Name: Podejście niesekwencjonujące do szybkiego wykrywania edycji RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę µTGGE do szybkiego wykrywania edycji RNA bez sekwencjonowania. Ta przenośna technika elektroforezy pozwala rozróżniać edytowane i nieedytowane fragmenty RNA w prosty i opłacalny sposób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez grant na badania naukowe od Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 i 18K19288). Ruchika była finansowana przez rząd japoński (stypendium MEXT). Dziękujemy pani Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) oraz dr Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) za pomoc przy eksperymentach związanych z elektroforezą.

1. Optymalizacja fragmentu docelowego
UWAGA: Do opracowania tego protokołu wykorzystano cztery edytowane geny, w tym dwa geny jądrowe (AT2G16586 i AT5G02670) z A. thaliana oraz geny kodujące niebieskie białko fluorescencyjne (BFP) i wzmocnione zielone fluorescencyjne białko (EGFP) wyrażane w komórkach HEK293.
<ol>
	<li>Aby zidentyfikować fragmenty genów o różnych profilach topnienia, reprezentujących obszary edytowane i nieedytowane, wygeneruj przewidywane krzywe topnienia za pomocą webowego narzędzia uMelt HETS, będącego rozszerzeniem oryginalnego oprogramowania uMelt13. UWAGA: To narzędzie przewiduje kształty krzywych topnienia dla produktów heterodupleksowych i homodupleksowych.</li>
	<li>Dla każdego docelowego genu zaprojektuj trzy pary fragmentów genu (o długości 300-324 bp). Każda para składa się z fragmentu z edytowanym miejscem oraz odpowiadającego mu fragmentu typu dzikiego z nieedytowanym miejscem, zlokalizowanego na końcu 5'-terminalnym, środkowym lub 3'-terminalnym.</li>
	<li>Wybierz parę nieedytowaną/edytowaną, która pokazała maksymalną różnicę między obszarami topnienia na osi helicity, aby kontynuować analizę. Do analizy μTGGE syntetyzuj wybrany fragment genu za pomocą amplifikacji PCR, jak opisano w sekcji 2 poniżej.</li>
	<li>Projektuj spłony do przodu i do tyłu za pomocą oprogramowania DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) i weryfikuj za pomocą narzędzia NCBI Primer-BLAST.</li>
	<li>Rozcieńcz podkłady w buforze TE (10 mM Tris-HCl zawierający 1 mM EDTA·Na2) i przechowuj je w stężeniu 100 pmol/μL. Przed użyciem rozcieńcz każdy podkład ustawiony na stężenie 10 pmol/μL za pomocą wody destylowanej.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja RNA i amplifikacja RT-PCR fragmentu docelowego
<ol>
	<li>Ekstrakcja RNA<ol>
		<li>Ekstrakcja całkowitego RNA ze źródeł genów edytowanych i nieedytowanych za pomocą standardowych metod, takich jak ekstrakcja TRIzol14 lub dostępne komercyjnie zestawy.</li>
		<li>Wykonaj syntezę odpowiadającego mu cDNA za pomocą standardowego protokołu RT-PCR, opisanego w kroku 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transkrypcja odwrotna<ol>
		<li>Dodaj 1 μL oligo(dT) spodkładu, 1 μL 10 mM mieszanki dNTP, 10 μL całkowitego RNA oraz 10 μL sterylnej wody destylowanej do rurki mikrowirówki wolnej od nukleazy.</li>
		<li>Podgrzej mieszankę w 65 °C przez 5 minut, a następnie inkubuj na lodzie przez co najmniej 1 minutę.</li>
		<li>Zawartość probówki należy pobrać przez wirowanie z maksymalną prędkością (12 000 x g) przez 2-3 sekundy, dodając 4 μL buforu 5x ReverTra Ace, 1 μL 0,1 M DTT oraz 1 μL M-MLV (wirusa Moloney Micine Leukemia) odwróconej transkryptazy (200 U/μL, Tabela materiałów).</li>
		<li>Mieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół. Jeśli używasz losowych spłonników, inkubuj tubę w 25 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Inkubuj probówkę w 55 °C przez 60 minut, a następnie inaktywuj reakcję, podgrzewając ją w 70 °C przez 15 minut w cyfrowej suchej kąpieli/podgrzewaczu blokowym.</li>
		<li>Zmierz stężenie cDNA spektrofotometrem i przechowuj je w temperaturze -25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja PCR i sekwencjonowanie potwierdzające produktów
	<ol>
		<li>Do rurki mikrowirówki wolnej od nukleazy dodaj następujące odczynniki: 4 μL 5x buforu polimerazy Taq, 2 μL mieszanki 2 mM dNTP, 2 μL 25 mM MgCl2, 1,6 μL zestawu zapalnika (do przodu i do tyłu; każdy po 10 mM), 2 μL matrycy cDNA, 0,1 μL polimerazy Taq (2,5 U/μL), oraz 8,3 μL sterylnej wody destylowanej (końcowa objętość, 20 μL).</li>
		<li>Wykonaj PCR w następujących warunkach cyklicznych: początkowa denaturacja w 95 °C przez 2 minuty; 35 cykli denaturacji w 95 °C przez 2 minuty, wyżarzanie w odpowiedniej temperaturze (w zależności od konkretnego zestawu spłonników) przez 30 sekund oraz przedłużanie w 72 °C przez 2 minuty; a następnie ostateczne przedłużenie w 72 °C przez 7 minut.</li>
		<li>Aby oczyścić produkty PCR, należy dodać 2 U egzonukleazy I oraz 0,5 U alkalicznej fosfatazy krewetkowej (ExoSAP). Inkubuj rurkę w cyklerze termicznym w 37 °C przez 1 godzinę, następnie 80 °C przez 15 minut, a następnie utrzymuj w 4 °C do kolejnego kroku.</li>
		<li>Do sekwencjonowania potwierdzającego dodaj 11,5 μL sterylnej wody destylowanej, 2,5 μL zapalnika do przodu lub tyłu oraz 1 μL produktów PCR (z ExoSAP) do nowej rurki mikrowirówki. UWAGA: Korzystaj z usług sekwencjonowania DNA (np. Eurofins Genomics) do analizy sekwencjonowania.</li>
		<li>Aby zweryfikować specyficzność produktów PCR, należy wykonać sekwencjonowanie zarówno z podkładem do przodu, jak i do tyłu. Pary pierwsze używane w analizie reprezentatywnej przedstawione są w Tabeli 1.</li>
		<li>Rozcieńcz oczyszczone produkty PCR do stężenia 200 ng/μL za pomocą wody dejonizowanej. Następnie wymieszaj 6 μL produktu oczyszczonego z 3 μL barwnika 6x żelowego w tubce 250 μL i zwiększ całkowitą objętość do 12 μL z wodą sterylną. Przechowuj produkt PCR (w temperaturze -25 °C) do momentu gotowości do przystąpienia do μTGGE opisanego poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza μTGGE
UWAGA: Analiza μTGGE przeprowadza się przy użyciu zminiaturyzowanego i ekonomicznego systemu. Przegląd całego systemu, w tym kaset żelowych, otrzymywania kaset żelowych, poziomej platformy elektroforezy żelowej, zasilania oraz systemu obrazowania żelowego, przedstawiono na Rysunku 2.
<ol>
	<li>Montaż kaset żelowych<ol>
		<li>Kaseta żelowa użyta do analizy μTGGE pokazana jest na Rysunku 2A. Projekt składa się z trzech płytek żelowych o średnicy 1 cala: dolnej płyty żelowej, górnej płyty żelowej oraz płyty do formowania tora. Umieść górną płytę żelową między pozostałymi dwiema płytami i złoż w utrzymaniu kasety żelowej do polimeryzacji żelowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie żelu poliakrylamidowego<ol>
		<li>Dodaj 7,2 g mocznika do probówki o pojemności 50 ml i rozpuścij w 10 mL sterylnej wody. Podgrzej próbkę w mikrofalówce przez 20-30 sekund, a następnie doprowadź do temperatury pokojowej (RT).</li>
		<li>Dodaj 3 mL 5x buforu Tris/boran/EDTA (TBE) (Tabela materiałów), 2,25 mL 40% (w/v) akrylamidu/bis (19:1), 75 μL 10x nadsiarczanu amonu oraz 15 μL tetrametyloetylenedaminy.</li>
		<li>Natychmiast wlej roztwór żelowy do pojemnika kasetowego powoli, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie profili topnienia przy użyciu jednostki μTGGE<ol>
		<li>Użyj miniaturowej, ekonomicznej wersji aparatu μTGGE pokazanej na Rysunku 2 z gradientem temperatury (25-65 °C) ustawionym prostopadle do kierunku migracji DNA.</li>
		<li>Górne i dolne podkładki buforowe elektroforezy (0,5 cm x 2,5 cm) zanurz w 2 mL buforu 1x TBE.</li>
		<li>Umieść kasetę żelową w poziomej komorze elektroforezy i odpowiednio umieść górne i dolne podkładki buforowe, jak pokazano na Rysunku 2.</li>
		<li>Następnie załaduj 10 μL produktu PCR do środkowego (dłuższego) otworu oraz 1 μL produktu PCR do każdego bocznego otworu.</li>
		<li>Po 1 minutowym oczekiwaniu podłącz jednostkę zasilającą i dostarczaj 100 V przez 12 minut z liniowym gradientem temperatury od 25 do 65 °C.</li>
		<li>Po zakończeniu emisji wyjmij kasetę i zdejmij górną pokrywę szkła.</li>
		<li>Wlej 300 μL 10x bejcy SYBR Gold na żel. Zwizualizuj profile topnienia za pomocą niebieskiej latarki LED zainstalowanej w urządzeniu elektroforetycznym wielkości dłoni. UWAGA: Należy zapisać miękki plik obrazu żelowego do obliczenia Pattern Similarity Score (PaSS).</li>
		<li>Powtarzaj każdy eksperyment elektroforetyczny 3 razy, aby potwierdzić powtarzalność danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obliczenia PaSS
UWAGA: Obliczenia wykonywane są za pomocą oprogramowania μTGGE Analyzer.
<ol>
	<li>Pobierz i otwórz oprogramowanie.</li>
	<li>Otwórz plik JPEG zawierający obraz żelowy. Należy zauważyć, że oprogramowanie akceptuje tylko pliki w formacie JPEG.</li>
	<li>Kliknij przycisk Ramka i wybierz odpowiedni obszar (klatkę) obrazu żelowego.</li>
	<li>Kliknij przycisk Korekcji współrzędnych i dodaj dwa punkty odniesienia, jak pokazano na Rysunku 1B.</li>
	<li>Kliknij przycisk Dodaj punkty cech i dodaj punkty przykładowe, jak pokazano na Rysunku 1B. Następnie zapisz przetworzone dane obrazu żelowego w formacie μTGGE (*.tgg).</li>
	<li>Kliknij przycisk Próbka i wybierz opcję Wyszukaj proste punkty , aby porównać dwa lub więcej obrazów.</li>
</ol>

<ol><li>Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+high-throughput+method+for+the+detection+and+quantification+of+RNA+editing+based+on+high-resolution+melting+of+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons.</a> Nucleic Acids Research. 35 (17), 114(2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+method+for+the+quantitative+analysis+of+RNA+editing+at+specific+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites.</a> Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).</li>
<li>Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+RNA+editing%3A+a+molecular+analysis+of+GluR2%2C+GluR5+and+GluR6+in+human+brain+tissues+and+in+NT2+cells+following+in+vitro+neural+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation.</a> Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).</li>
<li>Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-processing+events+in+mRNAs+identified+by+DHPLC+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis.</a> Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).</li>
<li>Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+method+to+detect+RNA+editing+events%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Quantitative method to detect RNA editing events.</a> Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).</li>
<li>Burns, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+serotonin-2C+receptor+G-protein+coupling+by+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing.</a> Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).</li>
<li>Marian, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bottleneck+in+genetic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The bottleneck in genetic testing.</a> Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).</li>
<li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+biology%3A+Not+drowning+but+waving%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome biology: Not drowning but waving.</a> Cell. 154 (5), 951-952 (2013).</li>
<li>Jones, B. M., Knapp, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+temperature+gradient+electrophoresis+for+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).</li>
<li>Riesner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-gradient+gel+electrophoresis+of+nucleic+acids%3A+analysis+of+conformational+transitions%2C+sequence+variations%2C+and+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions.</a> Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).</li>
<li>Biyani, M., Nishigaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hundred-fold+productivity+of+genome+analysis+by+introduction+of+micro-temperature+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).</li>
<li>Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palm-size+and+one-inch+gel+electrophoretic+device+for+reliable+and+field-applicable+analysis+of+recombinase+polymerase+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification.</a> Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).</li>
<li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((uMELT%3A+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+using+TRIzol+%28TRI+Reagent%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li>
<li>Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+of+BFP%2C+a+point+mutant+of+GFP%2C+using+artificial+APOBEC1+deaminase+to+restore+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17304(2020).</li>
<li>Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+activity+of+adenosine+deaminase+acting+on+RNA+%28ADARs%29+isoforms+for+correction+of+genetic+code+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).</li>
<li>Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+U-To-C+RNA+editing+events+for+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Cells. 10 (3), 635(2021).</li>
<li>Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U-to-C+RNA+editing+affects+the+mRNA+stability+of+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Edycja RNA odgrywa ważną rolę w biologii; jednak obecne metody wykrywania edycji RNA, takie jak chromatografia i sekwencjonowanie, stanowią wiele wyzwań ze względu na wysokie koszty, nadmierne wymagania czasowe i złożoność. Opisany tutaj protokół to prosta, szybka i opłacalna metoda wykrywania edycji RNA, wykorzystująca przenośny, mikroskopyzowany system oparty na TGGE. System ten może być używany do rozróżniania genów edytowanych i nieedytowanych przed sekwencjonowaniem Sangera. Konkretnie, geny edytowane i nieedytowane...

Pojedyncze warianty nukleotydów (SNV) w RNA genomowym, w tym warianty A-to-I, C-to-U i U-to-C, mogą wskazywać na zdarzenia edycyjne RNA. Jednak wykrywanie SNV w RNA pozostaje technicznie wymagającym zadaniem. Tradycyjnie stosunek redygowanego do nieedytowanego RNA określa się poprzez sekwencjonowanie bezpośrednie, specyficzną dla allelu reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR) lub denaturującą wysokowydajną chromatografię cieczową (HPLC) zbliża siędo 1,2,3,4,5,6. Jednak te podejścia nie są szczególnie efektywne ani czasowo, ani kosztowo, a ich niska dokładność, spowodowana wysokim poziomem szumów, stanowi technologiczne wąskie gardła w wykrywaniu SNV opartych na RNA 7,8. Tutaj opisujemy protokół oparty na elektroforezie gradientowej temperatury (TGGE) do identyfikacji pojedynczych polimorfizmów nukleotydowych (SNP) jako alternatywnej metody eliminującej potrzebę bezpośrednich metod sekwencjonowania RNA w analizach edycji RNA.
Elektroforeza jest preferowaną metodą separacji i analizy biomolekuł w laboratoriach nauk przyrodniczych. TGGE umożliwia rozdzielenie fragmentów DNA dwuniciowych o tej samej wielkości, ale posiadających różne sekwencje. Technika opiera się na różnicach związanych z sekwencją w temperaturach topnienia fragmentów DNA oraz późniejszych zmianach ich ruchomości w żelach porowatych o liniowym gradiencie temperaturowym 9,10. Topnienie fragmentów DNA generuje określone profile topnienia. Gdy domena o najniższej temperaturze topnienia osiągnie odpowiednią temperaturę w określonym miejscu w żelu, następuje przejście ze struktury helikalnej do częściowo stopionej, a migracja cząsteczki praktycznie się zatrzymuje. Dlatego TGGE wykorzystuje zarówno mobilność (informacje o rozmiarze), jak i przejścia strukturalne DNA indukowane temperaturą fragmentów DNA (informacje zależne od sekwencji), co czyni go potężnym podejściem do charakteryzacji fragmentów DNA. Punkty charakterystyczne w wzorze topnienia TGGE, które odpowiadają trzem przejściom strukturalnym cząsteczki DNA, to punkt początkowej dysocjacji nici, punkt dysocjacji w połowie nici oraz punkt dysocjacji na końcu nici (Rysunek 1). Zmiany sekwencji w obrębie domen, nawet różnice pojedynczej zasady, wpływają na temperaturę topnienia, dlatego cząsteczki o różnych sekwencjach wykazują dyskretne wzorce topnienia (denaturacji) w analizach TGGE. Dlatego TGGE może być wykorzystywany do analizy SNV w genomowym RNA i może być nieocenioną metodą o wysokiej przepustowości wykrywania edycji RNA. To wzmocnienie o wysokiej przepustowości jest tracone przy użyciu tradycyjnego TGGE opartego na elektroforezie żelowej. Jednak miniaturyzowana wersja TGGE, nazwana microTGGE (μTGGE), może być użyta do skrócenia czasu elektroforetycznego żelu i przyspieszenia analizy o 100-krotny wzrost wydajności11. Prostota i kompaktowość metody μTGGE zostały poprawione dzięki wprowadzeniu PalmPAGE12, systemu elektroforezy żelowej stosowanej w terenie, przenośnej i przystępnej cenowo.
Tutaj nowy protokół oparty na TGGE służy do badania trzech typów miejsc edycji RNA (A-do-I, C-do-U i U-do-C) w czterech genach, w tym dwóch z tkanek Arabidopsis thaliana i dwóch ekspresjonowanych w komórkach ssaków HEK293 (Rysunek 1A). Protokół integruje wykorzystanie PalmPAGE (sprzętowy), przenośnego systemu do szybkiego wykrywania edycji RNA, oraz uMelt (oprogramowanie)13. Średni czas działania wynosi 15-30 minut, co umożliwia szybką, niezawodną i łatwą identyfikację edycji RNA bez konieczności bezpośredniego sekwencjonowania RNA.

<table><tbody><tr><td>2U ExoI</td><td>Takara</td><td>2650A</td><td>Egzonukleaza I</td></tr><tr><td>40(w/v)%-akryloamidu/bis (19:1)</td><td>Wędkarz termo</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>Persiarczan amonu (APS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Mini spin</td><td>Eppendorf</td><td>5452000034</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kąpiel na sucho/podgrzewacz blokowy</td><td>Wędkarz termo</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka Gold Taq Polymerase Master</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA LATaq</td><td>TAKARA</td><td>RR002A</td><td>Polimeraza Taq</td></tr><tr><td>mikro-TGGE&nbsp; Uchwyt na kasetę</td><td>BioSeeds Corp.</td><td>BS-GE-CH</td><td></td></tr><tr><td>aparat micro-TGGE</td><td>Lifetech Corp.</td><td>TG</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta żelowa micro-TGGE</td><td>BioSeeds Corp.</td><td>BS-TGGE-C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000</td><td>Wędkarz termo</td><td>ND-1000</td><td>Spektrofotometr</td></tr><tr><td>Zestaw Plant Rneasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>TRT101</td><td>M-MLV (wirus białaczki mysiej Moloneya) odwrócona transkryptaza</td></tr><tr><td>Zestaw Rneasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Fosforaza alkaliczna krewetek</td><td>Takara</td><td>2660B</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold barwnik żelowy kwasu nukleinowego</td><td>Wędkarz termo</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TBE</td><td>Wędkarz termo</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloelodeniamina (TEMED)</td><td>Nacalai tesque</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>Testowano mocznik, nukleazę i proteazę</td><td>Nacalai tesque</td><td>35940-65</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście niesekwencjonujące do szybkiego wykrywania edycji rna

A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing

Edycja RNA to proces prowadzący do zmian sekwencji posttranskrypcyjnej w RNA. Wykrywanie i ilościowe określenie edycji RNA opierają się głównie na technikach sekwencjonowania Sangera i RNA. Jednak te metody mogą być kosztowne i czasochłonne. W tym protokole stosowany jest przenośny system elektroforezy gradientowej mikrotemperatury (μTGGE) jako metoda niesekwencjonowania do szybkiego wykrywania edycji RNA. Proces opiera się na zasadzie elektroforezy, która wykorzystuje wysokie temperatury do denaturacji próbek kwasów nukleinowych podczas ich przemieszczania się po żelu poliakrylamidowym. W różnych temperaturach fragment DNA tworzy gradient w pełni dwuniciowym DNA do częściowo rozdzielonych nici, a następnie do całkowicie rozdzielonego jednoniciowego DNA. Miejsca edytowane RNA z różnymi zasadami nukleotydowymi dają różne profile topnienia w analizach μTGGE. Zastosowaliśmy podejście oparte na μTGGE do scharakteryzowania różnic między profilami topnienia czterech edytowanych fragmentów RNA a odpowiadającymi im fragmentami nieedytowanymi (typu dzikiego). Współczynniki podobieństwa wzorców (PaSS) były obliczane na podstawie porównania wzorców pasm uzyskanych przez edytowane i nieedytowane RNA i wykorzystywane do oceny powtarzalności metody. Ogólnie rzecz biorąc, opisana tutaj platforma umożliwia wykrywanie nawet mutacji pojedynczych zasad w RNA w prosty, prosty i opłacalny sposób. Przewiduje się, że to narzędzie analityczne wesprze nowe odkrycia biologii molekularnej.

Zastosowanie µTGGE do identyfikacji pojedynczych zmian nukleotydowych w zdarzeniach edycji RNA 
W niniejszym protokole wykorzystano cztery edytowane geny (Tabela 1), w tym gen BFP produkowany w komórkach HEK293 (z edycją RNA C-na-U przez enzymy deaminazy kompleksu edytującego mRNA apolipoproteiny B; APOBEC115), gen EGFP zawierający ochrowy kodon stop (TAA) produkowany w komórkach HEK293 (z edycją RNA A-na-I przez dehydrogenazę adenozynową działającą na RNA 1; A...

Szybkie wykrywanie i wiarygodna ilościowa identyfikacja zdarzeń edycjonujących RNA na skalę genomową pozostają wyzwaniem i obecnie opierają się na bezpośrednich metodach sekwencjonowania RNA. Opisany tutaj protokół wykorzystuje elektroforezę żelową z gradientem mikrotemperatury (μTGGE) jako prostą, szybką i przenośną metodę wykrywania edycji RNA.

Podejście niesekwencjonujące do szybkiego wykrywania edycji RNA

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger ...

Edycja RNA odgrywa kluczową rolę w chorobach ludzkich. Naukowcy znajdują niekończące się zastosowania w tych lekach. Protokół ten demonstruje zastosowanie przenośnej technologii elektroforezy temperaturowej jako podejścia niesekwencjonującego do szybkiej i niezawodnej identyfikacji modyfikacji RNA w edycji RNA bez konieczności bezpośredniego sekwencjonowania RNA.Do charakteryzacji różnic między profilem topnienia czterech edytowanych fragmentów RNA a odpowiadającymi im fragmentami RNA zastosowano podejście oparte na elektroforezie mikro tTG. Do oceny powtarzalności metody użyto wyników wzorców. Ta platforma umożliwia wykrywanie nawet podstawień opartych na pojedynczej bazie w RNA, w prosty, prosty i opłacalny sposób.Przewiduje się, że to narzędzie analityczne pomoże w nowych odkryciach w biologii molekularnej. Rozpocznij od identyfikacji fragmentów genów o różnych profilach topnienia i generowania przewidywanych krzywych topnienia za pomocą internetowego narzędzia Umelt HETS. Zaprojektuj trzy pary po 300 do 324 fragmentów genów opartych na zasadach dla każdego docelowego genu. Wybierz parę nieedytowaną lub edytowaną, która pokazuje maksymalną różnicę między obszarami topnienia na o

a-nonsequencing-approach-for-the-rapid-detection-of-rna-editing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

W tym artykule opisano wysoce czuły test oparty na rybozymie, mający zastosowanie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych substancji chemicznych ukierunkowanych na unikalny proces edycji RNA w patogenach trypanosomatidów. Inhibitory mogą być wykorzystywane jako narzędzia do opartej na hipotezach analizy procesu edycji RNA, a ostatecznie jako terapie.

Katalizator RNA jako reporter do badań przesiewowych leków przeciwko edycji RNA w trypanosomach

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (&lt;35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

Alternatywny splicing (AS) i alternatywna poliadenylacja (APA) rozszerzają różnorodność izoform transkryptu i ich produktów. W tym miejscu opisujemy protokoły bioinformatyczne do analizy masowych testów sekwencjonowania RNA i sekwencjonowania końca 3' w celu wykrycia i wizualizacji AS i APA różniących się w różnych warunkach eksperymentalnych.

Identyfikacja alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych sekwencyjnych RNA

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Ilościowe, wysokoprzepustowe, w czasie rzeczywistym i bez znakowania wykrywanie biomolekuł (DNA, białek itp.) na powierzchniach SiO2 można osiągnąć za pomocą prostej techniki interferometrycznej, która opiera się na oświetleniu LED, minimalnej liczbie komponentów optycznych i kamerze. Sensor obrazowania odbiciowego interferometrycznego (IRIS) jest niedrogi, prosty w obsłudze i dostosowany do formatów mikromacierzy.

Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)

Poznaj metodę µTGGE do szybkiego wykrywania edycji RNA bez sekwencjonowania. Ta przenośna technika elektroforezy pozwala rozróżniać edytowane i nieedytowane fragmenty RNA w prosty i opłacalny sposób.

Podejście niesekwencjonujące do szybkiego wykrywania edycji RNA

Przeglądaj więcej filmów