Mapy mikoryzowe jako narzędzie do badania wzorców kolonizacji i strategii grzybów w korzeniach Festuca rubra i Zea mays

Metoda MycoPatt pozwala na dogłębną eksplorację arbuskularnej kolonizacji mikoryzowej w korzeniach. Mapy mikoryzowe wskazują na ekspansję grzybów i przedstawiają rzeczywiste położenie każdej struktury jako określony wzór. Kolonizacja mikoryzowa jest obiektywnie analizowana z rozdzielczością 1%.

Każdy segment korzeniowy jest automatycznie konwertowany na matrycę cyfrową i generuje obszerną bazę danych parametrów kolonizacji. Na początek wyjmij korzenie z lodówki i umieść je na platformie roboczej do rozmrożenia w temperaturze pokojowej. Aby usunąć korzenie, umieść wszystkie korzenie z jednej rośliny w słoiku o pojemności od 30 do 50 mililitrów, a następnie przygotuj 10% roztwór wodorotlenku sodu z wodą z kranu i wlej go do słoika, aż całkowicie zakryje korzenie.

Energicznie potrząsaj słoikiem przez jedną do dwóch minut, aby uzyskać jednorodną dyspersję roztworu klarującego w korzeniach. Pozostaw korzenie w roztworze oczyszczającym przez 48 godzin. Do płukania korzeni przepuść zawartość słoika przez sito.

Opłucz korzenie kilka razy w wodzie z kranu, aż roztwór czyszczący zostanie całkowicie usunięty. Następnie umieść opłukane korzenie w czystym słoiku w celu zabarwienia. Następnie przygotuj pięcio- do pięcioprocentowy roztwór octu atramentowego z wodą z kranu.

Wlej go do słoika, aż przykryje korzenie i potrząsaj nim przez jedną do dwóch minut. Po 48 godzinach w celu częściowego odbarwienia opłucz poplamione korzenie w wodzie z kranu przez jedną do dwóch minut. Energicznie wstrząśnij słoikiem, aby usunąć nadmiar roztworu barwiącego.

Powtarzaj procedurę, aż korzenie będą czyste do oceny mikroskopowej. Aby podzielić korzenie na segmentację, umieść poplamione korzenie na skalowanej desce do krojenia. Pokrój korzenie na jednocentymetrowe segmenty.

Wybierz 15 segmentów dla każdego wariantu. Następnie rozłóż korzenie na szkiełku w celu przygotowania segmentów, za pomocą woreczka do laminowania przykryj korzenie i delikatnie je zmiażdż, zaczynając od krawędzi. Użyj miękkiego plastikowego narzędzia, aby wyświetlić korzenie na szkiełku.

Ostrożnie wyjąć torebkę do laminowania i przykryć próbkę szkiełkiem nakrywkowym. Dodaj wodę do rogu szkiełka za pomocą pipety i pozwól, aby woda powoli rozprowadziła się po szkiełku. Usuń nadmiar wody ręcznikiem papierowym.

Do analizy mikroskopowej należy użyć mikroskopu wyposażonego w kamerę o dobrej rozdzielczości. Przeanalizuj slajdy, zaczynając od końca. Uchwyć każde mikroskopijne pole.

Użyj 10 lub 40-krotnego powiększenia dla grubych korzeni i 40-krotnego dla cienkich korzeni. Po przechwyceniu zmień nazwę każdego obrazu na kod, który pozwoli na prawdziwy post-asemblage części głównych. Użyj oprogramowania do prezentacji, aby zaprojektować deskę kreślarską do montażu obrazów, ustaw szerokość o dwa do trzech centymetrów szerszą niż szerokość obrazu.

Po przechwyceniu 15 obrazów dodaj wszystkie przechwycone obrazy z jednego segmentu w kolejności ich przechwytywania, zaczynając od jednego do 15, i zrekonstruuj całą długość segmentu głównego. Następnie użyj wyrównania w pionie, aby wyrównać obrazy na środku i upewnij się, że każdy obraz podąża za poprzednim. Umieść siatkę 10 na 150 komórek na wszystkich obrazach, aby pokryć cały segment korzenia.

Dodatkowo umieść siatkę 10 na 10 na każdym obrazie iw każdej komórce tej siatki wstaw liczbę od jednego do sześciu, jeśli widoczna jest arbuskularna struktura mikoryzowa lub AM, lub pozostaw puste, jeśli nie ma struktury AM. Dodaj tabelę dla siatki o szerokości 10 komórek i długości 150 komórek. Zmień tabelę z wymiarami na szerokość obrazów, a następnie zmień długość tabeli, aby zawierała wszystkie obrazy.

Aby ocenić kolonizację mikoryzową, użyj unikalnej liczby, aby ocenić każdy typ struktury, zgodnie z opisem w metodzie wzorca mikoryzowego. Użyj jednego na strzępki, dwa na arbuskule, trzy na pęcherzyki, cztery na zarodniki, pięć na komórki pomocnicze i sześć na punkty wejścia. Oceń każdą zaobserwowaną strukturę mikoryzową z każdej komórki wcześniej zastosowanych siatek.

Po zdobyciu punktów wstaw wszystkie uzyskane wyniki do arkusza kalkulacyjnego MycoPatt. Użyj funkcji kopiuj i wklej, aby przenieść wszystkie wyniki z prezentacji do pierwszego arkusza o nazwie Surowe dane. Na potrzeby analizy podstawowej użyj trzeciego arkusza o nazwie Parametry, aby zwizualizować wyniki jako wartości procentowe oddzielnie w trzech formach.

Użyj kolumn od A do K, aby przeanalizować poziomy obraz kolonizacji, kolumn od M do W do pionowego obrazu kolonizacji i kolumn Y do AI, aby przeanalizować kolonizację poprzeczną dla każdego z 15 kwadratów 10 na 10 i ostateczną średnią kolonizacji. Następnie zastosuj definicje i formuły specyficzne dla każdego parametru. W celu produkcji i ekstrakcji map mikoryzowych wizualizuj obraz uzyskany z konwersji kodu struktur mikoryzowych na kolory w drugim arkuszu o nazwie Wykresy.

Następnie wyeksportuj wynikowy obraz w arkuszu wykresu jako obraz i użyj kodu koloru w legendzie, aby przeanalizować wzorce mikoryzowe. W celu analizy mapy mikoryzowej należy zidentyfikować najważniejsze struktury i ich zespół. Następnie opisz wzorzec kolonizacji mikoryzowej obserwowany w analizowanych korzeniach, a następnie strategię kolonizacji opartą na obserwowanym rozwoju strukturalnym korzenia, wzorze rozgałęzień i rozwoju pęcherzyków arbuskularnych.

Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat struktur mikoryzowych z dobrym kontrastem między strukturami mikoryzowymi a komórkami korzeniowymi dla Zea mays i Festal rubra. Nieudane procedury oczyszczania i barwienia spowodowały niewyraźne obrazy mikroskopowe struktur mikoryzowych u Festal rubra i Zea mays. Wzorce kolonizacji mikoryzowej pozwoliły na pełne zbadanie mechanizmu kolonizacji, metoda ta zapewnia głęboką, małoskalową eksplorację wzorców i strategii kolonizacji dla Zea mays i Festuca rubra z dodatkowym wizualnym wyrazem parametrów kolonizacji.

U Zea mays zaobserwowano silnie zmienny potencjał kolonizacyjny w zależności od etapu rozwojowego rośliny, natomiast u Festuca rubra procesy kolonizacyjne zachodzą wewnątrz korzeni, a rozwój sieci strzępkowych był skorelowany z niską szybkością rozwoju korzeni. MycoPatt nadaje się do mapowania arbuskularnej kolonizacji mikoryzowej w dowolnej roślinie. Pomocne jest również pełne zbadanie mechanizmu kolonizacji i ocena strategii grzybów wzdłuż korzeni.