Oczyszczanie ubikwitynowanych białek p53 z komórek ssaków

Korzystając z tego protokołu, ubikwitynowane formy danego białka mogą być skutecznie oczyszczane z komórek ssaków, co ułatwia badania nad rolą ubikwitynacji w regulacji funkcji białka. Oczyszczanie ubikwitynowanych białek w komórkach ssaków w porównaniu z oczyszczaniem in vitro zachowuje tryb wiązania ubikwityny białek docelowych w bardziej radiologicznych warunkach. Zacznij od dodania 1,5 mililitra zredukowanej pożywki surowicy do trzech 15-mililitrowych probówek wirówkowych.

Dodaj plazmidowe DNA gotowe do transfekcji do każdej probówki i dodaj 0,2 mikrograma plazmidu białka zielonej fluorescencji, aby monitorować wydajność transfekcji. Dodaj 78 mikrolitrów odczynnika do transfekcji liposomów do 4,5 mililitra zredukowanej pożywki surowicy w innej probówce wirówkowej, aby rozcieńczyć liposomy. Dokładnie wymieszaj, przesuwając probówkę, a następnie odstaw na pięć minut w temperaturze pokojowej.

Dodaj 1,5 mililitra rozcieńczonego roztworu liposomu do każdej probówki zawierającej 1,5 mililitra rozcieńczonego roztworu DNA. Dokładnie wymieszaj i usieciuj plazmidy z liposomami przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić oryginalną pożywkę z szalek Petriego i dodać dziewięć mililitrów zredukowanej pożywki surowicy do każdej pożywki.

Dodaj trzy mililitry mieszaniny liposomowego DNA i wymieszaj roztwór, delikatnie potrząsając płytką w przód iw tył trzy razy, a następnie trzy razy w lewo i w prawo, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę na płytce. Hoduj komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Wymień pożywkę po czterech do sześciu godzinach i kontynuuj hodowlę komórek przez 24 do 36 godzin.

Po 24 do 36 godzinach należy traktować komórki MG132 w końcowym stężeniu 10 mikromolów przez cztery do sześciu godzin. Wyrzuć pożywkę i umyj komórki dwa razy lodowatym PBS. Dodaj jeden mililitr PBS do naczynia.

Usuń komórki, zeskrobując je czystym skrobakiem i przenieś zawiesinę komórek do probówek do mikrowirówek. Wirować przy 700 G przez pięć minut, aby zebrać granulki komórek. Dodaj 800 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy FLAG uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy do komórek w każdej probówce.

Wymieszaj komórki za pomocą oscylatora wirowego lub pistoletu do pipet, a następnie inkubuj mieszaninę na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Ultradźwiękowo mieszaninę na lodzie z każdym impulsem trwającym jedną sekundę i poddać mieszaninę pięciu do 10 krótkich impulsów. Inkubować mieszaninę na rotatorze z prędkością 40 obr./min przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie odwirować próbki poddane ultradźwiękom w temperaturze 8 000 G przez 20 do 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Podajcie 80 mikrolitrów ekstraktu komórkowego i wymieszajcie z 20 mikrolitrami buforu ładującego 5X SDS.

Gotuj próbki w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez pięć minut. Schłodzić na lodzie przez dwie minuty i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. Użyj tych próbek jako grupy wejściowej do monitorowania ekspresji białek.

Następnie dodaj 30 mikrolitrów kulek sprzężonych z przeciwciałem anty-FLAG M2 do pozostałych ekstraktów komórkowych i inkubuj na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny lub noc. Wirować przy 1 500 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać kulki. Dodaj jeden mililitr lodowatego buforu do lizy FLAG do kulek i wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę.

Powtórz ten krok cztery do sześciu razy, a następnie dodaj 40 mikrolitrów peptydów FLAG o końcowym stężeniu 200 nanogramów na mikrolitr do kulek. Inkubować na rotatorze przez dwie godziny, jak pokazano wcześniej, a następnie odwirować w tej samej temperaturze. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki i dodać 10 mikrolitrów buforu ładującego 5X SDS.

Gotuj mieszaninę w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie ostudź na lodzie przez dwie minuty. Dodaj jeden mililitr lodowatego PBS do granulek komórek i równomiernie wymieszaj. Podwielokrotność 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do probówki do mikrowirówki jako próbki wejściowej i odwirować w temperaturze 700 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu zebrania granulek komórek.

Dodaj 80 mikrolitrów buforu do lizy FLAG do próbki wejściowej i wymieszaj komórki za pomocą oscylatora wirowego, jak pokazano wcześniej. Lizować komórki na lodzie przez godzinę, a następnie ponownie odwirować przez 20 do 30 minut. Po odcentrowaniu podamy 80 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki i dodamy do supernatantu 20 mikrolitrów buforu ładującego 5X SDS.

Gotuj mieszaninę w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut, a następnie ostudź na lodzie przez dwie minuty. Odwirować pozostałe 900 mikrolitrów zawiesiny komórek o sile 700 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać osad komórkowy. Dodaj jeden mililitr buforu ubikwityny 1 do granulek komórek i wymieszaj, pipetując kilka razy w górę iw dół, aby równomiernie rozprowadzić komórki.

Poddaj lizaty komórkowe 10 do 20 rundom ultradźwięków na lodzie, aż roztwór przestanie być lepki, a następnie odwiruj roztwór. Przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej i dodać 30 mikrolitrów żywicy naładowanej niklem do supernatantu. Inkubować na rotatorze z prędkością 15 obr./min przez cztery godziny lub przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przez dwie minuty.

Po centryfuzji zbierz kulki i dodaj do nich jeden mililitr buforu ubikwityny 1. Inkubować z rotacją w wytrząsarce przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie odwirować przy 1,500 G przez dwie minuty, jak pokazano powyżej. Dodaj jeden mililitr buforu ubikwityny 2 do kulek i wykonaj inkubację, a następnie odwirowanie, jak pokazano wcześniej, w celu zebrania kulek.

Powtórz ten krok raz. Następnie dodaj jeden mililitr PBS do kulek i postępuj zgodnie z tą samą procedurą inkubacji i wirowania w celu zebrania kulek. Powtórz ten krok jeszcze raz.

Elutować związane białka przez inkubację kulek z 40 mikrolitrami imidazolu w końcowym stężeniu 0,5 mola przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji ponownie odwirować przy 1,500 G przez dwie minuty. Przenieść supernatant do czystej probówki mikrowirówki i dodać 10 mikrolitrów buforu ładującego 5X SDS.

Gotuj roztwór w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie ostudź go na lodzie przez dwie minuty. Roztwory należy rozpuścić metodą SDS-PAGE, a następnie przenieść je do membrany nitrocelulozowej metodą western blotting w celu wykrycia docelowych białek przy użyciu odpowiednich przeciwciał. Uruchom system obrazowania chemiluminescencyjnego, aby wykryć sygnały z western blotting.

Umieść membranę nitrocelulozową w camera obscura przodem do góry. Zakoduj roztwór substratu równomiernie na membranie za pomocą pistoletu do pipet. Na koniec wybierz procedurę automatycznej ekspozycji, aby uchwycić sygnały chemiluminescencyjne i ręcznie dostosuj czas ekspozycji, aż do uzyskania idealnego sygnału.

Całkowite białko p53, w tym ubikwitynowany p53, poddano immunoprecypitacji kulkami FLAG M2 z komórek H1299 w warunkach niedenaturujących. Eluat poddano Western blot z anty p53 i anty hemaglutyniną lub z przeciwciałami anty p53 i monoklonalnymi. W tym przypadku surowe ekstrakty komórkowe lub dane wejściowe poddano Western Blot z przeciwciałami monoklonalnymi anty p53 i anty MDM2.

Sygnał z ubikwitynowanego białka p53, które pojawia się jako rozmazane pasmo od niskiej do wysokiej masy cząsteczkowej, był znacznie zwiększony, gdy MDM2 ulegał ektopowej ekspresji w tych komórkach. Wynik ten sugeruje, że ubikwitynowane białko p53 zostało skutecznie oczyszczone z komórek. Następnie komórki poddano lizie w warunkach denaturacji.

Całkowite białka ubikwitynowane w komórkach zostały ściągnięte w dół za pomocą żywicy naładowanej niklem, a następnie poddano Western blot z przeciwciałami monoklonalnymi anty p53 i anty hemaglutyniną. Ubikwitynowane białko p53 wykryto przy użyciu przeciwciała anty p53 i przeciwciała przeciwko hemaglutyninie. Tutaj, w surowym roztworze komórek, ekstrakty lub dane wejściowe poddano Western Blot z przeciwciałami monoklonalnymi anty p53 i anty MDM2.

Wyniki wykazały, że całkowity poziom ubikwitynowanego białka pozostał niezmieniony, ale poziom ubikwitynowanego białka p53 dramatycznie wzrósł po nadekspresji MDM2 w tych komórkach. Wskazuje to, że całkowite białka ubikwityny zawierające ubikwitynowany p53 zostały skutecznie ściągnięte z lizatów komórkowych w warunkach denaturacji. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o potraktowaniu komórek MG132 przed pobraniem komórek i prawidłowym ultradźwiękom komórek na lodzie w celu oczyszczenia ubikwitynowanych białek.