><td></td>w Nankinie</tr><tr><td>ROSA26mT/mG</td><td>Modelowe Centrum Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu</td><td></td><td></td> w Nankinie</tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna suszarka</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora do liczenia krwi</td><td>BLAU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>CountStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator stałej temperatury CO2</td><td>System</td> obrazowania żelowego Thermo <td></td><td></td></tr><tr><td>ECL GE</td><td>healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia elektryczna do kąpieli wodnej</td><td>Technologia</td><td></td><td></td>Yiheng</tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny ilościowy instrument PCR</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krajalnica do mrożonych tkanek</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka pozioma</td><td>CENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserowy blaszkowy mikroskop skaningowy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik na ciekły azot</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niska temperatura wysoka wirówka prędkości</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td> Spektrofotometr <td>ultrafioletowy Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Pomiar</td><td>temperatury stężenia</td><td></td>RNA</tr><tr><td>Krajalnica parafinowa</td><td>Wzmacniacz Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tester wartości pH</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Lodówka</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termostatyczny oscylator hodowli</td><td>ZHICHENG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do zatapiania parafiny tkankowej</td><td>Termo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-80&deg; C Lodówka ultraniskotemperaturowa</td><td>Termo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-20&deg; C Lodówka ultraniskotemperaturowa</td><td>System</td> oczyszczania wody Thermo <td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>u>Reodagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animal Experiment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Sigma</td><td>9002-61-3</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>14158-65-7</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>BD</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D0697</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500895</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050087</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Matrix gel)</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Murine Wnt3A</td><td>PeproTech</td><td>315-20</td><td></td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>R-spondyna 1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny (TI)</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>Pochodząca z Glycine max; może w mniejszym stopniu hamować trypsynę, chymotrypsynę i plazminazę. Jeden mg hamuje 1,0-3,0 mg trypsyny.</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; T4799</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>HE barwienie i Barwienie immunologiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osioł anty-mysie IgG</td><td>Thermo</td><td>A-21202</td><td>Stosowane rozcieńczenie: IHC) 2 &mu; g/ml, (IF) 0,2 &mu; g / mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osioł anty-królik IgG</td><td>Thermo</td><td>A-21206</td><td>Używane rozcieńczenie: (IHC) 2 i mu; g/ml, (jeżeli) 2 i m; g / mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 osioł anty-mysz IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10037</td><td>Używane rozcieńczenie: (IHC) 2 i mu; g/ml, (jeżeli) 2 i m; g / mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 osioł anty-królik IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10042</td><td>Używane rozcieńczenie: (IHC) 2 i mu; g/ml, (IF) 4 &m; g / ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało królika anty-AQP5</td><td>Abcam</td><td>ab104751</td><td>Użyte rozcieńczenie: (IHC) 1 i mu; g/ml, (IF) 0,1 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-E-kadheryny szczura</td><td>Abcam</td><td>ab11512</td><td>Używane rozcieńczenie: (IF)&nbsp; 5 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało królicze anty-Keratyna14</td><td>Abcam</td><td>ab181595</td><td>Używane rozcieńczenie: (IHC) 1 i mu; g/ml, (jeżeli) 2 i m; g / mL</td></tr><tr><td>przeciwciało królika anty-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Używane rozcieńczenie: (IHC) 1 &mu; g/ml, (IF) 1 & m; g / mL</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-mCherry</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td>Używane rozcieńczenie: (IHC) 2 &mu; g/ml, (jeżeli) 2 i m; g / ml</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-mCherry rabbit</td><td>Abcam</td><td>ab167453</td><td>Używane rozcieńczenie: (IF)&nbsp; 2 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>C6H8O7</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501702-0500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sangon Biotech</td><td>201-069-1</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DAB (20x)</td><td>CWBIO</td><td>CW0125</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>BASO</td><td>68115</td><td></td></tr><tr><td>Montaż fluorescencyjny Medium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501912-0500</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Używane rozcieńczenie: 2 i mu; g / ml</td></tr><tr><td>koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (HRP)</td> <td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>Używane rozcieńczenie: 2 i mu; g / ml</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>BASO</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>Histogel (hydrożel do zatapiania)</td> <td>Thermo</td><td>HG-400-012</td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>KD10</td><td></td></tr><tr><td>30% roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Na3C6H5O7.2H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501293-0500</td><td></td></tr><tr><td>Neutralny balsam</td><td>SHANGHAI YIYANG</td><td>YY-Neutralny balsam</td><td></td></tr><tr><td>Nieszczepione kozie serum</td><td>BOSTER</td><td>AR0009</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601891-0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>DAMAO</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny</td><td>Sangon Biotech</td><td>200-675-3</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>IB11-AR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.T.C. Compound</td><td>SAKURA</td><td>SAKURA.4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>DINGGUO</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Guangzhou Chemia</td><td>128686-03-3</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR & qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol</td><td>Guangzhou Chemia</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Guangzhou Chemia</td><td>865-49-6</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sangon Biotech</td><td>214-984-6</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Guangzhou Chemia</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td><td>Roche</td><td>488735200H</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>Polimeraza DNA TOYOBO-Taq</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>TAKARA</td><td>R10T1</td><td></td></tr><tr><td>Goldview (kwas nukleinowy bejca)</td><td>BioSharp</td><td>BS357A</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Magen</td><td>R4801-02</td><td></td></tr><tr><td>Vector Konstrukcja & Transfekcja komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td> OXID-Ampicillin <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma</td><td>56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji plazmidu bez endotoksyn</td><td>Thermo</td><td>A36227</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid Lipo3000 Zestaw do transfekcji</td><td>Thermo</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw reakcyjny LR</td><td>Zestaw</td><td></td> do ekstrakcji plazmidu Thermo 11791019 <td></td></tr><tr><td></td><td>TIANGEN</td><td>DP103</td><td></td></tr><tr><td>Trans5&alpha; Chemicznie kompetentna komórka</td><td>TRANSGEN</td><td>CD201-01</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td></td> <td>OXID-Ekstrakt</td><td></td></tr> <tr><td>drożdżowy</td><td>OXID</td><td><</td><td></td></tr><tr><td>strong>Startery i sekwencja</td><td>Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: &beta;-aktyna <silna>Sekwencja</silna>: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCTCTT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGGGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLX302 lentivirus wektor bez obciążenia</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENRTY-mLaboratorium</td><td>Cherry Xiaofeng Qin, Uniwersytet</td><td></td><td></td> Sun Yat-sen</tr></tbody></table>

trójwymiarowy, bezsurowicowy system hodowli komórek macierzystych gruczołów łzowych

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Terapia komórkami macierzystymi gruczołów łzowych (LG) jest obiecującą strategią dla chorób gruczołów łzowych. Jednak brak wiarygodnej metody hodowli bez surowicy w celu uzyskania wystarczającej liczby komórek macierzystych LG (LGSC) jest jedną z przeszkód dla dalszych badań i zastosowań. Trójwymiarowa (3D), bezsurowicowa metoda hodowli dorosłych myszy LGSC jest dobrze znana i pokazana tutaj. LGSC mogą być w sposób ciągły pasażowane i indukowane do różnicowania się w komórki groniaste lub przewodowe.
Dla podstawowej kultury LGSC, LG od myszy w wieku 6-8 tygodni były trawione za pomocą dispasy, kolagenazy I i trypsyny-EDTA. W sumie 1 × 104 pojedyncze komórki wysiano do 80 μl matrycy żelowo-łzowej pożywki z komórek macierzystych gruczołu łzowego (LGSCM) w każdym dołku 24-dołkowej płytki, wstępnie pokrytej 20 μl matrycy żelowej-LGSCM. Mieszaninę zestalono po inkubacji przez 20 minut w temperaturze 37 °C i dodano 600 μl LGSCM.
W celu utrzymania LGSC, LGSC hodowane przez 7 dni były dezagregowane na pojedyncze komórki za pomocą dypazy i trypsyny-EDTA. Pojedyncze komórki wszczepiono i wyhodowano zgodnie z metodą zastosowaną w hodowli pierwotnej LGSC. LGSC mogą być pasażowane ponad 40 razy i w sposób ciągły eksprymować markery komórek macierzystych/progenitorowych Krt14, Krt5, P63 i nestiny. LGSC hodowane w LGSCM mają zdolność do samoodnawiania się i mogą różnicować się w komórki groniaste lub przewodowe in vitro i in vivo.

Ustanowienie trójwymiarowego (3D), bezzserwatkowego systemu hodowli 
W niniejszym badaniu opracowano LGSCM zawierający EGF, Wnt3A, FGF10 oraz Y-27632 dla mysich LGSCs; LGSCs zostały pomyślnie wyizolowane i hodowane metodą hodowli 3D (Rysunek 1A). Przy użyciu tej metody ustanowiono skuteczny 3D, bezzserwatkowy system hodowli LGSCs z myszy C57BL/6, myszy NOD/ShiLtJ, myszy BALB/c oraz myszy ROSA26mT/mG16. W przypadku samca myszy, poprzez dy...

Metoda trójwymiarowej, bezsurowicowej hodowli komórek macierzystych dorosłych gruczołów łzowych (LG) jest dobrze znana do indukcji tworzenia i różnicowania organoidów LG w komórki groniaste lub przewodowe.

Trójwymiarowy, bezsurowicowy system hodowli komórek macierzystych gruczołów łzowych

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Protokół ten zapewnia korzystną strategię wzbogacania komórek macierzystych gruczołów łzowych w celu regeneracji i odbudowy gruczołu łzowego. Komórki macierzyste gruczołów łzowych wykazują długoterminową zdolność do rozbudowy i potencjał różnicowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że pożywka hodowlana dla komórek macierzystych gruczołów łzowych jest wolna od surowicy, co pokazuje ogromną wartość dla naprawy gruczołów łzowych Zacznij od uzyskania uśpionej sześcio- do ośmiotygodniowej myszy płci męskiej BALB/c i przecięcia skóry za uchem, aby odsłonić gruczoł łzowy i otaczającą go tkankę łączną.Oderwij tkankę łączną przez rozwarstwienie za pomocą pęsety i usuń gruczoł łzowy. Zanurz gruczoły łzowe w sześciocentymetrowym naczyniu z czterema mililitrami 75% etanolu na 10 sekund i natychmiast dwukrotnie spłucz 10-milimolowym roztworem PBS. Pokrój gruczoły łzowe na małe fragmenty o wielkości około jednego milimetra sześciennego.Przenieś je do sterylnej 15-mililitrowej probówki wirówkowej i potraktuj tkanki 500 mikrolitrami 25 jednostek na mililitr dypazy i 500 mikrolitrami 0,1% kolagenazy I przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Potraktuj fragmenty gruczołów łzowych jedny

three-dimensional-serum-free-culture-system-for-lacrimal-gland-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pierwotna hodowla komórkowa przy użyciu nienaruszonych organoidów tkankowych dostarcza systemu modelowego, który naśladuje wielokomórkowe mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy model hodowli pierwotnej tkanki nabłonka piersi bez surowicy, który utrwala mieszane linie hodowli komórkowych i wykazuje zróżnicowaną morfologię, bez enzymatycznego rozerwania tkanki. Organoidy piersi zachowują żywotność przez &gt;6 miesięcy.

Nieenzymatyczna, pozbawiona surowicy hodowla tkankowa przedinwazyjnych zmian piersi do spontanicznego wytwarzania mammosfery

Gruczoł łzowy (LG) to rozgałęziony organ, który wytwarza wodne składniki łez, niezbędne do utrzymania wzroku i zdrowia oczu. Tutaj opisujemy mysie techniki preparacji LG i hodowli ex vivo w celu rozszyfrowania szlaków sygnałowych zaangażowanych w rozwój LG.

Manipulowanie mysim gruczołem łzowym

Tutaj przedstawiamy protokół rozwoju trójwymiarowego (3-D) systemu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) o nazwie surowica wolnego od embrionów (SFEB). Ten model 3D może być używany jak organotypowa kultura plasterków do modelowania rozwoju ludzkiej kory mózgowej i do fizjologicznego badania rozwijających się obwodów neuronalnych.

Opracowanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z HiPSC do badania kultur 3-D komórek macierzystych przy użyciu fizjologicznie odpowiednich testów

Ten protokół wprowadza prostą dwuetapową metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli wolnej od kseno- i komórek karmiących. Przedstawione tu metody hodowli komórkowych umożliwiają opłacalną produkcję na dużą skalę komórek o jakości klinicznej, mających zastosowanie w terapii komórkami rogówki.

Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje podejście do produkcji hepatosfer z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu hodowli i samoorganizacji komórek. Protokół ten jest powtarzalny w wielu liniach komórkowych, jest opłacalny i pozwala na produkcję stabilnych ludzkich hepatosfer do zastosowań biomedycznych.

Produkcja trójwymiarowych ludzkich hepatosfer bez surowicy z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje, jak ustanowić, utrzymywać, genetycznie modyfikować, różnicować, funkcjonalnie charakteryzować i przeszczepiać organoidy gruczołów łzowych pochodzące z pierwotnej tkanki mysiej i ludzkiej.

Ustalanie, utrzymywanie, różnicowanie, manipulacja genetyczna i przeszczepianie organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi

Tutaj prezentujemy protokół demonstrujący użycie hydrożelu jako trójwymiarowego (3D) szkieletu hodowli komórek do hodowli komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i wprowadzający fotobiomodulację (PBM) w celu zwiększenia proliferacji ADSC w warunkach hodowli 3D.

Trójwymiarowa hodowla komórkowa komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z augmentacją fotobiomodulacyjną

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę dysocjacji starzejących się gruczołów łzowych myszy w celu uzyskania żywotnych pojedynczych komórek do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Sekwencyjne trawienie enzymatyczne i delikatne traktowanie zachowują integralność komórek, dając wysokiej jakości zawiesiny odpowiednie do izolacji specyficznej dla typu komórki oraz analizy transkryptomicznej zmian związanych ze starzeniem się w populacjach gruczołów łzowych.

Protokół dotyczący dysocjacji pojedynczych komórek, sekwencjonowania RNA oraz izolacji komórek i fibroblastów mioepitelowych z starzejących się gruczołów łzowych i ślinowych

Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Ludzki lizat płytek krwi jest bogatym źródłem czynników wzrostu i silnym suplementem w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia proces przygotowania dużej puli ludzkiego lizatu płytek krwi, rozpoczynając od osocza bogatopłytkowego, przeprowadzając kilka cykli zamrażania i rozmrażania oraz usuwając fragmenty płytek.

Przygotowanie puli lizatu płytek krwi ludzkich (pHPL) jako wydajnego suplementu do bezzernowych hodowli ludzkich komórek macierzystych

Poznaj trójwymiarową, bezsurowicową metodę hodowli komórek macierzystych gruczołów łzowych z myszy BALB/c. Technika umożliwia długoterminową ekspansję i różnicowanie komórek, stanowiąc model do badań nad regeneracją gruczołów łzowych.

Trójwymiarowy, bezsurowicowy system hodowli komórek macierzystych gruczołów łzowych

Przeglądaj więcej filmów