Profilowanie całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny-DNA u Candida albicans: kompleksowa metoda CUT&RUN i przepływ pracy analizy danych

Protokół ten szczegółowo opisuje wszystkie procedury eksperymentalne, od znakowania epitopów genów kodujących czynnik transkrypcyjny, poprzez obliczeniową analizę danych, po przeprowadzenie profilowania całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny i DNA u Candida albicans za pomocą CUT&RUN. Jest to bardziej dostępna, szybsza, bardziej czuła, tańsza technika i zapewnia wyższą jakość danych niż tradycyjne podejścia ChIP-chip i ChIP-seq. Chociaż nasz protokół został opracowany dla komórek Candida albicans wyizolowanych z biofilmów lub kultur planktonowych, praktyczne powinno być dostosowanie go do praktycznie każdej dobrej formy komórek Candida albicans.

Po inkubacji zawiesiny komórkowej przenieść pięciomikrolitrową porcję do nowej probówki do PCR. Do pięciu mikrolitrów wyizolowanych jąder i pięciomikrolitrowej porcji nienaruszonych komórek, przechowywanych uprzednio w temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodać po jednym mikrolitrze kalkofluor-białego i SYTO 13. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza w ciemności przez 30 minut.

Wizualnie sprawdzić integralność i czystość izolowanych jąder za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Poszukaj izolowanych jąder wykazujących wyraźne zabarwienie SYTO 13 i upewnij się, że nie ma barwienia ścian komórkowych przez biały barwnik kalkofluorowy. Powtórzyć inspekcję z nienaruszonymi komórkami jako kontrolę barwienia ścian komórkowych barwnikiem kalkofluorowo-białym.

Umieść probówki na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż gnojowica będzie całkowicie czysta. Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Dodać 50 mikrolitrów buforu przeciwciał i delikatnie wymieszać pipetując.

Dodać trzy mikrolitry przeciwciała poliklonalnego anty-GFP do probówek i inkubować probówki na mieszalniku nutującym w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Krótko odwirować probówki w temperaturze pokojowej 100 razy g przez pięć sekund i umieścić probówki na stojaku magnetycznym. Gdy zawiesina jest klarowna, wyrzucić supernatant za pomocą pipety.

Podczas gdy probówki z kulkami nadal znajdują się na stojaku magnetycznym, dodaj 200 mikrolitrów lodowatego buforu przepuszczalności komórek bezpośrednio na kulki. Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Powtórz dwa płukania z lodowatym buforem do przenikania komórek.

Do każdej probówki dodać 50 mikrolitrów lodowatego buforu do przepuszczalności komórek i delikatnie wymieszać pipetując. Dodać 2,5 mikrolitra białka AG-MNazy do każdej próbki i wymieszać pipetując. Umieścić próbki w mieszalniku nutacyjnym w temperaturze 4 stopni Celsjusza i inkubować próbki przez godzinę.

Krótko odwirować probówki paskowe w temperaturze 100 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć sekund, a następnie umieścić probówki na stojaku magnetycznym. Gdy zawiesina jest klarowna, wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Podczas gdy probówki z kulkami nadal znajdują się na stojaku magnetycznym, dodaj 200 mikrolitrów lodowatego buforu przepuszczalności komórek bezpośrednio na kulki.

Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Powtórz dwa płukania z lodowatym buforem do przenikania komórek. Dodać 100 mikrolitrów lodowatego buforu do przepuszczalności komórek do próbek i delikatnie pipetować w górę iw dół pięć razy.

Wyjmij odlew żelowy z pudełka na żel i otwórz odlew żelowy zgodnie z instrukcjami producenta. Delikatnie wyjmij żel z odlewu żelowego i umieść go w tacce na żel zawierającej 100 mililitrów KZM o pojedynczej mocy. Dodaj 10 mikrolitrów barwnika z żelu kwasu nukleinowego do tacki i delikatnie zamieszaj.

Przykryj folią w celu ochrony przed światłem i inkubuj statycznie w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie spłucz żel dwukrotnie 100 mililitrami dejonizowanej wody z kranu. Zobrazuj żel w świetle niebieskim za pomocą bursztynowej osłony filtra.

Dla każdej biblioteki przetnij żel nieco powyżej około 125 par zasad wydatnego pasma dimerów adaptera i poniżej znaku drabinki 400 par zasad. Nakłuj spód rurki o pojemności 0,65 mililitra za pomocą igły o rozmiarze 22 i umieść przebitą rurkę w sterylnej dwumililitrowej probówce do mikrofugi. Przenieś plasterek żelu do nakłutej probówki wewnątrz dwumililitrowej probówki do mikrofuge.

Odwirować dwumililitrową probówkę do mikrofugi zawierającą 0,65-mililitrową nakłutą probówkę i próbkę o masie 10 000 razy g w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, aby zebrać zawiesinę żelu wewnątrz dwumililitrowej probówki do mikrofugi. Dodaj 300 mikrolitrów lodowatego żelowego buforu elucyjnego do zawiesiny żelu. Mieszaj na nutatorze w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy godziny lub przez noc.

Przenieś całą zawiesinę cieczy i żelu do kolumny filtracyjnej o średnicy 0,22 mikrometra i odwiruj pod ciśnieniem 10 000 g w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Pobierz kod źródłowy do analizy CUT&RUN ze strony GitHub, klikając zielony przycisk Kod, a następnie opcję Pobierz ZIP. Rozpakuj folder do odpowiedniej lokalizacji na komputerze lokalnym.

Zainstaluj środowisko Conda i uruchom je tylko raz. Po zainstalowaniu Conda utwórz środowisko wirtualne dostarczone z odpowiednim poleceniem. Aktywuj środowisko wirtualne za każdym razem, gdy ten przepływ pracy jest wykonywany.

Trawienie ściany komórkowej i integralność jądrową oceniano, wizualizując zarówno kontrolne nienaruszone komórki, jak i izolowane jądra wybarwione fluorescencyjnymi barwnikami ściany komórkowej i kwasów nukleinowych. W przeciwieństwie do izolowanych nienaruszonych jąder, w których nie obserwuje się barwienia ścian komórkowych, zarówno jądra, jak i ściany komórkowe są znakowane fluorescencyjnie w nienaruszonych komórkach kontrolnych. Rysunek przedstawia biblioteki TF CUT&RUN analizowane za pomocą przyrządu do elektroforezy kapilarnej.

Udane biblioteki TF CUT&RUN są wzbogacane o krótkie fragmenty mniejsze niż 200 par zasad. Nieoptymalne biblioteki TF CUT&RUN wykazują wzbogacenie dla dużych fragmentów DNA. Rysunek ten pokazuje, że motywy wiążące DNA Ndt80 są wzbogacone we wszystkich loci związanych z Ndt80 zidentyfikowanych przez CUT&RUN, co wskazuje, że dodatkowe piki zidentyfikowane za pomocą tej metodologii są prawdopodobnie prawdziwymi miejscami związanymi z Ndt80.

Analiza porównawcza wykazała, że protokół CUT&RUN zidentyfikował większość znanych wcześniej zdarzeń wiązania Ndt80 i Efg1 podczas tworzenia biofilmu. Ogólnie rzecz biorąc, zarówno Ndt80, jak i Efg1 związane z loci pokrywają się z wcześniej opublikowanymi danymi ChIP dotyczącymi wytrącania immunologicznego chromatyny i są identyfikowane tylko za pomocą CUT&RUN. Pozwala nam to na znaczne zwiększenie zakresu i tempa naszych badań skoncentrowanych na transkrypcyjnych sieciach regulacyjnych i Candida albicans.