Name: Szybka mikroskopia fotoakustyczna w ultrafiolecie do obrazowania histologicznego z wirtualnym barwieniem wspomagana przez głębokie uczenie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Odkryj szybką mikroskopię fotoakustyczną w ultrafiolecie wspomaganą głębokim uczeniem do wirtualnego barwienia tkanek. System generuje obrazy histologiczne w 18 minut, wspierając precyzyjną analizę marginesów chirurgicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie finansowe ze strony Komisji ds. Innowacji i Technologii Hongkongu (ITS/036/19).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone w tej pracy są zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt na Uniwersytecie Nauki i Technologii w Hongkongu.
1. Otwarty system UV-PAM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Oświetlenie optyczne
	<ol>
		<li>Użyj lasera półprzewodnikowego pompowanego diodą Q-switch (długość fali 266 nm) jako źródła wzbudzenia.</li>
		<li>Użyj dwóch wypukłych soczewek, aby rozszerzyć wiązkę laserową i umieść otwór w pobliżu punktu ogniskowego pierwszej soczewki wypukłej, aby przeprowadzić filtrowanie przestrzenne.</li>
		<li>Odbijaj wiązkę lasera w górę za pomocą lustra galwanometrycznego 1D (1D GM).</li>
		<li>Użyj soczewki obiektywowej, aby skupić wiązkę laserową i przejść przez środek przetwornika ultradźwiękowego w kształcie pierścienia (UT), zanim zostanie ściśle skupiona na próbce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja ultradźwiękowa
	<ol>
		<li>Użyj UT w kształcie pierścienia do wykrywania fal ultradźwiękowych. Średnica wewnętrzna i zewnętrzna obszaru aktywnego UT wynosi odpowiednio 3 mm i 6 mm. Ogniskowa: 6,3 mm; częstotliwość środkowa: 40 MHz; Szerokość pasma -6 dB: 84%.</li>
		<li>Zamocuj UT w laboratoryjnym zbiorniku na wodę z optycznie przezroczystym okienkiem na dole, pokrytym cienkim kwarcowym szkiełkiem nakrywkowym, aby umożliwić przejście światła UV. Upewnij się, że aktywny obszar UT jest skierowany do góry. Przymocuj zbiornik na wodę do dwuosiowego stolika ręcznego w celu kontrolowania bocznego położenia UT.</li>
		<li>Włącz laser UV, dostosuj położenie UT, aby wiązka laserowa mogła przejść ze środka UT. Wyłącz laser UV. Następnie napełnij zbiornik na wodę wodą dejonizowaną, aby całkowicie zanurzyć UT.</li>
		<li>Podłącz wyjście UT do dwóch amplifier (całkowite wzmocnienie = 56 dB) i podłącz wyjście drugiego amplifier do karty akwizycji danych (DAQ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj uchwyt na próbkę do stolika ręcznego w osi z, który jest połączony ze stolikami z napędem xy. Uchwyt na próbkę ma pusty otwór, przez który przepuszcza światło UV. Przymocuj cztery kawałki dwustronnej taśmy otaczającej otwór.</li>
	<li>Wyrównanie systemu
	<ol>
		<li>Przymocuj czarną taśmę do szkiełka podstawowego i umieść szkiełko tak, aby zakryło otwór uchwytu próbki, czarną taśmą skierowaną w dół. Naciśnij szkiełko podstawowe, aby upewnić się, że jest zamocowane na uchwycie próbki. Następnie opuść uchwyt na próbkę, aby zanurzyć szklane szkiełko w wodzie.</li>
		<li>Odłącz UT w kształcie pierścienia i amplifiery, podłącz UT do impulsera/odbiornika i podłącz wyjście impulsera/odbiornika do oscyloskopu. Przełącz pulsator/odbiornik w tryb Pulse-Echo. Ustaw amplitudę impulsu i wzmocnienie impulsera/odbiornika odpowiednio na 6 i 20 dB.
		<ol>
			<li>Włącz impulser/odbiornik i wyreguluj pozycję Z uchwytu próbki, aby znaleźć pozycję akustycznej płaszczyzny ogniskowej, w której sygnały ultradźwiękowe są maksymalne.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmień impulsator/odbiornik w tryb transmisji i ustaw wzmocnienie na 60 dB. Włącz wyjście lasera. Dostosuj pozycję z soczewki obiektywu, aby zmaksymalizować sygnały PA mierzone przez oscyloskop.</li>
		<li>Dostosuj boczne położenie UT w kształcie pierścienia, aby generowany sygnał PA był symetryczny i maksymalny, co oznacza, że ogniska optyczne i akustyczne są wyrównane w płaszczyźnie bocznej. Następnie wyreguluj pozycję Z uchwytu próbki, aby zmaksymalizować sygnały PA.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.4.3 i 1.4.4, aby zoptymalizować zarówno symetrię, jak i amplitudę sygnałów PA. Zapisz opóźnienie czasowe (tj. czas potrzebny falom PA na dotarcie do UT) na oscyloskopie, gdy sygnały PA są zoptymalizowane.</li>
		<li>Przesuń uchwyt próbki, aby zobrazować różne pozycje czarnej taśmy. Wyregulować płaskość uchwytu próbki w taki sposób, aby sygnały PA generowane z każdej pozycji czarnej taśmy miały takie samo opóźnienie czasowe, jak zmierzone w kroku 1.4.5.</li>
		<li>Wyłącz laser i podłącz UT do dwóch amplifiers.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Wycinek mózgu myszy FFPE
	<ol>
		<li>Poświęć mysz z przedawkowaniem znieczulenia. Następnie zbierz mózg myszy zgodnie z protokołem opisanym w reference18.</li>
		<li>Utrwal pobrany mózg w 10% neutralnej buforowanej formalinie na 24 godziny.</li>
		<li>Utrwalony mózg należy przetworzyć poprzez odwodnienie stopniowanym alkoholem, oczyszczenie ksylenem i zatopienie w parafinie, jak opisano w reference19. 
		UWAGA: Próbkę należy przetworzyć w dygestorium.</li>
		<li>Pokrój osadzony mózg na cienkie plasterki (o grubości 5 μm) za pomocą mikrotomu. Umieść plasterki próbki na szkiełkach kwarcowych. Szkiełka suszyć w suszarce w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Odparafinować skrawki za pomocą środka czyszczącego (patrz tabela materiałów), który usuwa parafinę, aby uniknąć silnych sygnałów tła, ponieważ parafina jest wysoce absorbująca dzięki wzbudzeniu UV. 
		UWAGA: Próbkę należy przetworzyć w dygestorium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Świeży wycinek mózgu myszy
	<ol>
		<li>Poświęć mysz z przedawkowaniem znieczulenia. Następnie zbierz mózg myszy zgodnie z protokołem podanym w reference18.</li>
		<li>Umyj mózg myszy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby usunąć krew.</li>
		<li>Wytnij ręcznie plasterek próbki mózgu (o grubości ~5 mm), a następnie umyj próbkę PBS, aby usunąć krew z przekroju poprzecznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Procedury eksperymentalne
<ol>
	<li>Rozmieszczenie próbek
	<ol>
		<li>Przygotować laboratoryjny zbiornik na próbkę z przezroczystą membraną UV (polietylen o grubości ∼10 μm). Dodaj kroplę wody do membrany, a następnie umieść próbkę biologiczną w zbiorniku na próbkę, aby przykryć wodę. W przypadku próbki z plastrem FFPE należy użyć taśmy, aby przymocować szkiełko do membrany.</li>
		<li>Umieścić zbiornik na próbkę zawierającą próbkę na uchwycie próbki, upewniając się, że zakrył pusty otwór w uchwycie próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw laser UV w trybie wyzwalania zewnętrznego. Korzystając z naszego laboratoryjnego programu LabVIEW (patrz Tabela materiałów), ustaw parametry skanowania w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Ustaw częstotliwość powtarzania lasera na 55 kHz; ustaw typ sygnałue sterownika GM na trójkątny, a zakres napięcia sterującego na 0,018 V (co odpowiada ±0,018 V; współczynnik skali: 1 V/°). Ustaw GMnum na 22 i dy na 2, aby po każdych 22 wyzwoleniach lasera GM kończył jedną czwartą okresu skanowania, a silnik osi y przesuwał się o rozmiar kroku 0,3125 μm. Ustaw dx na 192, aby gdy silnik osi y osiągnie zadaną pozycję (np. 5 mm), silnik osi x poruszał się o rozmiar kroku 30 μm. 
		UWAGA: Najmniejszy przyrostowy rozmiar kroku jest ustawiony na 0,15625 μm zarówno dla silników osi x, jak i y. Dlatego, gdy dy = 2, rozmiar kroku wynosi 0,15625 x 2 = 0,3125 μm, a gdy dx = 192, rozmiar kroku wynosi 0,15625 x 192 = 30 μm. Aby zeskanować cały obszar 5 x 5 mm2, silnik osi X przesunie się o 5000 μm / 30 μm = 167 razy, co oznacza, że 167 obrazów cząstkowych zostanie zszytych w celu uzyskania całego obrazu. Zobacz Rysunek 2 przedstawia trajektorię skanowania systemu UV-PAM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij skanowanie próbne na małym obszarze, ustawiając liczbę ruchomych kroków silników osi x i y (xn = 10 i yn = 1000). Dostosuj stolik ręczny osi z, aby umieścić próbkę na płaszczyźnie ogniskowej w celu uzyskania maksymalnych sygnałów PA.</li>
	<li>Przesuń silniki osi x i y do żądanego punktu początkowego, ustaw region skanowania, ustawiając wartości xn i yn, a następnie uruchom program do akwizycji obrazu (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Po uzyskaniu obrazu wyłącz laser, wyjmij uchwyt na próbkę i przechowuj próbki biologiczne.</li>
	<li>W przypadku świeżych tkanek biologicznych próbki należy przechowywać w 10% neutralnej buforowanej formalinie.</li>
	<li>W przypadku wycinków mózgu myszy FFPE należy wybarwić H&E zgodnie z protokołem określonym w reference20, aby uzyskać odpowiednie obrazy barwione H&E.</li>
	<li>Wykorzystaj zebrane sygnały PA do zrekonstruowania obrazu projekcyjnego o maksymalnej amplitudzie za pomocą algorytmu przetwarzania obrazu zbudowanego w laboratorium (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Kunos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+conservation+surgery+achieving+%E2%89%A5+2+mm+tumor-free+margins+results+in+decreased+local-regional+recurrence+rates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast+Journal%22%5BJournal%5D)">Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates.</a> The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).</li>
<li>Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+microscopy+will+remain+a+cornerstone+of+surgical+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology.</a> Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).</li>
<li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+sublimation%2Frecrystallization+for+imaging+proteins+by+mass+spectrometry+at+high+spatial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution.</a> Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).</li>
<li>Jaafar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-operative+frozen+section+consultation%3A+concepts%2C+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Malaysian+Journal+of+Medical+Sciences%3A+MJMS%22%5BJournal%5D)">Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations.</a> The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4(2006).</li>
<li>Rastogi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts%3A+a+diagnostic+dilemma+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Diagnostic+Research%22%5BJournal%5D)">Artefacts: a diagnostic dilemma - a review.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).</li>
<li>Carrasco-Zevallos, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+intraoperative+optical+coherence+tomography%3A+technology+and+applications+%5BInvited%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited].</a> Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607(2017).</li>
<li>Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+of+cancer+margins+in+tissue+with+multimodal+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy.</a> Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).</li>
<li>Fereidouni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+with+ultraviolet+surface+excitation+for+rapid+slide-free+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).</li>
<li>Tanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-tissue+biopsy+phenotyping+of+three-dimensional+tumours+reveals+patterns+of+cancer+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).</li>
<li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy%3A+A+potential+intraoperative+tool+for+the+detection+of+carcinoma+in+situ+in+human+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).</li>
<li>Orringer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+intraoperative+histology+of+unprocessed+surgical+specimens+via+fibre-laser-based+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027(2017).</li>
<li>Wong, T. T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+label-free+multilayered+histology-like+imaging+of+human+breast+cancer+by+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy.</a> Science Advances. 3 (5), 1602168(2017).</li>
<li>Shen, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of nucleic acids.</a> Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).</li>
<li>Yao, J., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+%26+Photonics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic microscopy.</a> Laser & Photonics Reviews. 7 (5), 1-36 (2012).</li>
<li>Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+label-free+ultraviolet+photoacoustic+microscopy+for+histology-like+imaging+of+unprocessed+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues.</a> Optics Letters. 45 (19), 5401(2020).</li>
<li>Baik, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraoperative+label-free+photoacoustic+histopathology+of+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+%26+Photonics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens.</a> Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124(2021).</li>
<li>Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+enables+ultraviolet+photoacoustic+microscopy+based+histological+imaging+with+near+real-time+virtual+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Photoacoustics%22%5BJournal%5D)">Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining.</a> Photoacoustics. 25, 100308(2022).</li>
<li>Sterile Tissue Harvest | Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest">https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest</a> (2022).</li>
<li>Steps to Tissue Processing for Histopathology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/">https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/</a> (2022).</li>
<li>An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/">https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/</a> (2022).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+photoacoustic+microscopy+with+tissue+clearing+for+high-contrast+histological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Photoacoustics%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging.</a> Photoacoustics. 25, 100313(2022).</li>
<li>Leinonen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B2-amyloid+in+a+frontal+cortical+brain+biopsy+specimen+and+by+positron+emission+tomography+with+carbon+11-labeled+pittsburgh+compound+B%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B.</a> Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).</li>
<li>Imai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ultraviolet+photoacoustic+microscopy+with+multifocal+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation.</a> Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).</li>
</ol>

T. T. W. W. i V. T. C. T. mają udziały finansowe w PhoMedics Limited, która jednak nie wspierała tej działalności. Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podsumowując, zademonstrowano szybki i otwarty system UV-PAM do obrazowania histologicznego. Przedstawiono szczegółowe instrukcje dotyczące konfiguracji systemu, wyrównania optycznego, przygotowania próbki i procedur eksperymentalnych. Dostęp do programu do pozyskiwania obrazów można uzyskać z Github za pośrednictwem linku podanego w Tabeli materiałów. Rozdzielczość poprzeczna obecnego systemu wynosi ~1,2 μm, co zostało eksperymentalnie zmierzone w niedawnej publikacji21. Zobrazowano wycinek mózgu myszy, aby zademonstrować, że obecny system może uzyskać obraz histologiczny w ciągu 18 minut dla obszaru 5 x 5 mm2, co jest typowym rozmiarem biopsji mózgu22. Chociaż oryginalny obraz jest w skali szarości, z pomocą cyfrowego narzędzia do wirtualnego barwienia obsługiwanego przez algorytm głębokiego uczenia, obecny system może dodatkowo dostarczać wirtualnie wybarwione obrazy w czasie zbliżonym do rzeczywistego, zapewniając patologom łatwą adaptację do interpretacji obrazów. Jako technika obrazowania bez etykietowania, obecny system UV-PAM może również dostarczać obrazy histologiczne dla nieprzetworzonych świeżych próbek tkanek. Więcej przykładów (w tym zamrożone i świeże próbki tkanek) przedstawiono w poprzedniej publikacji17. Wyniki eksperymentów wskazują na duży potencjał obecnego systemu UV-PAM wspomaganego głębokim uczeniem się w zastosowaniach SMA.
Jedną z zalet systemu UV-PAM jest to, że system jest realizowany w trybie odbicia, co umożliwia obrazowanie grubych tkanek. Poza tym otwarty system UV-PAM pozwala na umieszczenie próbki na oknie skanującym (membranie zbiornika na próbkę), które działa podobnie jak tradycyjne mikroskopy optyczne. Dlatego system ten jest bardziej przyjazny dla użytkownika niż inne systemy, które wymagają, aby próbki były umieszczone w dwóch membranach11,14. Co więcej, dzięki zastosowaniu GM 1D z laserem UV o wysokiej częstotliwości powtarzania, obecny system UV-PAM może osiągnąć wysoką prędkość obrazowania przy wyższej opłacalności w porównaniu z systemem wykorzystującym wzbudzenie wieloogniskowe23.
Obecnie szybkość obrazowania jest ograniczona głównie przez częstotliwość powtarzania budżetu lasera i fotonów. Dzięki laserowi, który ma wysoką częstotliwość powtarzania i wysoką energię impulsu, czas obrazowania może zostać jeszcze bardziej skrócony. Innym ograniczeniem systemu jest to, że próbkę można tylko z grubsza dostosować do płaszczyzny ogniskowej soczewki obiektywu, znajdując maksymalne sygnały PA, zamiast wyświetlać obraz w czasie rzeczywistym, aby użytkownicy mogli zobaczyć, czy próbka jest ostra. Aby wyświetlić obraz w czasie zbliżonym do rzeczywistego, można zastosować 2D GM.
W protokole występują dwa kluczowe etapy: (a) wymagania konfokalne ognisk optycznych i akustycznych powinny być zoptymalizowane w celu osiągnięcia wysokiej czułości wykrywania; (b) zakres skanowania GM na osi x powinien być mniejszy niż ognisko akustyczne pierścieniowego UT, aby utrzymać podobnie wysoką czułość wykrywania (w obecnej konfiguracji zakres skanowania wynosi ~30 μm ±15 μm). W przeciwnym razie wystąpiłyby oczywiste efekty winietowania wokół krawędzi, gdy wiele obrazów podrzędnych zostanie zszytych w celu uzyskania całego obrazu.

Chirurgiczna analiza marginesu (SMA), która wymaga zbadania próbek tkanek pod mikroskopem, jest niezbędną procedurą do określenia, czy wszystkie komórki rakowe są usuwane z ciała pacjenta podczas operacji resekcji1. Dlatego mikroskop, który może szybko dostarczyć obrazy histologiczne, jest niezwykle ważny dla SMA, aby uniknąć powtarzających się operacji spowodowanych niepełnym usunięciem komórek rakowych. Jednak zgodnie z obecną złotą metodą opartą na mikroskopii optycznej w jasnym polu, wyciętą tkankę należy utrwalić w formalinie, zatopić w parafinie, podzielić na cienkie plasterki (4-7 μm), a następnie wybarwić hematoksyliną i eozyną (H&E) przed obrazowaniem, co jest czasochłonne (3-7 dni) i pracochłonne2,3. Zamrożony skrawek jest szybką alternatywą dla SMA poprzez szybkie zamrażanie, krojenie i barwienie tkanki, co może dostarczyć obrazów histologicznych w ciągu 20-30 min4. Jednak cechy histologiczne są często zniekształcone i wymagają umiejętnego treningu, co utrudnia zastosowanie tej techniki do wielu typów narządów5.
Techniki mikroskopii optycznej, które mogą dostarczyć obrazy komórkowe bez lub z kilkoma etapami przetwarzania tkanek, zostały opracowane dla SMA. Jednak każdy z nich cierpi na inne problemy. Na przykład optyczna tomografia koherentna6 i konfokalna mikroskopia refleksyjna7 mają niską specyficzność ze względu na niski kontrast wewnętrznego rozpraszania. Chociaż mikroskopia z ultrafioletowym wzbudzeniem powierzchniowym8 i mikroskopia z użyciem lekkiego arkusza9 mogą dostarczyć obrazów SMA o wysokiej rozdzielczości i wysokim kontraście, procedura barwienia toksycznego i lotnego zwykle nie może być wykonana na sali operacyjnej, co wydłuża czas realizacji. Mikroskopia wielofotonowa10 i stymulowana mikroskopia Ramana11 mogą dostarczyć bogatych informacji na temat SMA. Jednak wysoki koszt wymaganych ultraszybkich laserów, które są używane do generowania efektów nieliniowych, uniemożliwia ich szerokie zastosowanie.
Niedawno, korzystając z wewnętrznej absorpcji optycznej, opracowano ultrafioletową mikroskopię fotoakustyczną (UV-PAM) bez znaczników, która zapewnia obrazy histologiczne o wysokiej rozdzielczości12. W UV-PAM ENERGIA FOTONÓW WZBUDZONEGO ŚWIATŁA UV (NP. 266 nm) jest najpierw absorbowana przez DNA/RNA w jądrach komórkowych13, a następnie przekształcana w ciepło, indukując emisję fali akustycznej poprzez rozszerzalność termiczno-elastyczną14. Poprzez detekcję generowanych fal akustycznych, dwuwymiarowe (2D) obrazy UV-PAM jąder komórkowych można uzyskać poprzez projekcję maksymalnej amplitudy sygnałów akustycznych, dostarczając informacji histologicznych dla SMA. Aby umożliwić kliniczne zastosowania UV-PAM, opracowano szybki UV-PAM oparty na skanowaniu lustrzanym galwanometru, który zapewnia obrazy histologiczne dla próbki biopsji mózgu (5 mm x 5 mm) w ciągu 18 minut, wykazując duży potencjał w zastosowaniach wrażliwych na czas15. Aby jeszcze bardziej zweryfikować możliwość zastosowania promieniowania UV-PAM w obrazowaniu grubych tkanek, zaproponowano system UV-PAM w trybie odbicia z wodoodpornym jednoosiowym skanerem systemów mikroelektromechanicznych, który z powodzeniem zademonstrował śródoperacyjne badanie histopatologiczne tkanek ludzkiej okrężnicy i wątroby16. Ponieważ oryginalny obraz UV-PAM jest w skali szarości, podczas gdy złoty standard obrazu barwionego H&E jest w kolorach różowym i fioletowym, patologom trudno jest bezpośrednio zinterpretować obrazy UV-PAM. Aby rozwiązać ten problem, zaproponowano algorytm głębokiego uczenia się, który umożliwia przenoszenie obrazów UV-PAM w skali szarości do wirtualnych obrazów barwionych H&E w czasie zbliżonym do rzeczywistego, dzięki czemu patolodzy mogą zrozumieć obrazy bez dodatkowego szkolenia17.
Ta praca opisuje szybki i otwarty system UV-PAM, który może być obsługiwany podobnie jak konwencjonalne mikroskopy optyczne, dostarczając zarówno oryginalne obrazy histologiczne w skali szarości, jak i wirtualnie barwione obrazy wspomagane algorytmem głębokiego uczenia. Wycinek mózgu myszy utrwalony w formalinie i zatopiony w parafinie (FFPE) jest obrazowany przez system UV-PAM w celu wykazania podobieństwa między naszymi wirtualnie wybarwionymi promieniami UV-PAM a standardowymi obrazami barwionymi H&E, co pokazuje jego potencjał w zastosowaniach SMA.

<table><tbody><tr><td>Alkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1373</td><td>Wzmacniacz odwadniania próbki</td></tr><tr><td></td><td>Mini Circuit</td><td>ZFL-500LN-BNC+</td><td>Kontroler wzmocnienia sygnału ultradźwiękowego</td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>NI myRIO</td><td>Kontroler systemu</td></tr><tr><td>Karta akwizycji danych</td><td>Alazar Technologies</td><td>ATS9350</td><td>Ultradźwiękowe zbieranie sygnałów</td></tr><tr><td>Głębokie uczenie </td><td></td><td></td> algorytm <td>Do przesyłania obrazu UV-PAM w skali szarości do wirtualnego H& Obraz barwiony elektronicznie; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM</td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R04586</td><td>Utrwalanie próbki</td></tr><tr><td>H& Zestaw do barwienia E</td><td>Abcam</td><td>ab245880</td><td>Barwienie próbki</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-202</td><td>Deparafinowanie próbki</td></tr><tr><td>Program do akwizycji obrazu</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td>Program zbudowany w laboratorium przy użyciu LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM</td></tr><tr><td>Algorytm przetwarzania obrazu</td><td>Mathworks</td><td>MATLAB</td><td>Algorytm zbudowany w laboratorium przy użyciu MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM</td></tr><tr><td>Mocowania platformy kinematycznej</td><td>Thorlabs</td><td>KM200B</td><td>Dostosuj próbkę, aby była płaska</td></tr><tr><td>Folia</td><td>Glad</td><td>Cling Wrap</td><td>Umieszczony w zbiorniku na próbki</td></tr><tr><td>Soczewka obiektywu mikroskopu</td><td>Thorlabs</td><td>LMU-5X-NUV</td><td>Soczewka obiektywu</td></tr><tr><td>Stopnie zmotoryzowane</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-509.10SD00</td><td>Etapy skanowania</td></tr><tr><td>Jednowymiarowe lustro galwanometryczne</td><td>Thorlabs</td><td>GVS411</td><td>Szybkie lustro skanujące</td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>RIGOL Technologie</td><td>DS1102E</td><td>Ultradźwiękowy odczyt sygnału</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td>Mycie próbek</td></tr><tr><td>Otworek</td><td>Edmund Optics</td><td>#59&ndash; 257</td><td>Filtrowanie przestrzenne Soczewka</td></tr><tr><td>wypukła Plano</td><td>Thorlabs</td><td>LA-4600-UV</td><td>Soczewka skupiająca</td></tr><tr><td>Wypukła soczewka Plano</td><td>Thorlabs</td><td>LA-4663-UV</td><td>Soczewka kolimacyjna</td></tr><tr><td>Pulser/odbiornik</td><td>Imaginant</td><td>DPR300</td><td>Wzmacniacz echa impulsowego</td></tr><tr><td>Laser półprzewodnikowy pompowany diodą Q-switch</td><td>Jasne rozwiązania</td><td>WEDGE HF 266</td><td>nm Laser</td></tr> <tr><td>266 nmPrzetwornik ultradźwiękowy w kształcie pierścienia</td><td>Uniwersytet Południowej Kalifornii</td><td></td><td>Detekcja sygnału ultradźwiękowego</td></tr><tr><td>Uchwyt na próbkę</td><td>Wykonany</td><td></td><td>w laboratorium Trzymaj zbiornik na</td></tr><tr><td>próbki Zbiornik na próbki</td><td>Wykonane</td><td></td> w laboratorium <td>Trzymaj próbki biologiczne</td></tr><tr><td>Jednoosiowy stopień translacyjny Z</td><td>Thorlabs</td><td>PT1</td><td>Stopień ręczny</td></tr><tr><td>Dwuosiowy stopień ręczny</td><td>Thorlabs</td><td>LX20</td><td>Etap ręczny</td></tr><tr><td>Zbiornik na wodę</td><td>Laboratoryjna</td><td></td><td>transmisja sygnału ultradźwiękowego</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>XX0060</td><td>Czyszczenie próbki</td></tr></tbody></table>

szybka mikroskopia fotoakustyczna w ultrafiolecie do obrazowania histologicznego z wirtualnym barwieniem wspomagana przez głębokie uczenie

High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning

Chirurgiczna analiza marginesu (SMA), niezbędna procedura potwierdzająca całkowite wycięcie tkanki nowotworowej w chirurgii resekcji guza, wymaga śródoperacyjnych narzędzi diagnostycznych, aby uniknąć powtarzających się operacji z powodu dodatniego marginesu chirurgicznego. Ostatnio, wykorzystując wysoką wewnętrzną absorpcję optyczną DNA/RNA o długości fali 266 nm, opracowano ultrafioletową mikroskopię fotoakustyczną (UV-PAM), która zapewnia obrazy histologiczne o wysokiej rozdzielczości bez znakowania, co jest bardzo obiecujące jako śródoperacyjne narzędzie do leczenia SMA. Aby umożliwić opracowanie UV-PAM dla SMA, zaprezentowano tutaj szybki i otwarty system UV-PAM, który może być obsługiwany podobnie jak konwencjonalne mikroskopy optyczne. System UV-PAM zapewnia wysoką rozdzielczość boczną 1,2 μm i wysoką prędkość obrazowania wynoszącą 55 kHz z częstotliwością A z jednoosiowym skanowaniem lustrzanym galwanometrem. Ponadto, aby obrazy UV-PAM mogły być łatwo interpretowane przez patologów bez dodatkowego szkolenia, oryginalne obrazy UV-PAM w skali szarości są wirtualnie barwione przez algorytm głębokiego uczenia się, aby naśladować standardowe obrazy barwione hematoksyliną i eozyną, umożliwiając analizę histologiczną bez konieczności trenowania. Obrazowanie wycinków mózgu myszy jest wykonywane w celu zademonstrowania wysokiej wydajności otwartego systemu UV-PAM, ilustrując jego ogromny potencjał w zastosowaniach SMA.

Rysunek 1 przedstawia schemat szybkoszybkiego systemu UV-PAM. W tej konfiguracji ścieżki wzbudzenia optycznego i detekcji ultradźwiękowej znajdują się po tej samej stronie, poniżej próbki, tworząc system w trybie odbiciowym z otwartą górą. Dzięki temu jest on łatwy w obsłudze i odpowiedni do obrazowania grubych próbek.
Rycina 2 przedstawia trajektorię skanowania systemu UV-PAM podczas obrazowania. Podobraz każdej sekcji (np. obszaru 5 mm x 30 µm) jest najpierw generowany za pomocą algorytmu interpolacji rozproszonej, a następnie cały obraz (np. obszaru 5 mm x 5 mm) jest uzyskiwany poprzez zszywanie wszystkich podobrazów przy użyciu niestandardowego algorytmu przetwarzania obrazu (patrz Tabela materiałów).
Rysunek 3A oraz Rysunek 3B przedstawiają odpowiednio obrazy UV-PAM i H&amp;E przekroju mózgu myszy utrwalonego w FFPE, oba o polu widzenia 5 x 5 mm2. Algorytm przetwarzania obrazów jest dostępny w serwisie Github poprzez link podany w Tabeli materiałów. Czas akwizycji obrazu wyniósł mniej niż 18 min. Rysunek 3C-F przedstawiają powiększone obrazy obszarów zaznaczonych na Rysunku 3A, na których wyraźnie widać poszczególne jądra komórkowe. Co ważniejsze, odpowiadające im jądra komórkowe można odnaleźć na standardowych obrazach barwionych H&amp;E (Rysunek 3G-J), co wykazuje wysoką dokładność obecnego systemu w obrazowaniu komórkowym. W celu przekształcenia obrazu UV-PAM w skali szarości w wirtualny obraz barwiony H&amp;E zastosowano algorytm głębokiego uczenia17 (patrz Tabela materiałów), który przetwarza obraz o rozdzielczości 8000 x 8000 pikseli w czasie krótszym niż 30 s. Odpowiednie powiększone obrazy przedstawiono na Rysunku 3K-N. Wirtualnie barwione obrazy UV-PAM dostarczają niemal takich samych informacji strukturalnych jak obrazy barwione H&amp;E, co rokuje pomyślnie w kwestii translacji klinicznej obecnego systemu UV-PAM.
<img alt="Schemat układu obrazowania fotonicznego z laserem UV, uchwytem próbki i przetwornikiem ultradźwiękowym; akwizycja danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63649/63649fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat szybkiego systemu UV-PAM z otwartą górą. (A) Konfiguracja układu. (B) Zdjęcie uchwytu próbki i zbiornika z wodą przymocowanego do dwuosiowej platformy manualnej. (C) Zdjęcie pierścieniowego przetwornika ultradźwiękowego zamocowanego w zbiorniku z wodą oraz zbiornika z próbką zakrywającego otwór w uchwycie próbki. (D) Zdjęcie zbiornika z próbką wraz z membraną i próbką, które zostaną umieszczone na uchwycie próbki. UV: ultrafiolet; DAQ: karta akwizycji danych; GM: lustro galwanometryczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63649/63649fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ sprężyn helikalnych na wykresie x-y; schemat ilustruje okresowość przestrzenną; zaznaczono jednostki 30μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63649/63649fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Trajektoria skanowania systemu UV-PAM podczas obrazowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63649/63649fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie tkanki mózgowej w UV-PAM i H&amp;E; schemat przedstawia analizę histologiczną poprzez barwienie wirtualne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63649/63649fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wyniki eksperymentalne obrazowania UV-PAM z wykorzystaniem wirtualnego barwienia opartego na głębokim uczeniu. (A) Obraz UV-PAM przekroju mózgu myszy utrwalonego w FFPE. (B) Standardowy obraz tego samego przekroju barwionego H&amp;E. Paski skali: 1 mm. (C-F) Powiększone obrazy zaznaczonych obszarów z A. (G-J) Odpowiadające im obrazy obszarów zaznaczonych w B barwione H&amp;E. (K-N) Odpowiadające im obrazy barwione wirtualnie przy użyciu algorytmu głębokiego uczenia. Paski skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63649/63649fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Pokazano szybki i otwarty ultrafioletowy mikroskop fotoakustyczny, który może śródoperacyjnie dostarczać obrazy histologiczne do chirurgicznej analizy marginesów, w tym konfiguracji systemu, wyrównania optycznego, przygotowania próbki i procedur eksperymentalnych.

Szybka mikroskopia fotoakustyczna w ultrafiolecie do obrazowania histologicznego z wirtualnym barwieniem wspomagana przez głębokie uczenie

Surgical margin analysis (SMA), an essential procedure to confirm the complete excision of cancerous tissue in tumor resection surgery, requires ...

Śródoperacyjna analiza monitora chirurgicznego jest nadal dużym wyzwaniem w operacjach resekcji guza, ponieważ wymaga narzędzia diagnostycznego, aby dokładnie i szybko potwierdzić złożone wycięcie tkanki nowotworowej. Dzięki temu możliwe jest uniknięcie powtarzających się operacji ze względu na dodatni margines chirurgiczny. Nasza szybka, ultrafioletowa mikroskopia fotoakustyczna z otwartym dachem może dostarczyć znakowane obrazy histologiczne próbek tkanek w ciągu 18 minut z obszarem obrazowania o wymiarach pięć na pięć milimetrów kwadratowych, wykazując duży potencjał w śródoperacyjnej analizie marginesów chirurgicznych.Procedurę zademonstruje Xiufeng Li, doktorant ostatniego roku z mojego laboratorium. Zacznij od ustawienia oświetlenia optycznego dla systemu mikroskopowego za pomocą lasera na ciele stałego pompowanego diodą Q-switch o długości fali 266 nanometrów jako źródła wzbudzenia. Zainstaluj dwie wypukłe soczewki, aby rozszerzyć wiązkę laserową i umieść otwór w pobliżu punktu ogniskowego pierwszej wypukłej soczewki w celu filtrowania przestrzennego.Użyj lustra galwanometru 1D, aby odbić wiązkę lasera w górę. Za pomocą soczewki obiektywowej skoncentruj wiązkę lasera na próbce. Zamocuj UT w kształcie pierścienia z obszarem aktywnym skierowanym do góry w laboratoryjnym zbiorniku na wodę z optycznie przezroczystym okienkiem na dole pokrytym cienkim kwarcowym szkiełkiem nakrywkowym, a następnie przymocuj zbiornik na wodę do dwuosiowego ręcznego stolika mikroskopu, aby kontrolować boczne położenie UT. Po zakończeniu włącz laser UV i dostosuj położenie UT, aby wiązka laserowa mogła przejść przez środek UT, a następnie wyłącz laser UV i napełnij zbiornik na wodę wodą dejonizowaną, aby całkowicie zanurzyć UT. Podłącz wyjście UT do dwóch amplifier, aby uzyskać łączne wzmocnienie 56 decybeli, a następnie podłącz wyjście drugiego amplifier do karty akwizycji danych lub DAQ zainstalowanej w komputerze.Następnie przymocuj uchwyt próbki do ręcznego stolika w osi Z połączonego ze stopniami z napędem xy, a następnie umieść cztery kawałki taśmy dwustronnej otaczające pusty otwór uchwytu na próbkę. Później przystąp do wyrównania systemu, przymocowując czarną taśmę do szklanego szkiełka, a następnie umieszczając szklane szkiełko tak, aby zakryło otwór uchwytu próbki czarną taśmą skierowaną w dół. Po naciśnięciu szkiełka podstawowego na uchwycie na próbkę, opuść uchwyt na próbkę, aby zanurzyć szkiełko w wodzie.Odłącz UT w kształcie pierścienia i amplifiery, a następnie podłącz UT do pulsera/odbiornika, a wyjście impulsera/odbiornika do oscyloskopu. Przełącz pulsator/odbiornik w tryb echa impulsowego z amplitudą impulsu sześć i wzmocnieniem na poziomie 20 decybeli. Po ustawieniu parametrów wyreguluj pozycję Z uchwytu próbki, określ położenie akustycznej płaszczyzny ogniskowej, w której sygnały ultradźwiękowe są maksymalne.Zmień impuls/odbiornik na tryb transmisji przed ustawieniem wzmocnienia na 60 decybeli, a następnie włącz wyjście laserowe i dostosuj pozycję z soczewki obiektywu, aby zmaksymalizować sygnały fotoakustyczne lub PA mierzone przez oscyloskop. Aby wygenerowany sygnał PA był symetryczny i maksymalny, wyreguluj boczne położenie UT w kształcie pierścienia, a następnie wyreguluj pozycję z uchwytu próbki, aby zmaksymalizować sygnały PA. Powtórz regulacje pozycji z soczewki obiektywu i uchwytu próbki, aby zoptymalizować symetrię i amplitudę sygnałów PA.Gdy sygnały PA są zoptymalizowane, zapisz opóźnienie czasowe lub czas potrzebny falom PA na dotarcie do UT na oscyloskopie. Przesuń uchwyt próbki, aby zobrazować różne pozycje czarnej taśmy. Dostosuj płaskość uchwytów na próbki w taki sposób, aby sygnały PA generowane z każdej pozycji czarnej taśmy miały takie samo opóźnienie czasowe, jak zmierzone wcześniej.Po zakończeniu wyrównywania systemu wyłącz laser i podłącz UT do dwóch amplifiers. Aby przygotować utrwalony w formalinie i zatopiony w parafinie wycinek mózgu myszy, utrwal pobrany mózg w 10% neutralnej buforowanej formalinie. Po 24 godzinach przetworzyć utrwalony mózg poprzez odwodnienie stopniowanym alkoholem, oczyszczenie ksylenem i zatopienie parafiną.Użyj mikrotomu, aby uzyskać pięciomikrometrowe plasterki osadzonego mózgu. Umieść plastry próbki na szkiełkach kwarcowych do wyschnięcia w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Później odparafinowaj sekcje mózgu za pomocą środka czyszczącego, aby uniknąć wysokich sygnałów tła parafiny.Aby przygotować świeży wycinek mózgu myszy, umyj zebrany mózg myszy PBS, a następnie ręcznie pokrój pięciomilimetrowy plasterek próbki mózgu, a następnie umyj wycinek mózgu PBS, aby usunąć krew z przekroju poprzecznego. Do umieszczenia próbki należy przygotować laboratoryjny zbiornik na próbkę z przezroczystą membraną polietylenową UV o grubości 10 mikrometrów, a następnie dodać kroplę wody do membrany i umieścić próbkę biologiczną w zbiorniku próbki, aby przykryć wodę. Następnie umieść zbiornik zawierający próbkę na uchwycie próbki, upewniając się, że zakrywa pusty otwór uchwytu na próbkę.Ustaw laser UV w trybie wyzwalania zewnętrznego i użyj programu do wglądu laboratoryjnego zbudowanego w laboratorium, aby ustawić parametry skanowania zgodnie z opisem w manuskrypcie. Rozpocznij skanowanie próbne na małym obszarze, ustawiając liczbę ruchomych kroków silników osi x i y, a następnie dostosuj stolik ręczny osi z, aby umieścić próbkę na płaszczyźnie ogniskowej w celu uzyskania maksymalnych sygnałów PA. Po przesunięciu silników osi x i y do żądanego punktu początkowego i ustawieniu regionu skanowania poprzez ustawienie wartości xn i yn, uruchom program do akwizycji obrazu.Gdy obrazy są wymagane, wyłącz laser i wyjmij uchwyt na próbkę. Przechowuj świeże tkanki biologiczne w 10% neutralnej buforowanej formalinie. Wykorzystaj zebrane sygnały PA do zrekonstruowania obrazu projekcyjnego o maksymalnej amplitudzie za pomocą algorytmu przetwarzania obrazu zbudowanego w laboratorium.Reprezentatywna analiza pokazuje obrazy UV-PAM i H&E wycinka mózgu myszy FFPE. Na powiększonym obrazie UV-PAM można było rozdzielić poszczególne jądra komórkowe. Odpowiednie jądra komórkowe znaleziono na standardowych obrazach barwionych H&E, co świadczy o wysokiej dokładności obecnego systemu obrazowania komórkowego.Zastosowano algorytm głębokiego uczenia się w celu przeniesienia obrazu UV-PAM w skali szarości na wirtualny obraz barwiony H&E. Ważne jest, aby dostosować położenie przetwornika ultradźwiękowego w kształcie pierścienia, aby umożliwić przejście światła UV przez środek podczas wyrównywania systemu. Dzięki temu można uzyskać wykrywalny sygnał fotoakustyczny i dalej go optymalizować, gdy laser jest włączony.Nasz algorytm klasyfikacji może być dalej stosowany do klasyfikowania guza i obszarów normalnych na obrazach, służąc jako obrazowanie wspomagające i platforma diagnostyczna dla lekarzy.

high-speed-ultraviolet-photoacoustic-microscopy-for-histological

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej (OR-PAM) to rozwijająca się technologia umożliwiająca obrazowanie kontrastów absorpcji optycznej in vivo z rozdzielczością i czułością na poziomie komórkowym. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcję wizualną dotyczącą protokołów eksperymentalnych OR-PAM, obejmującą konfigurację systemu, jego kalibrację, typowe procedury eksperymentalne in vivo oraz schematy obrazowania funkcjonalnego.

Trójwymiarowa mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej

Oftalmologia fotoakustyczna (PAOM), będąca modalnością obrazowania opartą na absorpcji optycznej, umożliwia uzupełniającą ocenę siatkówki w stosunku do obecnie dostępnych technologii obrazowania okulistycznego. Przedstawiamy zastosowanie PAOM zintegrowanego z optyczną koherencyjną tomografią w domenie widmowej (SD-OCT) do jednoczesnego multimodalnego obrazowania siatkówki u szczurów.

Zintegrowana fotoakustyczna oftalmoskopia i optyczna koherentna tomografia w dziedzinie widmowej

Tutaj ilustrujemy protokół obrazowania za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED, cytotoksycznej synapsy immunologicznej komórek NK rekapitulowanej na szkle. Za pomocą tej metody uzyskujemy rozdzielczość sub-100 nm białek synapsy i cytoszkieletu.

Wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED (Time-Gated Stimulated Emission Depletion)

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Poniżej przedstawiamy szczegółowy opis eksperymentalnego protokołu obrazowania z nowo opracowanym ręcznym systemem optoakustycznym (fotoakustycznym) do trójwymiarowego obrazowania funkcjonalnego i molekularnego w czasie rzeczywistym. Wykazana wysoka wydajność i wszechstronność mogą zdefiniować nowe obszary zastosowań technologii optoakustycznej w badaniach przedklinicznych i praktyce klinicznej.

Uniwersalna ręczna trójwymiarowa sonda do obrazowania optoakustycznego do angiografii tkanek głębokich i funkcjonalnych badań przedklinicznych w czasie rzeczywistym

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.

Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

Tutaj demonstrowany jest system do przełączania rozdzielczości akustycznej (AR) i rozdzielczości optycznej (OR) MIKROSKOPII FOTOAKUSTYCZNEJ (AR-OR-PAM), zdolny zarówno do obrazowania w wysokiej rozdzielczości na płytkiej głębokości, jak i obrazowania głębokich tkanek o niskiej rozdzielczości na tej samej próbce in vivo.

Przełączana mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości akustycznej i optycznej do obrazowania naczyń krwionośnych in vivo małych zwierząt

Kliniczny ręczny system obrazowania fotoakustycznego zostanie zademonstrowany do nieinwazyjnego obrazowania małych zwierząt w czasie rzeczywistym.

Ręczny kliniczny system obrazowania fotoakustycznego do nieinwazyjnego obrazowania małych zwierząt w czasie rzeczywistym

Zaprojektowano dwurastrowy skaner fotoakustyczny, który integrował obrazowanie szerokokątne i obrazowanie w czasie rzeczywistym.

Fotoakustyczny aparat do obrazowania małych zwierząt z podwójnym skanowaniem rastrowym do wizualizacji naczyń krwionośnych

Opisana tutaj jest metoda, która może być użyta do zobrazowania pięciu lub więcej parametrów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przedstawiono proces analityczny służący do wyodrębniania pojedynczych komórek z tych obrazów i przeprowadzania analizy pojedynczych komórek za pomocą strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej, które mogą identyfikować podzbiory komórek w sekcjach tkanki.

Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej

Odkryj szybką mikroskopię fotoakustyczną w ultrafiolecie wspomaganą głębokim uczeniem do wirtualnego barwienia tkanek. System generuje obrazy histologiczne w 18 minut, wspierając precyzyjną analizę marginesów chirurgicznych.

Szybka mikroskopia fotoakustyczna w ultrafiolecie do obrazowania histologicznego z wirtualnym barwieniem wspomagana przez głębokie uczenie (Wideo) | JoVE Journal

Szybka mikroskopia fotoakustyczna w ultrafiolecie do obrazowania histologicznego z wirtualnym barwieniem wspomagana przez głębokie uczenie

Przeglądaj więcej filmów