Name: Cyfrowe profilowanie przestrzenne w celu scharakteryzowania mikrośrodowiska w rozlanym glejaku naciekającym typu dorosłego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj cyfrowe profilowanie przestrzenne do analizy ekspresji białek w mikrośrodowisku glejaka naciekającego. Ta metoda pozwala zidentyfikować białka związane z inwazją nowotworu i wspiera badania nad nowymi celami terapeutycznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie Laboratorium Genomiki Klinicznej i Zaawansowanej Technologii na Wydziale Patologii i Medycyny Laboratoryjnej Dartmouth Hitchcock Health System. Autorzy uznają również Pathology Shared Resource w Dartmouth Cancer Center z NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.

Protokół opisany poniżej jest zgodny z wytycznymi Komisji Etyki Badań Naukowych Dartmouth-Hitchcock. Uzyskano świadomą zgodę od pacjentów, których próbki tkanek zostały włączone do tego badania. Zapoznaj się z sekcją Tabela materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole.
1. Przygotowanie do slajdów17
<ol>
	<li>Pobrać lub przygotować utrwaloną w formalinie, zatopioną w parafinie tkankę z rozlanych glejaków naciekających u dorosłych ludzi. 
	UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano zatopione w parafinie bloki biopsji od trzech pacjentów z glejakiem.</li>
	<li>Utwórz blok mikromacierzy tkankowej (TMA). Weź kilka 2-milimetrowych rdzeni z każdej biopsji i umieść je w jednym bloku TMA (<silna klasa="xfig">Ryc. 1, u góry). Wytnij sekcje z bloku TMA na 4 μm i zamontuj na szkiełkach podstawowych. Umieść każdy suwak w uszczelce uchwytu suwaka. Inkubować szkiełko w temperaturze 60 °C przez 30 minut.</li>
</ol>
2. Półautomatyczne przygotowanie systemu IHC i konfiguracja oprogramowania (do załadunku i uruchamiania slajdów)17
<ol>
	<li>Skonfiguruj odczynniki. Kliknij przycisk Reagent Setup (Ustawienia odczynnika). Kliknij Dodaj na karcie Konfiguracja.
	<ol>
		<li>Zarejestruj bufor mycia, wpisując jego nazwę w polu Nazwa. Wybierz opcję Pomocniczy w polu Typ. Kliknij Zapisz.</li>
		<li>Zarejestruj roztwór blokujący, powtarzając te same kroki, co powyżej (zmodyfikowane w zależności od potrzeb, np. w polu Nazwa), ale wybierając opcję Przeciwciało pierwszorzędowe w polu Typ. Wybierz żądane protokoły z pól rozwijanych Domyślny protokół barwienia i Domyślny protokół HIER. W razie potrzeby wybierz opcję Domyślny protokół enzymatyczny (to pole pozostało puste w bieżącym protokole). Kliknij Zapisz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zarejestruj system detekcji, składający się z tacki na pojemnik na odczynniki z kodem kreskowym. Zeskanuj kod kreskowy.
	<ol>
		<li>Rozpocznij wprowadzanie szczegółów systemu odczynników w oknie Dodaj system odczynników badawczych. Wpisz nazwę systemu detekcji.</li>
		<li>Wpisz datę wygaśnięcia. Podświetl pierwszy wiersz karty odczynników i zeskanuj kod kreskowy nowego pojemnika na odczynniki o pojemności 30 ml, po czym kod kreskowy wypełni wiersz 1.</li>
		<li>Umieść pojemnik w pozycji 1 systemu detekcji. Wybierz nazwę bufora myjącego w polu rozwijanym w kolumnie Odczynnik i kliknij Dodaj. Powtórz te kroki, aby dodać dodatkowe odczynniki w kolejnych wierszach, w tym roztwór blokujący.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj Protokół Białkowy dla IHC. Kliknij Ustawienia protokołu. Zaznacz wiersz odpowiadający żądanemu protokołowi i kliknij Kopiuj. Wprowadź nazwę i wypełnij wszystkie inne odpowiednie pola w oknie Edytuj właściwości protokołu.
	<ol>
		<li>Zaznacz pole Pokaż kroki mycia. Upewnij się, że pola Inc (min) i DispenseType są poprawne dla każdego odczynnika (10 min dla roztworu blokującego, 0 min dla buforu do przemywania i 150 μl dla każdego typu dozowania). Kliknij Zapisz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj badanie. Napełnij pojemnik w pozycji 1 buforem do mycia. Napełnić 150 μl na szkiełko i 5 ml objętości martwej; Pozostaw pokrywę otwartą. Powtórz te kroki dla pojemnika w pozycji 2, który powinien być wypełniony roztworem blokującym. Pojemnik ten powinien mieć 150 μl na szkiełko i 350 μl objętości martwej.
	<ol>
		<li>Załaduj tackę na pojemnik na odczynniki do urządzenia. Zezwól systemowi na wykonywanie czynności rozpoznawania kontenerów i potwierdzania woluminu. Kliknij Ustawienia slajdów | Dodaj badanie. Wprowadź identyfikator badania i nazwę badania, a następnie wybierz 150 μl w obszarze Objętość dozowania | żądany protokół w menu rozwijanym Protokół przygotowania (sugerowane jest pieczenie i odwoskowywanie wosku). Podświetl badanie i kliknij Dodaj slajd.</li>
		<li>Wybierz tkankę testową w obszarze Typ tkanki | 150 μL w obszarze Objętość dozowania | Pojedynczy i rutynowy z pól rozwijanych Tryb barwienia. Wybierz proces (IHC dla bieżącego badania) | nazwę rozwiązania blokującego w polu rozwijanym pola Znacznik | Protokół IHC DSP w polu Barwienie w zakładce Protokoły | *Pieczenie i odwoskowywanie w celu przygotowania | *HIER 20 min z ER1 dla HIER. Pole Enzym pozostaw puste.</li>
		<li>Powtórz ten proces dla każdego slajdu. Kliknij Zamknij po zakończeniu, a następnie kliknij Drukuj etykiety. Zaznacz wszystkie etykiety slajdów, które nie zostały jeszcze wydrukowane dla bieżącego badania i kliknij przycisk Drukuj. Przyklej etykiety na górze slajdów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj i uruchom slajdy. Załaduj szkiełka na tacę na szkiełka, upewniając się, że próbka i etykieta są skierowane do góry. Umieść płytki okładki na slajdach, upewniając się, że slajdy są zorientowane z zakładkami na dole. Załaduj tace na suwak na instrument.
	<ol>
		<li>Naciśnij przycisk LED, aby opuścić tacę i pozwolić instrumentowi rozpocząć skanowanie i rozpoznawanie slajdów. Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakończ eksperyment. Naciśnij przycisk LED, gdy zacznie migać na zielono, wskazując zakończenie biegu. Wyjmij tacę z instrumentu i ostrożnie podnieś płytki pokrywy z każdego slajdu. Umieść szkiełka w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), usuń nadmiar buforu i obrysuj każdy fragment tkanki hydrofobowym pisakiem, aby stworzyć hydrofobową barierę.</li>
</ol>
3. Inkubacja przeciwciał i barwienie jąder17
<ol>
	<li>Wybierz panel przeciwciał, aby zlokalizować interesujące nas antygeny (patrz Tabela 1 dla przeciwciał użytych w tym eksperymencie). 
	UWAGA: Każde przeciwciało zostało już sprzężone z oligonukleotydem DNA z segmentem fotorozszczepialnym UV (PC-oligo), który jednoznacznie je identyfikuje (oligonukleotydy indeksujące, <silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Sporządzić roboczy roztwór przeciwciała-PC-oligo, dodając na każde szkiełko 8 μl każdego przeciwciała (rozcieńczonego w stosunku 1:40) do panelu. Użyj odczynnika blokującego jako rozcieńczalnika, aby osiągnąć końcową objętość 200 μl na każdy szkiełko. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 3, Krok 1). 
	UWAGA: Na tym etapie do roztworu można również dodać markery morfologiczne, barwniki biologiczne lub przeciwciała znakowane fluorescencyjnie.</li>
	<li>Następnego dnia umieść szkiełko w słoiku Coplin i umyj 3 x 10 min w 1x TBS-T. Postfix w 4% paraformaldehydzie przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie 2 x 5 min w 1x TBS-T.</li>
	<li>Dodaj barwnik jądrowy SYTO13 (rozcieńczony 1:10 w 1x TBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyj 2x za pomocą 1x TBS-T, a następnie przechowuj szkiełko w 1x TBS-T.</li>
</ol>
4. Wizualizacja fluorescencji, identyfikacja ROI i fotofiltracja UV na instrumencie DSP17
<ol>
	<li>Po najechaniu kursorem myszy na Zbieranie danych w Centrum sterowania wybierz pozycję Nowy/Kontynuuj uruchamianie.</li>
	<li>Umieść szkiełko w uchwycie na szkiełka, etykietą skierowaną w stronę użytkownika. Opuść tacę ślizgową clamp, upewniając się, że tkanka jest widoczna w wydłużonym okienku. Dodaj 6 ml buforu S.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w Centrum sterowania. Powiększaj między różnymi osiami za pomocą suwaków X i Y, aby wyznaczyć region do skanowania. Wybierz opcję Skanuj. Pozwól na kontynuowanie skanowania, dopóki cały zdefiniowany obszar docelowy nie zostanie zobrazowany.</li>
	<li>Wygeneruj obraz 20x. Zdefiniuj ROI automatycznie lub ręcznie (Rysunek 3, Krok 2). Aby postępować zgodnie z tym protokołem, wybierz trzy okrągłe ROI o jednakowej wielkości (średnica 250 μm) dla każdego rdzenia tkanki (<silna klasa="xfig">Rysunek 4, na dole). 
	UWAGA: Zwrot z inwestycji można dostosować pod względem rozmiaru i kształtu. W każdej sekcji można wybrać kilka ROI. W tym eksperymencie cykliczne ROI są definiowane ręcznie.</li>
	<li>Zatwierdź zwrot z inwestycji, klikając przycisk Wyjdź z obszaru roboczego skanowania. Poczekaj, aż światło UV odetnie oligonukleotydy od przeciwciał.</li>
	<li>Po zakończeniu procesu czyszczenia urządzenia wybierz opcję Nowa kolekcja danych, aby kontynuować pracę z bieżącymi slajdami lub płytą. W przeciwnym razie wybierz opcję Usuń szkiełka i mikropłytkę.</li>
	<li>Otwórz okno Finalizuj płytę, klikając dwukrotnie obszar ikony płyty w prawym dolnym rogu Centrum sterowania. Jeśli znany jest numer partii pakietu kodów hybrydyzacji (Hyb) (#), wprowadź numer i kliknij przycisk Aktualizuj (opcjonalnie na tym etapie). Kliknij Finalizuj.</li>
	<li>Odłącz uchwyt suwaka i płytkę zbiorczą, postępując zgodnie z instrukcjami. Przechowuj slajdy w TBS-T. Jeśli szkiełka nie będą używane przez dłuższy czas, przykryj je roztworem wodnym i szkiełkiem nakrywkowym.</li>
</ol>
5. Białko readout17
<ol>
	<li>Użyć przepuszczalnego uszczelnienia i wysuszyć aspiraty w temperaturze 65 °C w termocyklerze z otwartą górą. Dodać 7 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu i wymieszać. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie szybko odwiruj.</li>
	<li>Wybierz odpowiednie równania sondy R i sondy U z tabeli 2, aby pokierować tworzeniem mieszanki sonda/bufor. Opierając się na liczbie kodów Hyb niezbędnych do hybrydyzacji w niniejszym eksperymencie, zastosuj równanie (1) jak poniżej. Szybko wymieszaj i odwiruj. 
	# Kody Hyb Sonda R Sonda puli roboczej U Bufor hybrydyzacyjny puli roboczej n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1)</li>
	<li>Dodaj 84 μl mieszanki sondy/buforu do każdego pakietu kodów Hyb, który ma być użyty. Przesuń, aby zmiksować i obrócić w dół. Na świeżej 96-dołkowej płytce do hybrydyzacji dodaj 8 μl każdej mieszanki Hyb Code Master Mix do wszystkich 12 dołków we wskazanym rzędzie.</li>
	<li>Przenieść 7 μl z płytki zbiorczej DSP do odpowiedniego dołka w płytce hybrydyzacyjnej. Delikatnie wymieszaj. Zgrzej na gorąco i wykonaj szybkie wirowanie. Następnie inkubować przez noc w temperaturze 67 °C. Schłodzić płytkę na lodzie i szybko zawirować.</li>
	<li>Zbierz produkty hyb z każdej studzienki w probówce paskowej, delikatnie pipetując każdą studzienkę 5 razy, aby wymieszać. Zakryj rurkę paskową i odwiruj. Zamrozić wszelkie pozostałe produkty hyb w temperaturze -80 °C. Załadować probówki paskowe do systemu analizy.</li>
	<li>Zapisz plik CDF na dysku USB, a następnie przenieś dane z instrumentu DSP do analizatora cyfrowego. Zakończ konfigurację, wykonując następujące czynności.
	<ol>
		<li>Załaduj materiały eksploatacyjne i zebrane próbki do stacji przygotowawczej. Na ekranie naciśnij Rozpocznij przetwarzanie. Wybierz opcję Wysoka czułość, a następnie przycisk Dalej. Naciśnij przycisk Zaznacz wszystko, aby określić liczbę studzienek z próbkami | Wykończenie | Następny w powiadomieniu e-mail | Początek.</li>
		<li>Po zakończeniu stacji przygotowawczej uszczelnij wkład i przenieś go do analizatora cyfrowego. Naciśnij Rozpocznij liczenie, wybierz Stage Position, naciśnij Load Existing CDF file i wybierz poprzednio przesłany plik. Naciśnij Gotowe, ponownie wybierz pozycję sceny, naciśnij Gotowe | Zacznij uruchamiać program.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz spakowany plik z plikami konwersji liczby reporterów z systemu analitycznego na dysk USB, a następnie włóż dysk do urządzenia DSP. W Centrum sterowania DSP najedź kursorem na Zbieranie danych, a następnie kliknij Prześlij liczby. Wybierz odpowiedni spakowany plik.</li>
</ol>
6. Analiza danych17
<ol>
	<li>Kliknij Rekordy w Centrum sterowania DSP. Aby wyświetlić skany w kolejce, wybierz opcję Dodaj wybrane skany do kolejki | Moja kolejka analiz. Wybierz Nowe badanie z kolejki po najechaniu kursorem na opcję Analiza danych w Centrum sterowania.</li>
	<li>Wybierz opcję QC z opcji paska zadań. Kontynuuj z wartościami domyślnymi lub dostosuj w razie potrzeby. Wybierz pozycję Uruchom kontrolę jakości i przejrzyj siatkę wyników. Kliknij Uruchom kontrolę jakości, aby kontynuować i utworzyć nowy zestaw danych, normalizując wartości do dodatnich kontrolek hybrydyzacji.</li>
	<li>Zaimportuj nowe tagi do pliku XLSX. Wybierz pozycję Zarządzaj adnotacjami w okienku Skanowania, a następnie pobierz szablon, wstaw znaczniki i zaimportuj plik.</li>
	<li>OPCJONALNIE: Po uruchomieniu kontroli jakości dostosuj dane dalej, korzystając z innych opcji paska narzędzi. Użyj narzędzi w okienku Wizualizacje, aby wykreślić przekształcone dane.</li>
	<li>Przejdź do szarego pola listy rozwijanej parametrów, aby skomponować każdy wykres w okienku Wizualizacje. Wybierz określony obszar na wykresie, aby zwizualizować odpowiadające mu wyróżnione segmenty w okienku Skanowania, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wygenerować znaczniki lub grupy. W obszarze Podsumowanie zestawu danych przejrzyj wykresy z normalizacji, skalowania i innych opcji analizy i wyświetlania.</li>
	<li>Zapisz wizualizację, wybierając ikonę Zapisz; przejrzyj wizualizacje już zapisane w obszarze Podsumowanie. Wybierz przycisk Eksportuj (.svg), aby wyeksportować wizualizację w formacie .svg. Eksportuj dane, na których oparta jest wizualizacja, klikając przycisk Eksportuj (.xlsx). Wyeksportuj wszystkie dane zawarte w określonym zestawie danych, umieszczając kursor na nazwie zestawu danych w drugim okienku i klikając ikonę eksportu.</li>
</ol>

<ol><li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li>
<li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li>
<li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183(2020).</li>
<li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li>
<li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma%3A+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li>
<li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li>
<li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li>
<li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li>
<li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Immuno-Oncology+Technology%22%5BJournal%5D)">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li>
<li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Pardo%2C+M+%22Precision+Cancer+Medicine%22">Precision Cancer Medicine</a>. , Online (2021).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253(2022).</li>
<li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456(2021).</li>
<li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426(2021).</li>
<li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349(2021).</li>
<li>Wang, D. Y. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+study%3A+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeoMx+DSP%22">GeoMx DSP</a>. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).</li>
<li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).</li>
<li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li>
<li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li>
<li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-enriched+hyaluronan+binding+%28BEHAB%29%2Fbrevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+%28ADAMTS%29+family+member%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li>
<li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro%3A+involvement+of+a+metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li>
<li>Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+%28MT1-MMP%29+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li>
<li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes%3A+At+the+core+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li>
<li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccines+for+cancer+prevention%3A+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li>
<li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immune+checkpoint+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li>
<li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-PD-1%2FPD-L1+therapy+of+human+cancer%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928(2021).</li>
<li>Ishii,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+characterization+of+the+tumorigenic+%26%2334%3Bperi-necrotic+niche%26%2334%3B+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histological characterization of the tumorigenic &#34;peri-necrotic niche&#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366(2016).</li>
<li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li>
<li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CosMx+Spatial+Molecular+Imager%3A+True+Single-Cell+In+Situ+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22NanoString%22%5BJournal%5D)">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Biorąc pod uwagę różnorodność białek, które mogą potencjalnie wpływać na agresywność glejaków oraz pogląd, że kilka z tych białek pozostaje nieodkrytych, wysokoprzepustowa metoda kwantyfikacji białek jest idealnym podejściem technologicznym. Dodatkowo, biorąc pod uwagę, że dane przestrzenne w próbkach onkologicznych często korelują ze zróżnicowaną ekspresją18, włączenie profilowania przestrzennego do podejścia do kwantyfikacji białek pozwala na bardziej efektywną analizę.
<p class="jove_conten...

Glejaki naciekające dyfuzyjnie są najczęstszym typem złośliwego guza mózgu u dorosłych i są niezmiennie śmiertelne. Skłonność komórek glejaka do nadmiernej migracji w mózgu jest poważnym wyzwaniem terapeutycznym. Mechanizm, za pomocą którego się rozprzestrzeniają, obejmuje ukierunkowaną migrację i niekontrolowaną inwazję. Wykazano, że inwazyjne komórki glejaka wykazują tropizm i migrację wzdłuż szlaków istoty białej1, przy czym ostatnie badania sugerują demielinizację tych dróg jako aktywną, protumorygenną cechę2. W inwazji pośredniczy przejście nabłonkowe do mezenchymalnego, w którym komórki glejaka uzyskują właściwości mezenchymalne poprzez zmniejszenie ekspresji genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej i cząsteczki adhezyjne komórek, wzmacniając migrację i ułatwiając propagację w mikrośrodowisku guza3,4,5.
Na poziomie molekularnym wykazano zakłócenie kilku białek, które nadają stabilność komórkową i łączą się z komponentami immunogennymi6. Wiadomo, że glejaki naciekowe ulegają supresji białek o właściwościach antyapoptotycznych (np. PTEN)7. Wykazują również nadekspresję białek, które sprzyjają unikaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza (np. PD1/PDL1)8. Rozregulowanie tych złożonych szlaków zwiększa rakotwórczość i zwiększa potencjał złośliwy.
W próbkach inwazyjnego glejaka, celem było oszacowanie zróżnicowanej ekspresji białek kluczowych dla wzrostu, przeżycia i proliferacji komórek, a także dla integralności strukturalnej mikrośrodowiska między inwazyjnymi i nieinwazyjnymi komponentami. Ponadto staraliśmy się zbadać różnicową regulację białek o aktywnej roli immunogennej, oferując wgląd w mechanizm, dzięki któremu osłabiona obrona immunologiczna gospodarza może zwiększać proliferacyjny i inwazyjny potencjał glejaków. Jest to szczególnie istotne, biorąc pod uwagę niedawny zakres badań pokazujących, w jaki sposób markery immunologiczne i czynniki powodujące rozregulowanie w nowotworach złośliwych mogą służyć jako cele immunoterapii. Identyfikacja realnych celów terapeutycznych wśród wielu białek biorących udział w nadzorze immunologicznym i reaktywności wymaga bardzo czułego i kompleksowego podejścia.
Biorąc pod uwagę szeroki wachlarz potencjalnych białek, które mogą być badane, szukaliśmy metody zbliżonej do immunohistochemii, ale o zwiększonej wydajności przetwarzania danych. W dziedzinie biologii nowotworów DSP stał się potężną technologią o istotnych zaletach w porównaniu z alternatywnymi narzędziami do analizy proteomicznej i kwantyfikacji. Cechą charakterystyczną DSP jest jego zdolność do multipleksowania o wysokiej przepustowości, pozwalająca na jednoczesne badanie kilku różnych białek w próbce, co stanowi istotną różnicę w stosunku do standardowych, ale mniej pleksowych technologii, takich jak immunohistochemia (IHC)9,10. Funkcja multipleksu DSP nie wpływa negatywnie na jego wierność jako narzędzia ilościowego i analitycznego, jak wykazały badania porównujące DSP z IHC. Na przykład, w przypadku użycia do proteomicznej kwantyfikacji próbek niedrobnokomórkowego raka płuca, wykazano, że DSP ma podobne wyniki do IHC11. Dodatkowo DSP oferuje konfigurowalną specyfikację regionalną, w której użytkownicy mogą ręcznie definiować regiony, w których mają być przeprowadzana analiza proteomiczna. Daje to przewagę nad metodami multipleksu całosekcyjnego10,12. W jednej rundzie przetwarzania DSP oferuje zatem wiele warstw analizy, badając kilka docelowych białek w wielu regionach zainteresowania.
DSP ma zastosowanie w kilku różnych ustawieniach patologicznych. DSP jest szczególnie korzystny w analizie onkologicznej, ponieważ zmienność przestrzenna może korelować z transformacją komórkową i różnicową ekspresją białek. Na przykład DSP wykorzystano do porównania profilu proteomicznego raka piersi z sąsiednim mikrośrodowiskiem guza. Niesie to ze sobą ważne implikacje dla zrozumienia naturalnej historii tego guza i jego progresji, a także potencjalnej odpowiedzi na leczenie13. Dodatkowe konteksty ilustrujące wszechstronność DSP obejmują przestrzenną kwantyfikację różnorodności białek w raku prostaty14, związek ekspresji markerów komórek odpornościowych z progresją choroby w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi15, oraz wykazanie nabłonkowo-mezenchymalnego gradientu ekspresji białka odróżniającego przerzutowego od pierwotnego raka jasnokomórkowego jajnika16. Wdrażając DSP, charakteryzujemy topografię przestrzenną białek, które mogą mieć wpływ na nowotworzenie i inwazję glejaków.

<table><tbody><tr><td>System detekcji badań BOND</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>DS9455</td><td>Otwarty system detekcji zawierający otwarte pojemniki w tacce na odczynniki</td></tr><tr><td>Mycie BOND Leica</td><td>Biosystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>AR950</td><td>10X skoncentrowany roztwór buforowy do mycia tkanek utrwalonych</td></tr><tr><td>Bufor W</td><td>NanoString, Seattle, WA</td> Firma <td>kontaktowa</td> Zestaw do koniugacji <td>odczynnika blokującego</td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Abcam, Cambridge, Wielka Brytania</td><td>AB188287</td><td>Zestaw do koniugacji przeciwciał fluorescencyjnych Cy3</td></tr><tr><td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>Skontaktuj się z firmą</td><td>System do obrazowania i charakteryzowania celów białkowych i RNA</td></tr><tr><td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>100471</td><td>Zestaw buforowy do GeoMX DSP (w tym do przetwarzania i przygotowania próbek)</td></tr><tr><td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>121300401</td><td>Controls do uruchamiania GeoMX DSP experiemtns</td></tr><tr><td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>121300101</td><td>Moduł białkowy z celami dla ludzkich komórek odpornościowych i celów immunoonkologicznych</td></tr><tr><td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>121300105</td><td>Moduł białkowy z celami dla wielu typów nowotworów u ludzi oraz dla markerów przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego</td></tr><tr><td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>121300308</td><td>Odczynniki do przygotowania próbek do analizy białek GeoMX DSP</td></tr><tr><td>LEICA Bond RX</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>Skontaktuj się z firmą</td><td>W pełni zautomatyzowany zestaw Master Stainer IHC</td></tr><tr><td>- 12 reakcji</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>100052</td><td>Materiały i odczynniki do stosowania z systemem analizy nCounter</td></tr><tr><td>System analizy nCounter</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>Skontaktuj się</td><td>z firmą Zautomatyzowany system do ilościowego oznaczania ekspresji docelowej multipleksu (do użytku z GeoMx DSP)</td></tr><tr><td>TMA Master II</td><td>3DHistech Ltd., Budapeszt, Węgry</td><td></td><td>Aby utworzyć blok mikromacierzy tkankowej</td></tr></tbody></table>

cyfrowe profilowanie przestrzenne w celu scharakteryzowania mikrośrodowiska w rozlanym glejaku naciekającym typu dorosłego

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Glejaki naciekające dyfuzyjnie wiążą się z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością ze względu na infiltracyjny charakter rozprzestrzeniania się nowotworu. Są to guzy złożone morfologicznie, o wysokim stopniu zmienności proteomicznej zarówno w samym guzie, jak i w jego niejednorodnym mikrośrodowisku. Potencjał złośliwy tych nowotworów jest zwiększony przez rozregulowanie białek zaangażowanych w kilka kluczowych szlaków, w tym procesy utrzymujące stabilność komórkową i zachowujące integralność strukturalną mikrośrodowiska. Chociaż przeprowadzono liczne analizy glejaka masowego i jednokomórkowego, istnieje względny niedostatek stratyfikacji przestrzennej tych danych proteomicznych. Zrozumienie różnic w rozmieszczeniu przestrzennym czynników nowotworowych i populacji komórek odpornościowych między wewnętrznym guzem, inwazyjną krawędzią i mikrośrodowiskiem dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw proliferacji i propagacji guza. Cyfrowe profilowanie przestrzenne (DSP) to potężna technologia, która może stanowić podstawę dla tych ważnych analiz wielowarstwowych.
DSP to metoda, która skutecznie określa ilościowo ekspresję białek w określonych przez użytkownika regionach przestrzennych w próbce tkanki. DSP idealnie nadaje się do badania zróżnicowanej ekspresji wielu białek w obrębie i między regionami rozróżnienia, umożliwiając analizę na wielu poziomach ilościowych i jakościowych. Protokół DSP jest systematyczny i przyjazny dla użytkownika, co pozwala na dostosowaną do potrzeb analizę przestrzenną danych proteomicznych. W tym eksperymencie mikromacierze tkankowe są konstruowane z archiwalnych biopsji rdzeniowych glejaka. Następnie wybierany jest panel przeciwciał, ukierunkowany na białka będące przedmiotem zainteresowania w próbce. Przeciwciała, które są wstępnie sprzężone z oligonukleotydami DNA dno rozszczepialnymi promieniami UV, są następnie inkubowane z próbką tkanki przez noc. W ramach wizualizacji przeciwciał za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej definiowane są obszary zainteresowania (ROI), w których należy określić ilościowo ekspresję białka. Światło UV jest następnie kierowane na każdy ROI, rozszczepiając oligonukleotydy DNA. Oligonukleotydy są mikroaspirowane i zliczane w ramach każdego ROI, określając ilościowo odpowiednie białko na podstawie przestrzennej.

Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne wyniki eksperymentu DSP przeprowadzonego na próbkach glejaka wielopostaciowego. Przedstawiono mapę ciepła, która ilustruje jedną z metod wizualizacji danych przy użyciu oprogramowania DSP. Wiersze reprezentują białka docelowe, a każda kolumna odpowiada obszarowi zainteresowania. Zakres kolorów od niebieskiego do czerwonego oznacza odpowiednio niską i wysoką ekspresję. Zmienność kolorów w obrębie wiersza odzwierciedla regionalną heterogeniczność białek i ...

Dysregulacja proteomiczna odgrywa ważną rolę w rozprzestrzenianiu się glejaków naciekających dynacyjnie, ale kilka istotnych białek pozostaje niezidentyfikowanych. Cyfrowe przetwarzanie przestrzenne (DSP) oferuje wydajne, wysokoprzepustowe podejście do charakteryzowania zróżnicowanej ekspresji białek kandydujących, które mogą przyczyniać się do inwazji i migracji glejaków naciekających.

Cyfrowe profilowanie przestrzenne w celu scharakteryzowania mikrośrodowiska w rozlanym glejaku naciekającym typu dorosłego

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Cyfrowe profilowanie przestrzenne (DSP) oferuje wydajną metodę przestrzennego warstwowego oznaczania ilościowego białek. Jego implementacja pozwala nam scharakteryzować ekspresję białek w różnych regionach guza i mikrośrodowisku. Kluczową cechą procesora DSP jest jego zdolność do multipleksowania, umożliwiająca przetwarzanie danych o wysokiej przepustowości.Możliwość definiowania niestandardowych obszarów zainteresowania dodatkowo zapewnia przestrzenny wymiar analizy danych. DSP można zastosować do dowolnej próbki, w której przestrzenna kwantyfikacja ekspresji białka lub RNA może pomóc w wyjaśnieniu procesu patologicznego lub fizjologicznego. Jest to szczególnie istotne w onkologii, gdzie regionalna zmienność celu może korelować ze złośliwym wzrostem lub inwazją.Procedurę zademonstrują Scott Palisoul, histotechnolog i Rachael Barney, technolog genomiczny. Aby przygotować preparaty, zacznij od pobrania kilku dwumilimetrowych rdzeni z każdej biopsji i umieszczenia ich w jednym bloku mikromacierzy tkankowej. Wytnij czteromikronowe odcinki z bloku i zamontuj je na szkiełkach.Umieść każde szkiełko w uszczelce uchwytu szkiełka i inkubuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut. W półautomatycznym systemie IHC napełnij pojemnik w pozycji pierwszej 150 mikrolitrami buforu myjącego na szkiełko plus pięć mililitrów objętości martwej i pozostaw pokrywę otwartą. Napełnij taką samą ilość roztworu blokującego w pojemniku w pozycji drugiej.Załaduj tacę pojemnika na odczynnik na maszynę. Wybierz opcję Process IHC, a następnie nazwę rozwiązania blokującego w polu rozwijanym w polu Marker. Po zakończeniu dla wszystkich slajdów kliknij Zamknij.Następnie kliknij Drukuj etykiety i zaznacz Wszystkie etykiety slajdów, które nie zostały jeszcze wydrukowane, a następnie kliknij Drukuj. Przyklej etykiety na górze slajdów. Załaduj szkiełka na tacę na szkiełka, upewniając się, że próbka i etykieta są skierowane do góry.Naciśnij przycisk LED, aby opuścić tacę i pozwól instrumentowi rozpocząć skanowanie i rozpoznawanie slajdów. Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć eksperyment. Po zakończeniu biegu naciśnij przycisk LED, gdy zacznie migać na zielono.Wyjmij tacę z instrumentu i ostrożnie podnieś płytki pokrywy z każdego slajdu. Umieść szkiełka w 1X buforowanym fosforanem soli fizjologicznej. Usuń nadmiar buforu i obrysuj każdy fragment tkanki hydrofobowym pisakiem, aby stworzyć barierę hydrofobową.Przygotuj roztwór oligo przeciwciała PC, dodając osiem mikrolitrów każdego przeciwciała na szkiełko i używając buforu W, aby osiągnąć końcową objętość 200 mikrolitrów. Następnie nałóż roztwór oligo przeciwciała PC na szkiełka i inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji umieść szkiełka na nawilżonej tacy i umyj trzykrotnie przez 10 minut w 1X TBST.Po utrwaleniu w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotne mycie przez pięć minut w 1X TBST. Dodaj plamę jądrową SYTO 13 na 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umyj dwukrotnie 1X TBST. Najedź kursorem myszy na Zbieranie danych w Centrum sterowania i wybierz Nowy lub Kontynuuj uruchamianie.Umieść szkiełko w uchwycie na suwak etykietą skierowaną w stronę użytkownika. Opuść tacę ślizgową clamp, upewniając się, że tkanka jest widoczna w wydłużonym okienku. Dodaj sześć mililitrów buforu S.Postępuj zgodnie z instrukcjami w Centrum sterowania.Powiększaj między różnymi osiami za pomocą suwaków x i y, aby wyznaczyć region do skanowania. Wybierz opcję Skanuj i pozwól na kontynuowanie skanowania do momentu, gdy cały zdefiniowany obszar docelowy zostanie zobrazowany. Wygeneruj obraz 20 razy.Zdefiniuj ROI, wybierając trzy okrągłe ROI o jednakowej wielkości i średnicy 250 mikrometrów dla każdego rdzenia tkanki. Zatwierdź zwrot z inwestycji, klikając przycisk Wyjdź z obszaru roboczego skanowania. Następnie poczekaj, aż światło UV odetnie oligonukleotydy od przeciwciał.Po zakończeniu procesu czyszczenia urządzenia wybierz opcję Nowa kolekcja danych, aby kontynuować pracę z bieżącymi slajdami lub płytą. Otwórz okno sfinalizowanej płyty, klikając dwukrotnie obszar ikony Płyta. Wprowadź numer partii pakietu kodu hybrydyzacji i kliknij przycisk Aktualizuj.Następnie kliknij Finalizuj. Odłącz uchwyt suwaka i płytkę zbiorczą, postępując zgodnie z instrukcjami. Szkiełka należy przechowywać w TBST lub przykryć je roztworem wodnym i szkiełkiem nakrywkowym w celu długotrwałego przechowywania.Uszczelnij płytki za pomocą przepuszczalnej uszczelki i wysusz aspiraty w temperaturze 65 stopni Celsjusza w termocyklerze z otwartą górą. Dodaj siedem mikrolitrów wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu i wymieszaj. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie szybko odwirować.Przygotuj mieszaninę sondy, wybierając odpowiednie równania sondy R i sondy U, stosując równanie zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj 84 mikrolitry mieszanki sondy do każdego pakietu kodów hybrydyzacji. Na świeżej 96-dołkowej płytce do hybrydyzacji dodaj osiem mikrolitrów każdej głównej mieszanki kodu hybrydyzacji do wszystkich 12 dołków wskazanego rzędu.Przenieść siedem mikrolitrów z płytki zbiorczej DSP do odpowiedniego dołka na płytce hybrydyzacyjnej. Zgrzej płytkę, zakręć płytką i inkubuj ją przez noc w temperaturze 67 stopni Celsjusza. Po inkubacji ostudzić płytkę na lodzie i szybko zawirować.Zebrać produkty hybrydyzacji z każdej studzienki w probówce paskowej, delikatnie pipetując każdy dołek pięć razy. Zakręć w dół i załaduj rurki paskowe do systemu analizy. Na instrumencie DSP zapisz CDF file na dysku USB i przenieś dane do analizatora cyfrowego.Na ekranie naciśnij Rozpocznij przetwarzanie. Wybierz opcję Wysoka czułość, a następnie przycisk Dalej. Naciśnij Wybierz wszystko, aby wyświetlić liczbę studzienek z próbkami, następnie Zakończ, a następnie Dalej w powiadomieniu e-mail.Następnie kliknij Start. Po zakończeniu pracy stacji przygotowawczej uszczelnij wkład i przenieś go do analizatora cyfrowego. Naciśnij przycisk Rozpocznij liczenie.Wybierz pozycję stołu montażowego. Naciśnij Załaduj istniejący plik CDF i wybierz poprzednio przesłany plik. Naciśnij Gotowe.Ponownie wybierz pozycję stołu montażowego, naciśnij Gotowe, a następnie Start, aby uruchomić program. Zapisz plik ZIP z plikami konwersji liczby reporterów z systemu analitycznego na dysku USB. Włóż dysk do urządzenia DSP.W Centrum sterowania DSP najedź kursorem na Zbieranie danych, a następnie kliknij Prześlij konta. Wybierz odpowiedni plik ZIP. Kliknij Rekordy w Centrum sterowania DSP.Aby wyświetlić skany w kolejce, wybierz opcję Dodaj wybrane skany do kolejki, a następnie pozycję Moja kolejka analizy. Wybierz Nowe badanie z kolejki, najeżdżając kursorem na opcję Analiza danych w Centrum sterowania. Eksperyment DSP przeprowadzono na próbkach glejaka, a wyniki zwizualizowano w postaci mapy cieplnej.Wiersze reprezentują docelowe białka, a każda kolumna odpowiada regionowi zainteresowania. Poziom ekspresji jest przedstawiany przez zakres kolorów od niebieskiego, pokazującego niską ekspresję, do czerwonego, który oznacza wysoki ekspresję. Zmienność koloru w wierszu odzwierciedla regionalną heterogeniczność białek i sugeruje możliwy związek przestrzenny z różnicową ekspresją białka.W tym eksperymencie S100 i CD-56 były powszechnie wysokie, ponieważ są markerami neuronalnymi. Markery o największej zmienności obejmują B7-H3, KI-67, CD-44 i fibronektynę, o których wiadomo, że są związane z proliferacją, migracją i przerzutami guza. Z szerokiej gamy potencjalnych celów, DSP może zidentyfikować te, które wykazują znaczną zmienność regionalną.Stanowi to podstawę do badania czynników związanych ze zmiennością i ich znaczeniem dla choroby.

digital-spatial-profiling-for-characterization-microenvironment-adult

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten protokół został opracowany do ilościowej identyfikacji składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu immunohistochemii chromogennej i ImageJ.

Ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta

Neurosfery wyhodowane jako kultury 3D stanowią potężne narzędzie do badania biologii glejaka. W tym miejscu przedstawiamy protokół przeprowadzania immunohistochemii przy zachowaniu struktury 3D neurosfer glejaka poprzez zatapianie parafiny. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie właściwości neurosfery glejaka, takich jak łodyga i różnicowanie neuronalne.

Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

Wpływ inhibitorów migracji na migrację komórek raka glejaka w trójwymiarowych (3D) testach inwazji z użyciem inhibitora deacetylazy histonowej (HDAC) charakteryzuje się mikroskopią konfokalną o wysokiej rozdzielczości.

Charakterystyka wpływu inhibitorów migrastatycznych na inwazję sferoidalną guza 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Tutaj prezentujemy łatwy w użyciu test do analizy migracji glejaka (GBM) na neuronach o wzorcach. Opracowaliśmy makro w oprogramowaniu FiJi do łatwego ilościowego określania migracji komórek GBM na neuronach i zaobserwowaliśmy, że neurony modyfikują zdolność inwazyjną komórek GBM.

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

To badanie przedstawia protokół immunocytochemii żywych komórek 3D zastosowany do pediatrycznej linii komórkowej rozlanego glejaka pośrodkowego, przydatny do badania w czasie rzeczywistym ekspresji białek na błonie plazmatycznej podczas dynamicznych procesów, takich jak inwazja i migracja komórek 3D.

Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Ta praca opisuje rozwój elastycznych elektrod międzypalcowych do implementacji w modelach 3D guzów mózgu, a mianowicie w hodowli in vitro, modelu in ovo i modelu mysim in vivo. Proponowana metoda może być wykorzystana do oceny wpływu pulsacyjnych pól elektrycznych na nowotwory na różnych poziomach złożoności.

Elastyczne organiczne urządzenia elektroniczne do terapii pulsacyjnym polem elektrycznym glejaka

Prezentujemy metodę replikacji mikrośrodowiska guza glejaka na froncie inwazyjnym, która obejmuje przepływ płynu śródmiąższowego. Ten model to hydrożel hialuronowo-kolagenowy I we wkładzie do hodowli tkankowej, w którym można zastosować głowicę ciśnieniową płynu. Inwazję można określić ilościowo, a komórki można wyizolować lub poddać lizie.

Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

Zmutowane IDH1 rozlane glejaki o niskim stopniu złośliwości to rzadkie nowotwory, które są trudne do hodowli. Wprowadzamy prostą, nieenzymatyczną metodę eksplantacji, która zachowuje ekspresję białka z mutacją IDH1 i utrzymuje kultury przez wiele miesięcy. Co ważne, technika ta działa w przypadku kriokonserwowanych guzów, oferując cenne źródło informacji do badań nad glejakiem.

Protokół dla eksplantatów rozlanych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1

W tym miejscu tworzymy platformę profilowania metabolicznego integrującą trójwymiarowe (3D) sferoidy glejaka i normalizację opartą na obrazowaniu za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Podejście to umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi metabolicznych guza na leczenie farmakologiczne i zapewnia wgląd w potencjalne mechanizmy oporności.

Postępy w profilowaniu metabolicznym trójwymiarowych sferoid guza mózgu do badań przesiewowych leków

Poznaj cyfrowe profilowanie przestrzenne do analizy ekspresji białek w mikrośrodowisku glejaka naciekającego. Ta metoda pozwala zidentyfikować białka związane z inwazją nowotworu i wspiera badania nad nowymi celami terapeutycznymi.

Cyfrowe profilowanie przestrzenne w celu scharakteryzowania mikrośrodowiska w rozlanym glejaku naciekającym typu dorosłego

Przeglądaj więcej filmów