Cyfrowe profilowanie przestrzenne w celu scharakteryzowania mikrośrodowiska w rozlanym glejaku naciekającym typu dorosłego

Cyfrowe profilowanie przestrzenne (DSP) oferuje wydajną metodę przestrzennego warstwowego oznaczania ilościowego białek. Jego implementacja pozwala nam scharakteryzować ekspresję białek w różnych regionach guza i mikrośrodowisku. Kluczową cechą procesora DSP jest jego zdolność do multipleksowania, umożliwiająca przetwarzanie danych o wysokiej przepustowości.

Możliwość definiowania niestandardowych obszarów zainteresowania dodatkowo zapewnia przestrzenny wymiar analizy danych. DSP można zastosować do dowolnej próbki, w której przestrzenna kwantyfikacja ekspresji białka lub RNA może pomóc w wyjaśnieniu procesu patologicznego lub fizjologicznego. Jest to szczególnie istotne w onkologii, gdzie regionalna zmienność celu może korelować ze złośliwym wzrostem lub inwazją.

Procedurę zademonstrują Scott Palisoul, histotechnolog i Rachael Barney, technolog genomiczny. Aby przygotować preparaty, zacznij od pobrania kilku dwumilimetrowych rdzeni z każdej biopsji i umieszczenia ich w jednym bloku mikromacierzy tkankowej. Wytnij czteromikronowe odcinki z bloku i zamontuj je na szkiełkach.

Umieść każde szkiełko w uszczelce uchwytu szkiełka i inkubuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut. W półautomatycznym systemie IHC napełnij pojemnik w pozycji pierwszej 150 mikrolitrami buforu myjącego na szkiełko plus pięć mililitrów objętości martwej i pozostaw pokrywę otwartą. Napełnij taką samą ilość roztworu blokującego w pojemniku w pozycji drugiej.

Załaduj tacę pojemnika na odczynnik na maszynę. Wybierz opcję Process IHC, a następnie nazwę rozwiązania blokującego w polu rozwijanym w polu Marker. Po zakończeniu dla wszystkich slajdów kliknij Zamknij.

Następnie kliknij Drukuj etykiety i zaznacz Wszystkie etykiety slajdów, które nie zostały jeszcze wydrukowane, a następnie kliknij Drukuj. Przyklej etykiety na górze slajdów. Załaduj szkiełka na tacę na szkiełka, upewniając się, że próbka i etykieta są skierowane do góry.

Naciśnij przycisk LED, aby opuścić tacę i pozwól instrumentowi rozpocząć skanowanie i rozpoznawanie slajdów. Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć eksperyment. Po zakończeniu biegu naciśnij przycisk LED, gdy zacznie migać na zielono.

Wyjmij tacę z instrumentu i ostrożnie podnieś płytki pokrywy z każdego slajdu. Umieść szkiełka w 1X buforowanym fosforanem soli fizjologicznej. Usuń nadmiar buforu i obrysuj każdy fragment tkanki hydrofobowym pisakiem, aby stworzyć barierę hydrofobową.

Przygotuj roztwór oligo przeciwciała PC, dodając osiem mikrolitrów każdego przeciwciała na szkiełko i używając buforu W, aby osiągnąć końcową objętość 200 mikrolitrów. Następnie nałóż roztwór oligo przeciwciała PC na szkiełka i inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji umieść szkiełka na nawilżonej tacy i umyj trzykrotnie przez 10 minut w 1X TBST.

Po utrwaleniu w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotne mycie przez pięć minut w 1X TBST. Dodaj plamę jądrową SYTO 13 na 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umyj dwukrotnie 1X TBST. Najedź kursorem myszy na Zbieranie danych w Centrum sterowania i wybierz Nowy lub Kontynuuj uruchamianie.

Umieść szkiełko w uchwycie na suwak etykietą skierowaną w stronę użytkownika. Opuść tacę ślizgową clamp, upewniając się, że tkanka jest widoczna w wydłużonym okienku. Dodaj sześć mililitrów buforu S.Postępuj zgodnie z instrukcjami w Centrum sterowania.

Powiększaj między różnymi osiami za pomocą suwaków x i y, aby wyznaczyć region do skanowania. Wybierz opcję Skanuj i pozwól na kontynuowanie skanowania do momentu, gdy cały zdefiniowany obszar docelowy zostanie zobrazowany. Wygeneruj obraz 20 razy.

Zdefiniuj ROI, wybierając trzy okrągłe ROI o jednakowej wielkości i średnicy 250 mikrometrów dla każdego rdzenia tkanki. Zatwierdź zwrot z inwestycji, klikając przycisk Wyjdź z obszaru roboczego skanowania. Następnie poczekaj, aż światło UV odetnie oligonukleotydy od przeciwciał.

Po zakończeniu procesu czyszczenia urządzenia wybierz opcję Nowa kolekcja danych, aby kontynuować pracę z bieżącymi slajdami lub płytą. Otwórz okno sfinalizowanej płyty, klikając dwukrotnie obszar ikony Płyta. Wprowadź numer partii pakietu kodu hybrydyzacji i kliknij przycisk Aktualizuj.

Następnie kliknij Finalizuj. Odłącz uchwyt suwaka i płytkę zbiorczą, postępując zgodnie z instrukcjami. Szkiełka należy przechowywać w TBST lub przykryć je roztworem wodnym i szkiełkiem nakrywkowym w celu długotrwałego przechowywania.

Uszczelnij płytki za pomocą przepuszczalnej uszczelki i wysusz aspiraty w temperaturze 65 stopni Celsjusza w termocyklerze z otwartą górą. Dodaj siedem mikrolitrów wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu i wymieszaj. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie szybko odwirować.

Przygotuj mieszaninę sondy, wybierając odpowiednie równania sondy R i sondy U, stosując równanie zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj 84 mikrolitry mieszanki sondy do każdego pakietu kodów hybrydyzacji. Na świeżej 96-dołkowej płytce do hybrydyzacji dodaj osiem mikrolitrów każdej głównej mieszanki kodu hybrydyzacji do wszystkich 12 dołków wskazanego rzędu.

Przenieść siedem mikrolitrów z płytki zbiorczej DSP do odpowiedniego dołka na płytce hybrydyzacyjnej. Zgrzej płytkę, zakręć płytką i inkubuj ją przez noc w temperaturze 67 stopni Celsjusza. Po inkubacji ostudzić płytkę na lodzie i szybko zawirować.

Zebrać produkty hybrydyzacji z każdej studzienki w probówce paskowej, delikatnie pipetując każdy dołek pięć razy. Zakręć w dół i załaduj rurki paskowe do systemu analizy. Na instrumencie DSP zapisz CDF file na dysku USB i przenieś dane do analizatora cyfrowego.

Na ekranie naciśnij Rozpocznij przetwarzanie. Wybierz opcję Wysoka czułość, a następnie przycisk Dalej. Naciśnij Wybierz wszystko, aby wyświetlić liczbę studzienek z próbkami, następnie Zakończ, a następnie Dalej w powiadomieniu e-mail.

Następnie kliknij Start. Po zakończeniu pracy stacji przygotowawczej uszczelnij wkład i przenieś go do analizatora cyfrowego. Naciśnij przycisk Rozpocznij liczenie.

Wybierz pozycję stołu montażowego. Naciśnij Załaduj istniejący plik CDF i wybierz poprzednio przesłany plik. Naciśnij Gotowe.

Ponownie wybierz pozycję stołu montażowego, naciśnij Gotowe, a następnie Start, aby uruchomić program. Zapisz plik ZIP z plikami konwersji liczby reporterów z systemu analitycznego na dysku USB. Włóż dysk do urządzenia DSP.

W Centrum sterowania DSP najedź kursorem na Zbieranie danych, a następnie kliknij Prześlij konta. Wybierz odpowiedni plik ZIP. Kliknij Rekordy w Centrum sterowania DSP.

Aby wyświetlić skany w kolejce, wybierz opcję Dodaj wybrane skany do kolejki, a następnie pozycję Moja kolejka analizy. Wybierz Nowe badanie z kolejki, najeżdżając kursorem na opcję Analiza danych w Centrum sterowania. Eksperyment DSP przeprowadzono na próbkach glejaka, a wyniki zwizualizowano w postaci mapy cieplnej.

Wiersze reprezentują docelowe białka, a każda kolumna odpowiada regionowi zainteresowania. Poziom ekspresji jest przedstawiany przez zakres kolorów od niebieskiego, pokazującego niską ekspresję, do czerwonego, który oznacza wysoki ekspresję. Zmienność koloru w wierszu odzwierciedla regionalną heterogeniczność białek i sugeruje możliwy związek przestrzenny z różnicową ekspresją białka.

W tym eksperymencie S100 i CD-56 były powszechnie wysokie, ponieważ są markerami neuronalnymi. Markery o największej zmienności obejmują B7-H3, KI-67, CD-44 i fibronektynę, o których wiadomo, że są związane z proliferacją, migracją i przerzutami guza. Z szerokiej gamy potencjalnych celów, DSP może zidentyfikować te, które wykazują znaczną zmienność regionalną.

Stanowi to podstawę do badania czynników związanych ze zmiennością i ich znaczeniem dla choroby.