Name: Oczyszczanie ubikwitynowanych białek p53 z komórek ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania ubikwitynowanych białek p53 z komórek ssaków, zachowującą naturalne modyfikacje. Ta technika umożliwia badanie roli ubikwitynacji w regulacji funkcji białkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wsparta grantem z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81972624) dla D.L.

UWAGA: Komórki H1299 zostały uprzejmie dostarczone przez Bank Komórek Macierzystych Chińskiej Akademii Nauk i udowodniono, że są negatywne pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą.
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Do początkowej hodowli umieść 1 x 106 komórek ludzkiej linii komórkowej gruczolakoraka płuc, H1299 na 10-centymetrowej szalce Petriego z 10-12 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% dodatkiem glutaminy, 1% pirogronianem sodu i antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Utrzymać komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 . Dziel komórki co 2-3 dni, w zależności od tego, kiedy osiągną 80%-90% konfluencji.</li>
	<li>Dzień przed transfekcją przygotuj 6-9 x 106 komórek na trzy szalki Petriego i umieść 2-3 x 106 komórek na jednej 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 10-12 ml pożywki, aby osiągnąć zbieżność 70%-90% podczas transfekcji. 
	UWAGA: Komórki HEK293T mogą być również wykorzystywane do oczyszczania ubikwitynowanych białek ze względu na ich wysoką skuteczność transfekcji i poziom ekspresji białka.</li>
</ol>
2. Transfekcja plazmidu
<ol>
	<li>Dodać 1,5 ml zredukowanej pożywki surowicy do trzech probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodaj plazmidowe DNA gotowe do transfekcji do każdej probówki, aby rozcieńczyć w następujący sposób. Rurka 1: 1 μg plazmidu Flag-p53, 12 μg pustego wektora; Probówka 2: 1 μg plazmidu Flag-p53, 3 μg plazmidu His-HA-Ub (HH-Ub) i 9 μg pustego wektora; Probówka 3: 1 μg plazmidu Flag-p53, 3 μg plazmidu HH-Ub i 9 μg plazmidu Mdm2. Dodaj łącznie 0,2 μg plazmidu białka zielonej fluorescencji (GFP) do każdej probówki, aby monitorować wydajność transfekcji. 
	UWAGA: Należy przeprowadzić eksperyment pilotażowy w celu określenia optymalnych ilości plazmidów potrzebnych do osiągnięcia efektywnej ekspresji białka docelowego w komórkach.</li>
	<li>Dodać 78 μl odczynnika do transfekcji liposomów do 4,5 ml zredukowanej pożywki surowicy w innej probówce wirówkowej w celu rozcieńczenia liposomów. Dokładnie wymieszaj, przesuwając probówkę i odstaw na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Dodać 1,5 ml rozcieńczonego roztworu liposomu do każdej probówki z kroku 2.2 zawierającej 1,5 ml rozcieńczonego roztworu DNA. Dokładnie wymieszaj i usieciuj plazmidy z liposomami przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej. Użyj stosunku plazmidowego DNA do liposomów 1:2 (μg:μL) dla każdej transfekcji.</li>
	<li>Odrzucić oryginalną pożywkę z szalek Petriego i dodać 9 ml zredukowanej pożywki surowicy do każdej pożywki. Dodaj 3 ml mieszaniny liposom-DNA do każdego naczynia i wymieszaj roztwór, delikatnie potrząsając płytką w przód iw tył 3x, a następnie w lewo i w prawo 3x, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę na płytce.</li>
	<li>Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . Po 4-6 godzinach należy wymienić pożywkę i kontynuować hodowlę komórek przez 24-36 godzin.</li>
</ol>
3. Kolekcja komórek
<ol>
	<li>Po 24-36 godzinach potraktuj komórki MG132 w końcowym stężeniu 10 μM przez 4-6 godzin, 
	UWAGA: MG132 to aldehyd peptydowy, który skutecznie blokuje aktywność proteolityczną kompleksu proteasomu 26S. Ilości białek ubikwitynowanych łańcuchami poliubikwityny połączonymi lizyną-48 (K48) mogą być zwiększone po potraktowaniu komórek MG132 lub innymi inhibitorami proteasomów.</li>
	<li>Odrzucić pożywkę, umyć komórki 2x (uważając, aby nie wypłukać komórek) lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) i odessać komórki pipetami serologicznymi.</li>
	<li>Dodaj 1 ml PBS do naczynia, usuń komórki przez zeskrobanie czystym skrobakiem i przenieś zawiesinę komórek do probówek mikrowirówek. Wirować przy 700 x g przez 5 minut, aby zebrać granulki komórek.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie ubikwitynowanych białek w warunkach niedenaturujących
<ol>
	<li>Przed użyciem należy przygotować bufor do lizy Flag (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% sarkozylu i 10% glicerolu) świeżo uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Dodać 800 μl lodowatego buforu do lizy Flag do komórek w każdej probówce, wymieszać komórki za pomocą oscylatora wirowego lub pistoletu do pipet, a następnie inkubować mieszaninę na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Poddaj mieszaninę 5-10 krótkim impulsom ultradźwiękowym. Wykonaj ultradźwięki na lodzie z częstotliwością sonikacji 20 kHZ i amplitudą 80%, przy czym każdy impuls trwa 1 s. Inkubować mieszaninę na rotatorze z prędkością 40 obrotów na minutę (obr./min) w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
	<li>Odwirować próbki poddane ultradźwiękom przy 8 000 x g przez 20-30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Podniec 80 μl (1/10) ekstraktu komórkowego i wymieszać z 20 μl 5x dodecylosiarczanu sodu (SDS) buforu ładującego. Gotować próbki w temperaturze 98 °C przez 5 minut, schłodzić na lodzie przez 2 minuty i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Użyj tych próbek jako grupy wejściowej do monitorowania ekspresji białek.</li>
	<li>Dodać 30 μl kulek sprzężonych z przeciwciałami anty-Flag M2 (Flag/M2) do pozostałych ekstraktów komórkowych i inkubować na rotatorze w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 godziny lub przez noc.</li>
	<li>Wirować przy 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu zebrania kulek. Dodaj 1 ml lodowatego buforu do lizy Flag do kulek i wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę.</li>
	<li>Wirować przy 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu zebrania kulek. Powtórz krok 4.7 4-6 razy.</li>
	<li>Dodać 40 μl peptydów Flag o końcowym stężeniu 200 ng/μl do kulek i inkubować na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 2 godziny w celu elucji związanych białek.</li>
	<li>Wirować przy 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 10 μl 5x buforu ładującego SDS, gotować mieszaninę w temperaturze 98 °C przez 5 minut, schłodzić na lodzie przez 2 minuty i przechowywać w temperaturze -20 °C do Western blott. Alternatywnie, eluat z kroku 4.10 należy przechowywać bezpośrednio w temperaturze -80 °C do innych dalszych eksperymentów. 
	UWAGA: Ilość oczyszczonych ubikwitynowanych białek można zwiększyć poprzez zwiększenie liczby komórek i ilości transfekowanych plazmidów. Strategia znakowania epitopów może być dostosowana do oczyszczania kompleksów komórkowych, które wiążą się specyficznie z ubikwitynowanym p53 w natywnych warunkach oczyszczania. Poprzez jednoczesną ekspresję Flag-p53, mdm2 i HA-ubikwityny, ubikwitynowany kompleks białkowy p53 może być immunoprecypitowany przez sekwencyjną agarozę sprzężoną z przeciwciałami Flag i HA z komórek ssaków. Aby zachować partnerów wiążących ubikwitynowane białka p53, podczas procesu oczyszczania należy stosować mniej rygorystyczny bufor do lizy BC100 (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% glicerolu, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 i 1x inhibitor proteazy). Eluat z peptydu HA poddaje się spektrometrii mas w celu zidentyfikowania wszystkich partnerów, którzy wiążą się specyficznie z ubikwitynowanym p53.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie ubikwitynowanych białek w warunkach denaturacji
<ol>
	<li>Dodaj 1 ml lodowatego PBS do granulek komórek otrzymanych w kroku 3.3 i równomiernie wymieszaj. Podwielokrotność 100 μl (1/10 objętości) zawiesiny komórek do probówki mikrowirówkowej jako próbki wejściowej.</li>
	<li>Wirować przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania granulek komórek. Dodać 80 μl buforu do lizy Flag do próbki wejściowej, wymieszać komórki za pomocą oscylatora wirowego lub pistoletu do pipetowania i lizować komórki na lodzie przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wirować przy 8 000 x g przez 20-30 minut w temperaturze 4 °C. Porcjować 80 μl supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 20 μl buforu ładującego 5x SDS do supernatantu, gotować w temperaturze 98 °C przez 5-10 minut, schłodzić na lodzie przez 2 minuty i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Odwirować pozostałe 900 μl zawiesiny komórek o sile 700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania osadu komórkowego. Dodać 1 ml buforu ubikwityny 1 (bufor UB 1; 6 M guanidyna-HCI, 0,1 M Na2HPO4, 6,8 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) i 0,2% Triton X-100, świeżo uzupełniony 10 mM β-merkaptoenolem i 5 mM imidazolem) do granulek komórek i kilkakrotnie wymieszać, pipetując w górę iw dół, aby równomiernie rozprowadzić komórki. 
UWAGA: Stężenie imidazolu może wahać się od 5 mM do 20 mM w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania białek z żywicą naładowaną niklem. Bufor ubikwityny zawiera chlorowodorek guanidyny, który inaktywuje zarówno ligazy, jak i DUB. β-merkaptoetanol jest klarowną, bezbarwną cieczą o silnym, nieprzyjemnym zapachu podobnym do zgniłych jaj. Roztwór o wysokim stężeniu spowoduje poważne uszkodzenie błony śluzowej, górnych dróg oddechowych, skóry i oczu. Nosić rękawice i okulary ochronne oraz pracować pod wyciągiem.</li>
	<li>Poddaj lizaty komórkowe 10-20 rundom ultradźwięków, aż roztwór przestanie być lepki. Wykonaj ultradźwięki na lodzie z częstotliwością sonikacji 20 kHZ i amplitudą 80%, przy czym każdy impuls trwa 1 s. Wirować przy 8 000 x g przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej i przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 30 μl żywicy naładowanej niklem do supernatantu i inkubować na rotatorze ustawionym na 15 obr./min przez 4 godziny lub przez noc w temperaturze pokojowej. Wirować przy 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu zebrania kulek.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu UB 1, inkubować z rotacją w wytrząsarce przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odwirować przy 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu zebrania kulek.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu ubikwityny 2 (bufor UB 2; 8 M mocznika, 0,1 M Na2HPO4, 6,8 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) i 0,2% Triton X-100) do kulek, inkubować z rotacją w wytrząsarce przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odwirować przy 1 500 x g przez 2 minuty w celu zebrania kulek. Powtórz to jeszcze raz.</li>
	<li>Do kulek dodać 1 ml PBS, inkubować z rotacją w wytrząsarce przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odwirować przy 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu zebrania kulek. Powtórz to jeszcze raz.</li>
	<li>Elutować związane białka przez inkubację kulek z 40 μl imidazolu w końcowym stężeniu 0,5 M przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wirować przy 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrowirówki, dodać 10 μl buforu ładującego 5x SDS, gotować w temperaturze 98 °C przez 5 minut, schłodzić na lodzie przez 2 minuty i przechowywać w temperaturze -20 °C do Western blot. Alternatywnie, nieprzetworzony eluat należy przechowywać w temperaturze -80 °C do celów innych dalszych doświadczeń.</li>
</ol>
6. Wykrywanie oczyszczonych białek ubikwitynowanych przez Western blotting
<ol>
	<li>Roztwory próbek z etapów 4.11 i 5.12 należy rozpuścić za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), a następnie przenieść je do membrany nitrocelulozowej metodą Western blot w celu wykrycia docelowych białek przy użyciu odpowiednich przeciwciał, jak opisano18.</li>
	<li>Krótko mówiąc, inkubować membranę, zanurzając w 20 ml roztworu blokującego zawierającego 5% depatowego mleka w proszku w buforze TBST (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-zasada, 150 mM NaCI, świeżo uzupełniony 0,1% Tween-20 przed użyciem) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C. Dla każdego zestawu należy zastosować następujące przeciwciała. Wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe stosowano w rozcieńczeniu 1:1000.
	<ol>
		<li>Wykryć całkowite białko p53, w tym ubikwitynowany p53, za pomocą przeciwciała monoklonalnego anty-p53 po immunoprecypitacji za pomocą kulek agarozy Flag/M2.</li>
		<li>Wykryć ubikwitynowane białka p53 za pomocą przeciwciała anty-HA lub przeciwciała anty-ubikwityny po immunoprecypitacji za pomocą kulek agarozy Flag/M2.</li>
		<li>Wykryj ubikwitynowane białka p53 za pomocą przeciwciała monoklonalnego anty-p53 po usunięciu żywicy naładowanej niklem.</li>
		<li>Wykryj całkowite białko ubikwitynowane za pomocą przeciwciała anty-HA lub przeciwciała anty-ubikwityny po usunięciu żywicy naładowanej niklem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować błonę z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) w RT przez 1 godzinę po przemyciu 3x buforem TBST przez 5 minut każde. Wszystkie przeciwciała drugorzędowe zastosowano w rozcieńczeniu 1:3000. Następnie przemyć membranę buforem TBST 3x po 5 minut z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Uruchom system obrazowania chemiluminescencyjnego, aby wykryć sygnały z Western blotting. Przygotować roztwór substratu dla HRP, mieszając roztwory A i B w stosunku 1:1.</li>
	<li>Umieść membranę nitrocelulozową w camera obscura stroną do góry i równomiernie pokryj roztwór podłoża na membranie za pomocą pistoletu do pipetowania. Wybierz procedurę automatycznej ekspozycji, aby uchwycić sygnały chemiluminescencyjne i ręcznie dostosuj czas ekspozycji, aż do uzyskania idealnego sygnału.</li>
</ol>

<ol><li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+Structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li>
<li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li>
<li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li>
<li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery%3A+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li>
<li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+the+p53+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li>
<li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+and+Tumor+suppression%3A+It+takes+a+network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li>
<li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li>
<li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+by+the+light%3A+The+growing+complexity+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li>
<li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+ubiquitination%3A+Mdm2+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+modifications%3A+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li>
<li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2%3A+Open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li>
<li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-+versus+polyubiquitination%3A+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li>
<li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li>
<li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+M+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual.+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition)</a>. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28(2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Ubikwitynacja odgrywa kluczową rolę w prawie wszystkich fizjologicznych i patologicznych procesach komórkowych2. W ostatnich latach poczyniono ogromne postępy w zrozumieniu molekularnej roli ubikwityny w szlakach sygnałowych oraz tego, w jaki sposób zmiany w układzie ubikwityny prowadzą do różnych chorób u ludzi2. Oczyszczanie ubikwitynowanych białek przyczynia się do uzyskania wglądu w dokładne role ubikwitynacji w tych procesach. Mieszaniny białek sprzężonych z ubikwityną...

Ubikwityna jest ewolucyjnie konserwatywnym białkiem składającym się z 76 aminokwasów1,2,3. Ubikwityna kowalencyjnie wiąże reszty lizyny na białkach docelowych poprzez kaskady obejmujące enzymy aktywujące (E1), sprzężone (E2) i ligazy (E3). Ubikwityna jest najpierw aktywowana przez enzym E1, a następnie przenoszona do enzymów sprzężonych z E2. Następnie ligazy ubikwityny E3 oddziałują zarówno z enzymami E2 załadowanymi ubikwityną, jak i białkami substratowymi oraz pośredniczą w tworzeniu wiązania izopeptydowego między C-końcem ubikwityny a resztą lizyny w podłożu1,2,3,4,5. Ubikwitynacja polega na przyłączaniu się ugrupowań ubikwityny do reszt lizyny na białkach substratu lub do siebie samej, co prowadzi do monoubikwitynacji białek lub poliubikwitynacji. Ten proces ubikwitynacji zachodzi wewnątrzkomórkowo u eukariontów i reguluje wiele różnych procesów biologicznych. Ubikwitynacja powoduje degradację białek substratowych poprzez układ ubikwityna-proteasom1,2,3,4,5. Ponadto ubikwitynacja moduluje subkomórkową lokalizację białek, tworzenie kompleksów białkowych i transport białek w komórkach3,5. Ugrupowania ubikwityny zligowane do białek substratowych mogą być usuwane przez enzymy deubikwitynujące (DUB)6,7. Warto zauważyć, że różne sposoby, w jakie łańcuchy ubikwityny są łączone, zapewniają niezliczone środki do regulowania różnych procesów biologicznych1,5. Dokładna rola ubikwitynacji w regulacji funkcji białek substratowych pozostaje do tej pory nie w pełni poznana. Oczyszczanie ubikwitynowanych białek przyczynia się do wyjaśnienia wpływu ubikwitynacji białek na różne procesy komórkowe.
Białko p53 jest jednym z najważniejszych białek supresorowych nowotworów i wykazuje mutacje genetyczne lub inaktywację w prawie wszystkich nowotworach u ludzi8,9,10,11. Stabilność i aktywność p53 są delikatnie regulowane in vivo przez modyfikacje potranslacyjne, w tym ubikwitynację, fosforylację, acetylację i metylację12,13. Białko p53 ma krótki okres półtrwania wynoszący od 6 min do 40 min w różnych komórkach, co wynika głównie z jego poliubikwitynacji i późniejszej degradacji proteasomalnej10,12. Mysz podwójna minuta 2 (Mdm2) to ligaza ubikwityny E3 p53, która wiąże się z N-końcem p53, aby zahamować jego aktywność transkrypcyjną12,14,15. Mdm2 promuje poliubikwitynację i degradację proteasomalną p53 w celu kontrolowania jego stabilności i indukuje monoubikwitynację p53, aby ułatwić jego eksport jądrowy12,14,15,16. W tym przypadku ubikwitynacja p53 za pośrednictwem Mdm2 jest używana jako przykład w celu szczegółowego przedstawienia metody oczyszczania ubikwitynowanych białek z komórek ssaków. Regulatory, które wpływają na status ubikwitynacji białek docelowych, można zidentyfikować za pomocą tego testu ubikwitynacji in vivo, gdy są one nadmiernie eksprymowane lub powalone/znokautowane w komórkach ssaków. Ponadto białka ubikwitynowane mogą być stosowane jako substraty do testów deubikwitynacji in vitro. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe można przeprowadzić w celu zidentyfikowania specyficznych DUB dla białek docelowych poprzez inkubację ubikwitynowanych substratów z pojedynczymi DUB. Ubikwitynowane białka mogą działać jak rusztowanie do rekrutacji dalszych białek sygnałowych w komórkach. Ubikwitynowany kompleks białek docelowych może być oczyszczony przez sekwencyjną immunoprecypitację w natywnych warunkach oczyszczania i zidentyfikowany za pomocą spektrometrii mas. Obecny protokół może być szeroko stosowany do badania białek komórkowych regulowanych przez ubikwitynację.
Ustalono kilka metod oczyszczania białek ubikwitynowanych, które obejmują użycie ubikwityny oznaczanej powinowactwem, przeciwciał ubikwityny, białek wiążących ubikwitynę oraz izolowanych domen wiążących ubikwitynę (UBD)17. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystujący ubikwitynę znakowaną powinowactwem jako mediator do oczyszczania ubikwitynowanych białek w komórkach ssaków. Zastosowanie ubikwityny znakowanej poli-Hisem ma przewagę nad innymi metodami. Ubikwitynowane białka są oczyszczane w obecności silnych denaturantów, co zmniejsza niespecyficzne wiązanie z żywicą naładowaną niklem poprzez linearyzację białek komórkowych i zakłócanie interakcji białko-białko. W przeciwieństwie do tego, stosowanie przeciwciał przeciwko ubikwitynie, białek wiążących ubikwitynę i izolowanych UBD jako mediatorów nie może skutecznie wykluczyć partnerów wiążących z białka docelowego, ponieważ oczyszczanie musi być przeprowadzane w mniej rygorystycznych warunkach. Co więcej, oczyszczanie może również prowadzić do zwiększonego wiązania niepowiązanych białek za pomocą tych mediatorów. Ponadto istnieje skłonność do wiązania różnych typów wiązań ubikwityny, a także mono- i poliubikwitynacji przez białka wiążące ubikwitynę lub izolowane UBDs17. Stosowanie ubikwityny znakowanej poli-Hisem przyczynia się do obniżenia wszystkich komórkowych białek ubikwitynowanych. Alternatywnie, zastosowanie dostępnej na rynku agarozy sprzężonej z przeciwciałami anty-Flag lub anty-HA ułatwia immunoprecypitację białek docelowych znakowanych Flagą lub HA na dużą skalę w warunkach niedenaturujących. Drugi etap oczyszczania, na przykład za pomocą żywicy naładowanej niklem ukierunkowanej na ubikwitynę znakowaną poli-His, może być wykorzystany do uzyskania ubikwitynowanych białek docelowych o wysokiej czystości do dalszych eksperymentów. Warto zauważyć, że strategia oczyszczania znakowania epitopów może być dostosowana, gdy nie można uzyskać określonego przeciwciała w celu skutecznego immunoprecypitacji białek docelowych. Wreszcie, oczyszczanie ubikwitynowanych białek w komórkach ssaków, w porównaniu z oczyszczaniem in vitro, zachowuje tryb wiązania ubikwityny białek docelowych w bardziej fizjologicznych warunkach.

<table><tbody><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sangon Biotech</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL IgG Myszy, cały Ab sprzężony z HRP (od owiec)</td><td>GE opieka zdrowotna</td><td>NA931</td><td>Wtórny antybdoy</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rat IgG, cały Ab sprzężony z HRP (od osła)</td><td>GE opieka zdrowotna</td><td>NA935</td><td>Wtórny antybdoy</td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>Koraliki FLAG/M2</td></tr><tr><td>Przeciwciało mono-colonalne anty-GFP</td><td>Santa cruz</td><td>sc-9996</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>anty-HA Przeciwciało</td><td>pierwszorzędowe</td><td>Roche</td><td>11867423001</td> o wysokim powinowactwie Przeciwciało</tr><tr><td>mono-okrężnicowe anty-Mdm2 (SMP14)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-965</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało jednookrężnicowe anty-p53 (DO-1)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-126</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Alddich</td><td>E5134</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS FLAG Peptyd</td><td>Sigma-Alddich</td><td>F3290</td><td>Przygotuj bufor elucyjny</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>suplement</td></tr><tr><td>Guanidine-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100287-0500</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>H1299</td><td>Bank Komórek Macierzystych, Chińska Akademia Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab</td><td>Oprogramowanie</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Immidazole</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0100</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki Lipofectamine 2000 Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Transfection</td></tr><tr><td>MG132</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-13259</td><td>Inhibitor proteasomu</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Rozpuszczalnik Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr>NaF <td>Sigma-Alddich</td><td>201154</td><td></td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td></td><td>Rozpuszczalnik Sangon Biotech</td><td>A501726-0500</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza Ni-NTA Żywica</td> niklowa <td>QIAGEN</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa Błona bibułkowa</td><td>GE healthcare</td><td>10600002</td><td>0,45 & mikro; m wielkość porów</td></tr><tr><td>Opti-MEM zredukowana pożywka surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Pożywka transfekcyjna</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-cv</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny Sangon</td><td>Biotech</td><td>E607011-0100</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>01-100-1ACS</td><td>medium</td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Sigma-Alddich</td><td>L5777</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>SDS Bufor ładujący</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>suplement</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501492-0005</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Tris-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610103-0250</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Triton Odczynnik X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A110694-0500</td><td></td></tr><tr><td>Suplement Tween-20</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100777-0500</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania chemiluminescencji o ultra wysokiej czułości</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>ChemiDoc XRS+</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Rozpuszczalnik Sangon Biotech</td><td>A510907-0500</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie ubikwitynowanych białek p53 z komórek ssaków

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubikwitynacja to rodzaj modyfikacji potranslacyjnej, która reguluje nie tylko stabilność, ale także lokalizację i funkcję białka substratowego. Proces ubikwitynacji zachodzi wewnątrzkomórkowo u eukariontów i reguluje prawie wszystkie podstawowe komórkowe procesy biologiczne. Oczyszczanie ubikwitynowanych białek pomaga w badaniu roli ubikwitynacji w kontrolowaniu funkcji białek substratowych. W tym miejscu opisano krok po kroku procedurę oczyszczania ubikwitynowanych białek w komórkach ssaków na przykładzie białka supresorowego guza p53. Ubikwitynowane białka p53 oczyszczono w rygorystycznych warunkach niedenaturacji i denaturacji. Całkowite komórkowe białko p53 znakowane Flagą oczyszczono agarozą sprzężoną z przeciwciałami anty-Flag w warunkach niedenaturujących. Alternatywnie, całkowite komórkowe ubikwitynowane białko znakowane Hisem oczyszczono przy użyciu żywicy naładowanej niklem w warunkach denaturacji. Ubikwitynowane białka p53 w eluatach udało się wykryć za pomocą specyficznych przeciwciał. Za pomocą tej procedury ubikwitynowane formy danego białka mogą być skutecznie oczyszczane z komórek ssaków, co ułatwia badania nad rolą ubikwitynacji w regulacji funkcji białka.

Schemat przedstawia białka p53 z tagiem Flag (Flag-p53) oraz ubikwitynę z podwójnym tagiem His/HA (HH-Ub) (Rysunek 1A). Procedury wykorzystane do oczyszczania białek ubikwitynowanych podsumowano na Rysunku 1B. Ubikwityna z tagiem Poly-His może być przyłączana do białek docelowych w komórkach ssaków. Białka ubikwitynowane można oczyszczać za pomocą kulek Flag/M2 w warunkach niedenaturujących lub metodą chromatografii powinowactwa do zjonizowanych metali (IMAC) w ...

Protokół opisuje krok po kroku metodę oczyszczania ubikwitynowanych białek z komórek ssaków na przykładzie białka supresorowego p53. Ubikwitynowane białka p53 oczyszczono z komórek w rygorystycznych warunkach niedenaturacji i denaturacji.

Oczyszczanie ubikwitynowanych białek p53 z komórek ssaków

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Korzystając z tego protokołu, ubikwitynowane formy danego białka mogą być skutecznie oczyszczane z komórek ssaków, co ułatwia badania nad rolą ubikwitynacji w regulacji funkcji białka. Oczyszczanie ubikwitynowanych białek w komórkach ssaków w porównaniu z oczyszczaniem in vitro zachowuje tryb wiązania ubikwityny białek docelowych w bardziej radiologicznych warunkach. Zacznij od dodania 1,5 mililitra zredukowanej pożywki surowicy do trzech 15-mililitrowych probówek wirówkowych.Dodaj plazmidowe DNA gotowe do transfekcji do każdej probówki i dodaj 0,2 mikrograma plazmidu białka zielonej fluorescencji, aby monitorować wydajność transfekcji. Dodaj 78 mikrolitrów odczynnika do transfekcji liposomów do 4,5 mililitra zredukowanej pożywki surowicy w innej probówce wirówkowej, aby rozcieńczyć liposomy. Dokładnie wymieszaj, przesuwając probówkę, a następnie odstaw na pięć minut w temperaturze pokojowej.Dodaj 1,5 mililitra rozcieńczonego roztworu liposomu do każdej probówki zawierającej 1,5 mililitra rozcieńczonego roztworu DNA. Dokładnie wymieszaj i usieciuj plazmidy z liposomami przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić oryginalną pożywkę z szalek Petriego i dodać dziewię

purification-of-ubiquitinated-p53-proteins-from-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Ten film opisuje metodę ekstrakcji i oczyszczania ubikwitynylowanych peptydów zawierających pozostałości peptydów di-glicyny ze złożonej mieszaniny peptydów. Przedstawiona metoda może pomóc w identyfikacji pierwotnych miejsc ubikwitynacji w białku.

Ekstrakcja peptydów ubikwitynylowanych na podstawie powinowactwa immunologicznego: technika selektywnej ekstrakcji peptydów oznaczonych ubikwityną z oczyszczonych frakcji peptydowych

Opisana tutaj metoda to nowy protokół izolacji pęcherzyków, który pozwala na oczyszczanie przedziałów komórkowych, w których egzogenne antygeny są przetwarzane przez degradację związaną z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej.

Oczyszczanie przedziału błony w celu degradacji antygenów egzogennych związanych z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej

W przeciwieństwie do ligaz ubikwityny, zidentyfikowano kilka ligaz E3 SUMO. Ten zmodyfikowany protokół SUMOylacji in vitro jest w stanie zidentyfikować nowe ligazy SUMO E3 za pomocą testu rekonstytucji in vitro.

In vitro Test SUMOylacji do badania aktywności ligazy SUMO E3

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ubikwitynacja to modyfikacja potranslacyjna, która odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych i jest ściśle koordynowana przez deubikwitynację. Defekty w obu reakcjach leżą u podstaw ludzkich patologii. Udostępniamy protokoły do przeprowadzania reakcji ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych składników.

Testy ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro histonów nukleosomalnych

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Ta metoda opisuje ocenę globalnych zmian w topologii łańcucha ubikwityny. Ocena jest przeprowadzana poprzez zastosowanie ukierunkowanego podejścia proteomicznego opartego na spektrometrii mas.

Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Ubikwitynacja jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych w komórkach ssaków oraz porównujemy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji. Nadekspresja białek w HEK293T komórkach została wywołana przejściową transfekcją, a białka ubikwitynowane wykryto analizą western blota.

Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu

Protokół ten opisuje metodę ubikwitynacji Streptococcus pneumoniae przy użyciu lizatu komórek ssaków lub czystego kompleksu enzymów ubikwityny, a następnie leczenie oczyszczonym kompleksem białkowym VCP/p97-UFD1-NPLOC4 w celu oceny aktywności bakteriolitycznej, umożliwiającej badanie efektorów immunologicznych zależnych od ubikwityny.

In vitro Rekonstrukcja ubikwitynacji bakteryjnej i eliminacja pośredniczona przez VCP/p97

Poznaj metodę oczyszczania ubikwitynowanych białek p53 z komórek ssaków, zachowującą naturalne modyfikacje. Ta technika umożliwia badanie roli ubikwitynacji w regulacji funkcji białkowej.

Oczyszczanie ubikwitynowanych białek p53 z komórek ssaków

Przeglądaj więcej filmów