Name: Profilowanie całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny-DNA u Candida albicans: kompleksowa metoda CUT and RUN i przepływ pracy analizy danych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj metodę CUT&RUN do profilowania interakcji czynnik transkrypcyjny-DNA u Candida albicans. Technika ta jest szybsza, bardziej czuła i tańsza niż tradycyjne metody ChIP-seq.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim byłym i obecnym członkom laboratoriów Nobile i Hernday za opinie na temat manuskryptu. Ta praca została wsparta przez National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) numer R35GM124594 oraz przez rodzinę Kamangar w formie ufundowanej katedry dla C.J.N. Praca ta była również wspierana przez NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) nagroda numer R15AI137975 dla A.D.H. C.L.E. była wspierana przez stypendium NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) numer F31DE028488. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie reprezentują one poglądów fundatorów. Fundatorzy nie odegrali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu rękopisu; lub w decyzji o publikacji wyników.

1. Epitope Tagging of C. albicans strains
<ol>
	<li>Upload the gene of interest, along with its 1 kb upstream and downstream flanking sequences, from the Candida Genome Database to the primer design tool (see the Table of Materials). Design a guide RNA (gRNA) by highlighting 50 bp upstream and downstream from the stop codon, and click the gRNA selection tool on the right. Select Design and Analyze Guides. Use the Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) genome and an NGG (SpCas9, 3' side) protospacer adjacent motif (PAM) for the guide parameters, and click Finish. Figure 1 describes the workflow for epitope tagging a C. albicans gene of interest with enhanced green fluorescent protein (eGFP).
	<ol>
		<li>On the subsequent page, confirm the target region for gRNA design and press the green button. Sort gRNAs by the On-Target Score. 
		NOTE: The primer design tool computes on-target and off-target scores to quantify the specificity of the gRNAs. An ideal guide has an on-target score of >60, an off-target score of ~33, and overlaps the stop codon. This enables high gRNA specificity while ablating gRNA targeting after GFP integration. A gRNA with an off-target score of ~50 indicates allelic variation; thus, only one allele will be recognized by the gRNA.</li>
		<li>Add the sequences (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') and (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') to the 5' and 3' ends, respectively, of the 20 bp gRNA target sequence, creating a 60 bp primer/oligonucleotide. Alternatively, copy the 20 bp sequence to the gRNA calculator supplied by Nguyen et al.15. Order the 60 bp custom gRNA oligonucleotide.</li>
		<li>Amplify the "universal A fragment" with 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3') and 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') and the "unique B fragment" with the custom 60 bp gRNA oligonucleotide (100 mM) from step 1.1.2. and 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3') using pADH110 (plasmid repository ID# 90982) and pADH139 (plasmid repository ID# 90987), respectively, as template DNA. Use the PCR reaction and cycling conditions provided in Table 1. 
		NOTE: pADH139 is specific to strains that carry the heterologous Candida maltosa LEU2 marker. If using a strain with a single copy of the C. albicans LEU2 gene, substitute pADH119 (plasmid repository ID# 90985) in place of pADH139.</li>
		<li>Confirm successful amplification by checking 5 µL of the PCR on a 1% agarose gel. Look for ~1 kb A and B fragment amplicons.</li>
		<li>Mix 1 µL each of A and B fragments and stitch them together using the PCR reaction and cycling conditions provided in Table 2 to create a full-length C fragment.</li>
		<li>Add 0.5 µL of 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') and 0.5 µL of 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') to each PCR reaction, mix well by pipetting, and complete the cycling conditions listed in Table 3. 
		NOTE: If using pADH119 in place of pADH139, substitute AHO1238 (5'-TGTATTTTGTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTTC-3') in place of AHO1453.</li>
		<li>Confirm proper stitching and amplification of the C fragment by checking 5 µL of the PCR on a 1% agarose gel. Look for a ~2 kb amplicon. Store the C fragment at -20 °C until ready for use. 
		NOTE: If stitching and amplification results in multiple, nonspecific bands or smearing, perform a PCR cleanup of the A and B fragments and repeat from step 1.1.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Add the entire CTG-optimized monomeric eGFP with linker sequence (RIPLING)16 (pCE1, plasmid repository ID# 174434) immediately upstream of the stop codon of the gene of interest using the primer design tool, creating a C-terminal translational fusion. Use this construct to design oligonucleotides for amplifying the donor DNA (dDNA) from pCE1.
	<ol>
		<li>Design a forward oligonucleotide with 18-22 bp homology to the linker sequence and >50 bp homology to the 3' end of the open reading frame (ORF). 
		NOTE: The 18-22 bp homology creates an annealing temperature for amplification between 55 °C and 58 °C. If the full-length oligonucleotide forms primer dimers, adjust homology to the linker sequence/GFP or the genome accordingly.</li>
		<li>Create a reverse oligonucleotide with 18-22 bp homology to the 3' end of GFP and >50 bp homology to the downstream noncoding sequence of the ORF to be tagged.</li>
		<li>Order these oligonucleotides and amplify the dDNA using the provided touchdown PCR cycling conditions in Table 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Design two sets of colony PCR (cPCR) oligonucleotides for confirming the integration of GFP by amplifying across the flanking integration sites. First, select the forward dDNA oligonucleotide using the primer design tool and click the Primer button on the right.
	<ol>
		<li>Click Create Primers | Wizard | Tm Param and confirm that the algorithm is set to SantaLucia 1998. Click Use Selection to input the coordinates of the forward oligonucleotide designed in 1.2.1 as the target sequence.</li>
		<li>Set the optimal primer temperature to 55 °C and the maximum amplicon size to 900 bp, and click the Generate Primers button at the top right.</li>
		<li>Select the oligonucleotide pair with the lowest penalty score and confirm that the primers amplify across the 5' integration site. Ensure that the forward cPCR primer lies upstream of the forward dDNA primer sequence and the reverse cPCR primer fully within the eGFP tag or the linker sequence.</li>
		<li>Repeat steps 1.3-1.3.3. with the reverse dDNA oligonucleotide to create the second set of cPCR oligonucleotides that amplify across the 3' integration site. Ensure that the forward cPCR primer lies entirely within the eGFP tag or the linker sequence and the reverse cPCR primer downstream of the reverse dDNA primer sequence.</li>
		<li>Order these oligonucleotides.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Digest 2,500 ng of pADH140, which contains Cas9 (plasmid repository ID# 90988), with restriction enzyme for each gene to be GFP-tagged. Set the total volume of each digestion at

<ol><li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms%3A+development%2C+regulation%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li>
<li>Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+regulation+of+single-and+multi-species+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).</li>
<li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms and human disease.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).</li>
<li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li>
<li>Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+and+off%3A+epigenetic+regulation+of+C.+albicans+morphological+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches.</a> Pathogens. 10 (11), 1463(2021).</li>
<li>Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+chromatin+accessibility+in+regulating+the+Candida+albicans+white-opaque+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch.</a> Journal of Fungi. 7 (1), 37(2021).</li>
<li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+candida+species%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species.</a> eLife. 10, 64682(2021).</li>
<li>Lohse, M. B., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+Wor4%2C+a+new+transcriptional+regulator+of+white-opaque+switching%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).</li>
<li>Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+molecular+biology+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genetics and molecular biology in Candida albicans.</a> Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).</li>
<li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li>
<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733(2015).</li>
<li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIC+and+ChEC%3A+Genomic+mapping+of+chromatin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856(2017).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+in+situ+genome-wide+profiling+with+high+efficiency+for+low+cell+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).</li>
<li>Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient%2C+rapid%2C+and+recyclable+system+for+CRISPR-mediated+genome+editing+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+For+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans.</a> American Society For Microbiology. 2 (2), 00149(2017).</li>
<li>Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+markerless+CRISPR-mediated+system+for+genome+editing+in+Candida+auris+reveals+a+conserved+role+for+Cas5+in+the+caspofungin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response.</a> Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021(2021).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314(2019).</li>
<li>Skrzypek, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Candida+Genome+Database+%28CGD%29%3A+Incorporation+of+Assembly+22%2C+systematic+identifiers+and+visualization+of+high+throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ssvQC%3A+an+integrated+CUT%26RUN+quality+control+workflow+for+histone+modifications+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors.</a> BMC Research Notes. 14 (1), 366(2021).</li>
<li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigWig+and+BigBed%3A+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li>
<li>Homann, O. R., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MochiView%3A+Versatile+software+for+genome+browsing+and+DNA+motif+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis.</a> BMC Biology. 8, 49(2010).</li>
<li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+circuits+regulating+developmental+processes+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711(2020).</li>
<li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26amp%3BRUNTools%3A+a+flexible+pipeline+for+CUT%26amp%3BRUN+processing+and+footprint+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CUT&amp;RUNTools: a flexible pipeline for CUT&amp;RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biology. 20 (1), 192(2019).</li>
<li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li>
</ol>

Clarissa J. Nobile jest współzałożycielką BioSynesis, Inc., firmy zajmującej się diagnostyką i terapią zakażeń biofilmem.

Protokół ten przedstawia kompleksowy proces eksperymentalny i obliczeniowy do lokalizacji regulatorowych TF w całym genomie u C. albicans. Został zaprojektowany tak, aby był łatwo dostępny dla każdego, kto ma standardowe szkolenie z mikrobiologii i biologii molekularnej. Wykorzystując wysoki zakres dynamiki i niskie wymagania dotyczące wprowadzania próbek w teście CUT&RUN oraz uwzględniając optymalizacje lokalizacji interakcji wiążących TF-DNA w kulturach biofilmu i planktonu C. albicans, protokół ten s...

Candida albicans to klinicznie istotny, polimorficzny ludzki patogen grzybiczy, który występuje w wielu różnych trybach wzrostu, takich jak planktonowy (swobodnie pływający) sposób wzrostu i jako społeczności ściśle przylegających komórek chronionych przez macierz zewnątrzkomórkową, znaną jako tryb wzrostu biofilmu1,2,3. Podobnie jak w przypadku innych procesów rozwojowych i komórkowych, rozwój biofilmu jest ważną cechą wirulencji C. albicans, o której wiadomo, że jest kontrolowana na poziomie transkrypcyjnym przez regulatorowe czynniki transkrypcyjne (TF), które wiążą się z DNA w sposób specyficzny dla sekwencji4. Ostatnio regulatory chromatyny i modyfikatory histonów okazały się również ważnymi regulatorami tworzenia biofilmu C. albicans5 i morfogenezy6 poprzez pośredniczenie w dostępności DNA. Aby zrozumieć złożoną biologię tego ważnego patogenu grzybowego, cenne są skuteczne metody określania lokalizacji określonych TF w całym genomie podczas różnych procesów rozwojowych i komórkowych.
Immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje sekwencjonowanie (ChIP-seq) jest szeroko stosowaną metodą badania interakcji białko-DNA w C. albicans5,6 i w dużej mierze zastąpiła bardziej klasyczną immunoprecypitację chromatyny, po której następuje mikromacierz (chip ChIP)9 metoda. Zarówno metoda ChIP-seq, jak i ChIP-chip wymagają jednak dużej liczby komórek wejściowych10, co może być czynnikiem komplikującym podczas badania TF w kontekście określonych próbek i sposobów wzrostu, takich jak biofilmy pobrane od pacjentów lub zwierzęce modele infekcji. Ponadto test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) często daje znaczną ilość sygnału tła w całym genomie, co wymaga wysokiego poziomu wzbogacenia, aby cel zainteresowania mógł wystarczająco oddzielić sygnał od szumu. Chociaż test ChIP-chip jest obecnie w dużej mierze przestarzały, głębokość sekwencjonowania niezbędna do sekwencjonowania ChIP sprawia, że test ten jest zbyt drogi dla wielu badaczy, szczególnie tych, którzy badają wiele TF i / lub białek związanych z chromatyną.

Rozszczepienie pod celami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&RUN) jest atrakcyjną alternatywą dla ChIP-seq. Został opracowany przez laboratorium Henikoff w 2017 roku w celu obejścia ograniczeń związanych z endogennym rozszczepieniem ChIP-seq i chromatyny, a następnie sekwencjonowaniem ChEC-seq11,12, inna metoda identyfikacji interakcji białko-DNA na poziomie całego genomu, zapewniając jednocześnie mapowanie TF i białek związanych z chromatyną w całej rozdzielczości w całej rozdzielczości13. CUT&RUN opiera się na ukierunkowanym trawieniu chromatyny w permeabilizowanych jądrach za pomocą nukleaz mikrokokowych na uwięzi, a następnie sekwencjonowaniu strawionych fragmentów DNA9,10. Ponieważ fragmenty DNA są generowane specyficznie w loci, które są związane przez białko będące przedmiotem zainteresowania, a nie są generowane w całym genomie poprzez losową fragmentację, jak w testach ChIP, podejście CUT&RUN skutkuje znacznie zmniejszonymi sygnałami tła, a zatem wymaga 1/10 głębokości sekwencjonowania w porównaniu z klasą ChIP-seq<sup="xref">11, 13,14. Ulepszenia te ostatecznie prowadzą do znacznego obniżenia kosztów sekwencjonowania i zmniejszenia całkowitej liczby komórek wejściowych potrzebnych jako materiał wyjściowy dla każdej próbki.
Tutaj opisany jest solidny protokół CUT&RUN, który został dostosowany i zoptymalizowany do określenia lokalizacji TF w całym genomie w komórkach C. albicans wyizolowanych z biofilmów i kultur planktonowych. Przedstawiono również dokładny potok analizy danych, który umożliwia przetwarzanie i analizę wynikowych danych sekwencyjnych i wymaga od użytkowników minimalnej wiedzy specjalistycznej w zakresie kodowania lub bioinformatyki. Krótko mówiąc, protokół ten opisuje znakowanie epitopami genów kodujących TF, zbieranie biofilmu i komórek planktonowych, izolację nienaruszonych permeabilizowanych jąder, inkubację z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko specyficznemu białku lub białku znakowanemu epitopem, wiązanie białek fuzyjnych chimerycznej nukleazy A / G-mikrokokowej (pAG-MNazy) z przeciwciałami pierwotnymi, odzyskiwanie genomowego DNA po trawieniu chromatyny oraz przygotowanie bibliotek genomowego DNA do sekwencjonowania.
Eksperymentalny protokół CUT&RUN jest poprzedzony specjalnie zaprojektowanym potokiem analizy danych, który pobiera odczyty sekwencjonowania surowego DNA w formacie FASTQ i wdraża wszystkie wymagane kroki przetwarzania, aby dostarczyć pełną listę znacznie wzbogaconych loci związanych przez TF będący przedmiotem zainteresowania (ukierunkowany na pierwotne przeciwciało). Należy zauważyć, że wiele etapów opisanego protokołu przygotowania biblioteki zostało specjalnie dostosowanych i zoptymalizowanych pod kątem analizy CUT&RUN TF (w przeciwieństwie do nukleosomów). Podczas gdy dane przedstawione w tym manuskrypcie zostały wygenerowane przy użyciu specyficznych dla TF adaptacji komercyjnego zestawu CUT&RUN, protokoły te zostały również zweryfikowane przy użyciu indywidualnie pozyskiwanych komponentów (tj. enzymu pAG-MNazy i magnetycznych kulek oczyszczających DNA) oraz przygotowanych przez siebie, co może znacznie obniżyć koszty eksperymentów. Kompleksowe protokoły eksperymentalne i analizy danych są szczegółowo opisane poniżej w formacie krok po kroku. Wszystkie odczynniki i krytyczny sprzęt, a także receptury i pożywek są wymienione odpowiednio w Tabeli materiałów i Pliku Uzupełniającym 1.

<table><tbody><tr><td>0,22 &m; </td> m filtr <td>Millipore Sigma</td><td>SLGPM33RS</td><td></td></tr><tr><td>0,65 mL probówki o niskiej przyczepności</td><td>VWR</td><td>490003-190</td><td></td></tr><tr><td>1 M CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-152-341</td><td></td></tr><tr><td>1 M Fisher</td><td>Scientific</td><td>AAJ61224AK</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych bez obróbki</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>2% digitonina</td><td>Fisher Scientific</td><td>CHR103MI</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki stożkowe</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>5x bufor HF Phusion</td><td>Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Pozycja wchodząca w skład polimerazy DNA o wysokiej wierności Phusion; określana w tekście jako "bufor polimerazy DNA"</td></tr><tr><td>Kryterium agarowe</td><td></td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Określany w tekście jako "przyrząd do elektroforezy kapilarnej"; zależne od użytkownika</td></tr><tr><td>paski reakcyjne Amplitube PCR z dołączonymi nasadkami, Simport Scientific</td><td>VWR</td><td>89133-910</td><td></td></tr><tr><td>Bacto pepton</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do projektowania podkładu ławkowego</td><td>Benchling</td><td></td><td>https://www.benchling.com/molecular-biology/; Określany w tekście jako "narzędzie do projektowania podkładu"</td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ77507AB</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor biała plama</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Candida Baza danych</td><td></td><td></td> genomu <td>http://www.candidagenome.org/</td></tr> <tr><td>Sprzężone koraliki paramagnetyczne konkanawaliny A (ConA)</td><td>Polysciences</td><td>&nbsp; 86057-3</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> Conda <td>https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td></tr><tr><td>narzędzie</td><td></td><td></td> do zwijania <td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz</td></tr><tr><td>CUTANA ChIC/CUT& Zestaw RUN</td><td>Epicypher</td><td>14-1048</td><td>Określany w tekście jako "CUT& Zestaw RUN"</td></tr><tr><td>Mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP) (10 mM)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza (D-glukoza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-mannitol</td><td>&nbsp; BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety jednorazowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel DNA (6x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq zielona polimeraza DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>EP0713</td><td>Określany w tekście jako "polimeraza DNA cPCR" </td></tr><tr><td>Zielony bufor polimerazy DNA DreamTaq</td><td>Fisher Scientific</td><td>EP0713</td><td>Pozycja wchodząca w skład zielonej polimerazy DNA DreamTaq; określana w tekście jako "bufor polimerazy DNA cPCR"</td></tr><tr><td>E. coli spike-in DNA</td><td>Epicypher</td><td>18-1401</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator mikropłytek ELMI</td><td>ELMI</td><td>TRMS-04</td><td>Określany w tekście jako "inkubator mikropłytek"</td></tr><tr><td>Przygotowanie końcowe Enzyme Mix</td><td></td><td></td><td>Element część zestawu do przygotowania biblioteki DNA NEBNext Ultra II</td></tr><tr><td>End Prep Reaction Buffer</td><td></td><td></td><td>Element części zestawu NEBNext Ultra II DNA Library Prep Etanol</td></tr><tr><td>200 proof</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest MssI</td><td>Fisher Scientific</td><td>FD1344</td><td>Określany w tekście jako "enzym restrykcyjny"</td></tr><tr><td>FastDigest MssI Buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FD1344</td><td>Pozycja wchodząca w skład zestawu FastDigest MssI; określana w tekście jako "bufor enzymu restrykcyjnego"</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> fluorescencyjny <td>zależny od użytkownika</td></tr><tr><td>Aparat</td><td></td><td></td> do elektroforezy żelowej zależny <td>od użytkownika</td></tr><tr><td>GeneRuler niskiego zasięgu drabinka DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FERSM1192</tr><tr><td>przepływ pracy</td><td></td><td></td> GitBash <td>https://gitforwindows.org/</td></tr> <tr><td>Kod</td><td></td><td></td> źródłowy GitHub <td>https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis</td></tr><tr><td>HEPES-KOH pH 7,5</td><td>Boston BioProducts</td><td>BBH-75-K</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td> szybkoobrotowa zależna <td>od użytkownika</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PX1830-4</td><td></td></tr><tr><td>Papier do soczewek</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Enhancer</td><td></td><td></td><td>Element wchodzący w skład biblioteki DNA NEBNext Ultra II Zestaw przygotowawczy</td></tr><tr><td>Octan litu dwuwodny</td><td>MP Biomedicals</td><td>215525683</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors Pełnowymiarowe przeciwciało poliklonalne GFP</td><td>Takara</td><td>632592</td><td>Zależne od użytkownika</td></tr><tr><td>MACS2</td><td></td><td></td><td>https://pypi.org/project/MACS2/</td></tr> <tr><td>Stojak do separacji magnetycznej, probówki 0,2 ml</td><td>Epicypher</td><td>10-0008</td><td></td></tr><tr><td>Stojak do separacji magnetycznej, probówki 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>MR02</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka i kuweta spektrofotometr</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2TC</td><td>Określany w tekście jako "spektrofotometr"; zależny od użytkownika</td></tr><tr><td>MochiView</td><td></td><td></td><td>http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>470302-522</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>NCBI GEO</td><td></td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</td></tr> <tr><td>NEBNext Adaptor for Illumina</td><td></td><td></td><td>Item część NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); określany w tekście jako "Adapter"</td></tr><tr><td>NEBNext Index X Primer for Illumina</td><td></td><td></td><td>Item część NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); określany w tekście jako "Reverse Uniquely Indexed Library Elementarz amplifikacji"</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Preparation kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E7645S</td><td>Określany w tekście jako "zestaw do przygotowania biblioteki"</td></tr><tr><td>NEBNext Universal PCR Primer dla Illumina</td><td></td><td></td><td>Pozycja wchodząca w skład NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); określany w tekście jako "Universal Forward Library Amplification Primer"</td></tr><tr><td>Siarczan nourseotrycyny (NAT)</td><td>Goldbio</td><td>N-500-2</td><td></td></tr><tr><td>Novex TBE Żele, 10%, 15 dołków</td><td>Fisher Scientific EC62755BOX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik nutujący</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Bulion odżywczy</td><td>Kryterium</td><td>C6471</td><td></td></tr><tr><td>pADH110</td><td>Addgene</td><td>90982</td><td>Określany w tekście jako "identyfikator repozytorium plazmidu# 90982"</td></tr><tr><td>pADH119</td><td>Addgene</td><td>90985</td><td>określany w tekście jako "identyfikator repozytorium plazmidu# 90985"</td></tr><tr><td>pADH137</td><td>Addgene</td><td>90986</td><td>określany w tekście jako "identyfikator repozytorium plazmidu# 90986"</td></tr><tr><td>pADH139</td><td>Addgene</td><td>90987</td><td>określany w tekście jako "identyfikator repozytorium plazmidu# 90987"</td></tr><tr><td>pADH140</td><td>Addgene</td><td>90988</td><td>Określany w tekście jako "identyfikator repozytorium plazmidów# 90988"</td></tr><tr><td>pAG-MNase</td><td>Epicypher</td><td>15-1016 lub 15-1116</td><td>50 rxn lub 250 rxn</td></tr><tr><td>pCE1</td><td>Addgene</td><td>174434</td><td>Określany w tekście jako "identyfikator repozytorium plazmidów# 174434"</td></tr><tr><td>Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności Phusion</td><td>Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Określany w tekście jako "polimeraza DNA"</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy (PEG) 3350</td><td>VWR</td><td>10791-816</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1x zestaw do oznaczania DSDDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>Określany w tekście jako "fluorometr"; zależne od użytkownika</td></tr><tr><td>przeciwciało kontroli negatywnej IgG królika</td><td>Epicypher</td><td>13-0042</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>Roche Kompletny inhibitor proteazy (wolny od EDTA) tabletki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem</td><td>Eppendorf</td><td>M12820004</td><td>Zależne od użytkownika</td></tr> filtry rurkowe do wirówek <tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>07-200-385</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pętle inokulacyjne</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Złoty barwnik żelowy z kwasem nukleinowym</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie kwasem nukleinowym SYTO 13</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7575</td><td>Określane w tekście jako "barwienie żelem kwasu nukleinowego"</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td>zależny od użytkownika</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hydroksymetylo)aminometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ultra II Ligation Master Mix</td><td></td><td></td><td>Element wchodzący w skład zestawu NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit; określany w tekście jako "Ligation Master Mix"</td></tr><tr><td>Ultra II Q5 Master Mix</td><td></td><td></td><td>Element wchodzący w skład zestawu NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; określany w tekście jako "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix"</td></tr> <tr><td>UltraPure roztwór DNA plemników łososia</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>USER Enzyme</td><td></td><td></td><td>Element wchodzący w skład zestawu NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit; określany w tekście jako "Enzym wycinający uracyl"</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>VWR</td><td>10153-834</td><td></td></tr><tr><td>narzędzie wget</td><td></td><td></td><td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Kryterium</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>Zymoliaza 100T (litikaza, enzym lityczny drożdży)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0439194</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny-dna u candida albicans: kompleksowa metoda cut&run i przepływ pracy analizy danych

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Regulacyjne czynniki transkrypcyjne kontrolują wiele ważnych procesów biologicznych, w tym różnicowanie komórek, reakcje na perturbacje i stresy środowiskowe oraz interakcje gospodarz-patogen. Określenie powiązania regulatorowych czynników transkrypcyjnych z DNA w całym genomie ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia funkcji czynników transkrypcyjnych w tych często złożonych procesach biologicznych. Rozszczepienie pod celami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&RUN) to nowoczesna metoda mapowania całego genomu interakcji wiążących białko-DNA in vivo, która stanowi atrakcyjną alternatywę dla tradycyjnej i szeroko stosowanej metody immunoprecypitacji chromatyny, a następnie sekwencjonowania (ChIP-seq). CUT&RUN nadaje się do eksperymentalnej konfiguracji o wyższej przepustowości i ma znacznie wyższy zakres dynamiki przy niższych kosztach sekwencjonowania na próbkę niż sekwencja ChIP. W tym miejscu opisano kompleksowy protokół CUT&RUN i towarzyszący mu proces analizy danych dostosowany do analizy całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny i DNA w ludzkim patogenie grzybowym Candida albicans. Ten szczegółowy protokół obejmuje wszystkie niezbędne procedury eksperymentalne, od znakowania epitopami genów kodujących czynnik transkrypcyjny po przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania; dodatkowo zawiera dostosowany przepływ pracy obliczeniowej do analizy danych CUT&RUN.

Ten solidny protokół CUT&amp;RUN został zaadaptowany i zoptymalizowany do badania lokalizacji specyficznych czynników transkrypcyjnych (TF) w całym genomie w biofilmach i kulturach planktonicznych C. albicans (przegląd podejścia eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku 2). Dołączono również szczegółowy potok analizy danych, aby ułatwić analizę wynikowych danych z sekwencjonowania CUT&amp;RUN, który wymaga od użytkowników minimalnej wiedzy z zakresu kodowania lub bioinformatyki (pr...

Ten protokół opisuje eksperymentalną metodę i proces analizy danych dla rozszczepienia pod celami i uwolnienia za pomocą nukleazy (CUT&RUN) w ludzkim patogenie grzybowym Candida albicans.

Profilowanie całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny-DNA u Candida albicans: kompleksowa metoda CUT&RUN i przepływ pracy analizy danych

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...

Protokół ten szczegółowo opisuje wszystkie procedury eksperymentalne, od znakowania epitopów genów kodujących czynnik transkrypcyjny, poprzez obliczeniową analizę danych, po przeprowadzenie profilowania całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny i DNA u Candida albicans za pomocą CUT&RUN. Jest to bardziej dostępna, szybsza, bardziej czuła, tańsza technika i zapewnia wyższą jakość danych niż tradycyjne podejścia ChIP-chip i ChIP-seq. Chociaż nasz protokół został opracowany dla komórek Candida albicans wyizolowanych z biofilmów lub kultur planktonowych, praktyczne powinno być dostosowanie go do praktycznie każdej dobrej formy komórek Candida albicans.Po inkubacji zawiesiny komórkowej przenieść pięciomikrolitrową porcję do nowej probówki do PCR. Do pięciu mikrolitrów wyizolowanych jąder i pięciomikrolitrowej porcji nienaruszonych komórek, przechowywanych uprzednio w temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodać po jednym mikrolitrze kalkofluor-białego i SYTO 13. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza w ciemności przez 30 minut.Wizualnie sprawdzić integralność i czystość izolowanych jąder za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Poszukaj izolowanych jąder wykazujących wyraźne zabarwienie SYTO 13 i upewnij się, że nie ma barwienia ścian komórkowych przez biały barwnik kalkofluorowy. Powtórzyć inspekcję z nienaruszonymi komórkami jako kontrolę barwienia ścian komórkowych barwnikiem kalkofluorowo-białym.Umieść probówki na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż gnojowica będzie całkowicie czysta. Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Dodać 50 mikrolitrów buforu przeciwciał i delikatnie wymieszać pipetując.Dodać trzy mikrolitry przeciwciała poliklonalnego anty-GFP do probówek i inkubować probówki na mieszalniku nutującym w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Krótko odwirować probówki w temperaturze pokojowej 100 razy g przez pięć sekund i umieścić probówki na stojaku magnetycznym. Gdy zawiesina jest klarowna, wyrzucić supernatant za pomocą pipety.Podczas gdy probówki z kulkami nadal znajdują się na stojaku magnetycznym, dodaj 200 mikrolitrów lodowatego buforu przepuszczalności komórek bezpośrednio na kulki. Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Powtórz dwa płukania z lodowatym buforem do przenikania komórek.Do każdej probówki dodać 50 mikrolitrów lodowatego buforu do przepuszczalności komórek i delikatnie wymieszać pipetując. Dodać 2,5 mikrolitra białka AG-MNazy do każdej próbki i wymieszać pipetując. Umieścić próbki w mieszalniku nutacyjnym w temperaturze 4 stopni Celsjusza i inkubować próbki przez godzinę.Krótko odwirować probówki paskowe w temperaturze 100 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć sekund, a następnie umieścić probówki na stojaku magnetycznym. Gdy zawiesina jest klarowna, wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Podczas gdy probówki z kulkami nadal znajdują się na stojaku magnetycznym, dodaj 200 mikrolitrów lodowatego buforu przepuszczalności komórek bezpośrednio na kulki.Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Powtórz dwa płukania z lodowatym buforem do przenikania komórek. Dodać 100 mikrolitrów lodowatego buforu do przepuszczalności komórek do próbek i delikatnie pipetować w górę iw dół pięć razy.Wyjmij odlew żelowy z pudełka na żel i otwórz odlew żelowy zgodnie z instrukcjami producenta. Delikatnie wyjmij żel z odlewu żelowego i umieść go w tacce na żel zawierającej 100 mililitrów KZM o pojedynczej mocy. Dodaj 10 mikrolitrów barwnika z żelu kwasu nukleinowego do tacki i delikatnie zamieszaj.Przykryj folią w celu ochrony przed światłem i inkubuj statycznie w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie spłucz żel dwukrotnie 100 mililitrami dejonizowanej wody z kranu. Zobrazuj żel w świetle niebieskim za pomocą bursztynowej osłony filtra.Dla każdej biblioteki przetnij żel nieco powyżej około 125 par zasad wydatnego pasma dimerów adaptera i poniżej znaku drabinki 400 par zasad. Nakłuj spód rurki o pojemności 0,65 mililitra za pomocą igły o rozmiarze 22 i umieść przebitą rurkę w sterylnej dwumililitrowej probówce do mikrofugi. Przenieś plasterek żelu do nakłutej probówki wewnątrz dwumililitrowej probówki do mikrofuge.Odwirować dwumililitrową probówkę do mikrofugi zawierającą 0,65-mililitrową nakłutą probówkę i próbkę o masie 10 000 razy g w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, aby zebrać zawiesinę żelu wewnątrz dwumililitrowej probówki do mikrofugi. Dodaj 300 mikrolitrów lodowatego żelowego buforu elucyjnego do zawiesiny żelu. Mieszaj na nutatorze w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy godziny lub przez noc.Przenieś całą zawiesinę cieczy i żelu do kolumny filtracyjnej o średnicy 0,22 mikrometra i odwiruj pod ciśnieniem 10 000 g w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Pobierz kod źródłowy do analizy CUT&RUN ze strony GitHub, klikając zielony przycisk Kod, a następnie opcję Pobierz ZIP. Rozpakuj folder do odpowiedniej lokalizacji na komputerze lokalnym.Zainstaluj środowisko Conda i uruchom je tylko raz. Po zainstalowaniu Conda utwórz środowisko wirtualne dostarczone z odpowiednim poleceniem. Aktywuj środowisko wirtualne za każdym razem, gdy ten przepływ pracy jest wykonywany.Trawienie ściany komórkowej i integralność jądrową oceniano, wizualizując zarówno kontrolne nienaruszone komórki, jak i izolowane jądra wybarwione fluorescencyjnymi barwnikami ściany komórkowej i kwasów nukleinowych. W przeciwieństwie do izolowanych nienaruszonych jąder, w których nie obserwuje się barwienia ścian komórkowych, zarówno jądra, jak i ściany komórkowe są znakowane fluorescencyjnie w nienaruszonych komórkach kontrolnych. Rysunek przedstawia biblioteki TF CUT&RUN analizowane za pomocą przyrządu do elektroforezy kapilarnej.Udane biblioteki TF CUT&RUN są wzbogacane o krótkie fragmenty mniejsze niż 200 par zasad. Nieoptymalne biblioteki TF CUT&RUN wykazują wzbogacenie dla dużych fragmentów DNA. Rysunek ten pokazuje, że motywy wiążące DNA Ndt80 są wzbogacone we wszystkich loci związanych z Ndt80 zidentyfikowanych przez CUT&RUN, co wskazuje, że dodatkowe piki zidentyfikowane za pomocą tej metodologii są prawdopodobnie prawdziwymi miejscami związanymi z Ndt80.Analiza porównawcza wykazała, że protokół CUT&RUN zidentyfikował większość znanych wcześniej zdarzeń wiązania Ndt80 i Efg1 podczas tworzenia biofilmu. Ogólnie rzecz biorąc, zarówno Ndt80, jak i Efg1 związane z loci pokrywają się z wcześniej opublikowanymi danymi ChIP dotyczącymi wytrącania immunologicznego chromatyny i są identyfikowane tylko za pomocą CUT&RUN. Pozwala nam to na znaczne zwiększenie zakresu i tempa naszych badań skoncentrowanych na transkrypcyjnych sieciach regulacyjnych i Candida albicans.

genome-wide-profiling-transcription-factor-dna-binding-interactions

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy protokół, który jest szybki, czuły i powtarzalny do profilowania ekspresji genów patogenów podczas infekcji.

Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Galaxy i DAVID stały się popularnymi narzędziami, które pozwalają badaczom bez wykształcenia bioinformatycznego analizować i interpretować dane RNA-Seq. Opisujemy protokół dla badaczy C. elegans do przeprowadzania eksperymentów RNA-Seq, uzyskiwania dostępu i przetwarzania zestawu danych za pomocą Galaxy oraz uzyskiwania znaczących informacji biologicznych z list genów za pomocą DAVID.

Analiza transkryptomiczna C. elegans powiedział: Dane sekwencjonowania RNA za pośrednictwem pakietu Tuxedo Suite w projekcie Galaxy

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę określania powinowactwa wiązania w równowadze i w roztworze z wysoką czułością na dużą skalę. Poprawia to analizę ilościową wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA. Metoda opiera się na zautomatyzowanych pomiarach anizotropii fluorescencji w kontrolowanym systemie dostarczania.

Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół badań przesiewowych drożdży z jedną hybrydą, aby zidentyfikować czynniki transkrypcyjne (TF), które mogą wiązać się z interesującym nas regionem ludzkiego DNA. Ta metoda wykorzystuje potok przesiewowy o wysokiej przepływności, który może badać wiązanie &gt;1 000 TF w jednym eksperymencie.

Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA

Protokół przedstawiony tutaj opisuje kompletny potok do analizy danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, od surowych odczytów do analizy funkcjonalnej, w tym etapy kontroli jakości i wstępnego przetwarzania do zaawansowanych metod analizy statystycznej.

Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

CUT&amp;RUN i jego warianty mogą być używane do określania obecności białek na chromatynie. Protokół ten opisuje, w jaki sposób określić lokalizację białka na chromatynie za pomocą jednokomórkowego uliCUT&amp;RUN.

Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

Opisano zoptymalizowany protokół rozszczepienia pod celami i uwalnianie z użyciem nukleazy, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (CUT&amp;RUN-seq) dla neuroendokrynnych linii komórkowych raka płuc z drobnymi komórkami. Umożliwia mapowanie różnych modyfikacji histonów oraz miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych (np. E2F7) na poziomie genomu w celu badania deregulacji epigenetycznej i transkrypcyjnej w patobiologii SCLC.

Mapowanie modyfikacji histonów i miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w neuroendokrynnych liniach komórkowych raka płuc z wykorzystaniem CUT&RUN

Przedstawiamy tutaj szybki i prosty protokół ATAC-seq do zaimplementowania w całym robaku Caenorhabditis elegans na etapie L4, używając tylko 30 µL pelletu z dżdżownic.

Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4

Poznaj metodę CUT&RUN do profilowania interakcji czynnik transkrypcyjny-DNA u Candida albicans. Technika ta jest szybsza, bardziej czuła i tańsza niż tradycyjne metody ChIP-seq.

Profilowanie całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny-DNA u Candida albicans: kompleksowa metoda CUT and RUN i przepływ pracy analizy danych (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny-DNA u Candida albicans: kompleksowa metoda CUT&RUN i przepływ pracy analizy danych

Przeglądaj więcej filmów