Name: Wykrywanie szczepu Wolbachia wAlbB w liniach komórkowych Aedes albopictus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj cztery metody wykrywania wewnątrzkomórkowej bakterii Wolbachia w liniach komórkowych Aedes albopictus. Protokół poprawia dokładność detekcji infekcji i wspiera badania nad interakcjami bakterii z komórkami gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Xin-Ru Wang z University of Minnesota za wnikliwe sugestie i wskazówki. Praca ta została wsparta grantem z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81760374).

1. Materiały i odczynniki
<ol>
	<li>Do hodowli komórkowych należy używać roztworów i mediów wolnych od pirogenów (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Do przygotowania wszystkich roztworów należy używać wody ultrapurej.</li>
	<li>Należy zachować ostrożność przy wyborze płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do hodowli komórkowej, stosując proces kontroli partii. 
	UWAGA: Ze względu na regularne zmiany partii FBS, w niniejszym protokole nie można podać odpowiednich numerów katalogowych i numerów partii.</li>
	<li>Należy wybrać linie komórkowe Aa23 pochodzące z jaj A. albopictus, odpowiadające linii Aa23-T wolnej od Wolbachia.</li>
</ol>
2. Hodowla komórek
<ol>
	<li>Przygotować kolby do hodowli komórek o powierzchni 25 cm2 zawierające 4 mL pożywki Schneidera z 10% FBS.</li>
	<li>Inkubować kolby w temperaturze 28 °C w atmosferze 5% CO2 przez okres od 5 do 7 dni7,24.</li>
	<li>Obserwować niebarwione komórki Aa23 i Aa23-T w kolbach za pomocą mikroskopii świetlnej przy powiększeniu 100x (Rycina 1).</li>
</ol>
3. Ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Kulturować komórki przez 5-7 dni, aż osiągną 70-80% konfluencji na kolbę (krok 2). Zebrać komórki za pomocą manualnego pipetowania z 1 mL resuspensowanego medium hodowlanego poprzez wirowanie przez 5 min przy 100 × g w mikrocentry fudze.</li>
	<li>Usunąć supernatant poprzez aspirację i przechowywać otrzymany pellet komórkowy w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Resuspender pellety w 0,40 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), przenieść 50 µL roztworu do probówki do mikrocentryfugi, dodać 5 µL proteinazy K (20 mg/mL) i inkubować w temperaturze 55 °C przez 1 h. Następnie podgrzać te probówki w temperaturze 99 °C przez 15 min w celu uzyskania surowego DNA, a następnie przechowywać je w -20 °C.</li>
</ol>
4. Wykrywanie kwasów nukleinowych Wolbachia
<ol>
	<li>Analiza PCR
	<ol>
		<li>Przeprowadzić reakcję PCR w całkowitej objętości reakcji wynoszącej 20 µLzawierający 8 µL z ddH2O2O, 10 µL polimerazy Taq (patrz w spodzie/sekcji/rozdziale) Tabela materiałów), 1 µL matrycy DNA (z kroku 3), 0.5 µL starterów bezpośrednich i odwrotnych (10 µM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') i wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25odpowiednio.</li>
		<li>Należy zastosować następujące warunki PCR: wstępna denaturacja w 95 °C przez 5 min, a następnie 35 cykli denaturacji w 94 °C, wyżarzanie w temperaturze 55 °Coraz przedłużenie w 72 °C; następnie końcowa elongacja w 72 °C przez 7 min.</li>
		<li>Wykryj DNA na 1% żelu agarozowym (1% w/v agarozy w PBS) przy użyciu systemu obrazowania żeli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza qPCR
	<ol>
		<li>Przeanalizuj Wolbachia liczbę kopii genomu dla trzech powtórzeń biologicznych (n = 6) z wyekstrahowanego DNA (krok 3) przy użyciu wsp startery 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') i QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, znormalizowane za pomocą starterów prawego i lewego dla białka rybosomalnego S6 (RPS6) (odpowiednio 5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' i 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3')3.</li>
		<li>Wyznacz krzywą standardową dla wAlbB i RPS6.
		<ol>
			<li>Wyizoluj DNA z rekombinowanego plazmidu zawierającego PMD-18T (specjalny wektor do wydajnego klonowania produktów PCR (klonowanie TA)) wsp i rps6 fragmenty genów (Plik uzupełniający) i zmierz stężenie plazmidowego DNA (patrz w Tabela materiałów).</li>
			<li>Przelicz stężenie plazmidowego DNA na stężenie liczby kopii, korzystając z równania (1). 
			Liczba kopii plazmidu = <img alt="równanie do kwantyfikacji DNA; wzór na przeliczenie stężenia plazmidu na liczbę cząsteczek; zastosowanie edukacyjne" src="/files/ftp_upload/63662/63662eq01v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> (1)</li>
			<li>Rozcieńczyć liczbę kopii plazmidu z 101 do 108 wodą ultrapurystyczną, a następnie przygotować 3 powtórzenia dla każdego stopnia gradientu stężeń.</li>
			<li>Przeprowadź amplifikację qPCR z użyciem TB Green i systemu PCR w czasie rzeczywistym (patrz w Tabela materiałów), a następnie zapisz wyniki każdej reakcji. Wykorzystaj wartość Ct do opracowania krzywej standardowej. Przeanalizuj DNA w całkowitej objętości reakcji wynoszącej 20 µL, obejmujący 7 µL z ddH2O2O, 10.4 µL TB Green (patrz w sekcji Tabela materiałów), 1 µL matrycy DNA (otrzymanej w kroku 3) oraz 0.8 µL starterów bezpośrednich i odwrotnych (10 µM). Należy zastosować następujące warunki reakcji: wstępna denaturacja w 95 °C przez 5 min, a następnie 40 cykli denaturacji w 95 °C przez 10 s, a następnie przyłączanie w temperaturze 60 °C przez 35 s.</li>
			<li>Oblicz WSP i RPS6 liczba kopii genów w komórkach zgodnie z wyznaczoną krzywą standardową oraz Wolbachia względna gęstość wyznaczona przez liczbę kopii wsp/RPS6Przeanalizuj dane, stosując test dla próbek niezależnych Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.-test.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza Western blot w celu wykazania Wolbachia białko
	<ol>
		<li>Ekstrakcja białek
		<ol>
			<li>Zebrać 2 × 107 Przenieść komórki Aa23 i Aa23-T z płytki sześciodołkowej (z kroku 2) do probówki do mikrowirówki, przemyć je trzykrotnie solą fizjologiczną (PBS) i odwirować przy 100 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Przygotować 1 ml lizatów z użyciem buforu do lizy RIPA (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1%tdeoksycholan sodu, 0,1% dodecylosiarczanu sodu [SDS], 2 mM pirofosforanu sodu, 25 mM β-glicerofosforanu, 1 mM EDTA, 1 mM Na)3Lektor4, 0.5 µg/mL leupeptyna) oraz PMSF (stężenie końcowe 1 mM).</li>
			<li>Dodaj 200 µL buforu do lizy do osadu komórkowego i inkubuj przez 30 min na lodzie. Odwiruj lizaty przy 12 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C i usunąć nadpływ.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oznacz stężenie białka wsp w supernatancie, wykorzystując zestaw do oznaczania białek metodą kwasu bicinchoninowego (BCA) (patrz w Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Nanieś równą ilość białka na żel 15% SDS-PAGE [10% wody destylowanej; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% wodoroczylanu amonu), 0,04% TEMED].</li>
		<li>Przenieś białko na membrany nitrocelulozowe, a następnie zablokuj membrany 5% roztworem mleka odtłuszczonego przez 2 h26,27 w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie przemyć membrany buforem TBST (1 ml Tween 20 w 1 l TBS) (patrz na Tabela materiałów).</li>
		<li>Inkubować membrany przez noc w temperaturze 4 °C z 100 µL przeciwciała poliklonalnego przeciwko wsp (przygotowanego wewnętrznie, patrz Plik uzupełniający)), przygotowane poprzez rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego w 5% mleku odtłuszczonym (1:12 000).</li>
		<li>Przemyć przeciwciało pierwszorzędowe trzykrotnie buforem TBST.</li>
		<li>Inkubować membrany w 100 µL przeciwciała wtórnego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP) na wytrząsarce przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć membrany trzykrotnie buforem TBST, a następnie wymieszać 20 µL roztworu A (odczynnik luminolowy dla HRP) i 20 µL roztworu B (odczynnik nadtlenkowy do substratu HRP) z zestawu do detekcji chemiluminescencyjnej w stosunku 1:1. Zanurz całą membranę w roztworze luminescencyjnym jednocześnie i obserwuj sygnały przy użyciu wielofunkcyjnego systemu obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lokalizacja immunofluorescencyjna Wolbachia białko
	<ol>
		<li>Inkubować 5 × 105 komórki Aa23 i Aa23-T w 28 °C w szalce Petri do mikroskopii konfokalnej z dnem o grubości 0,17 mm, w atmosferze 5% CO22 atmosfera przez 3 do 4 dni7,24Należy odczekać, aż komórki osiągną 60%-70% konfluencji, a następnie przemyć je trzykrotnie PBS.</li>
		<li>Utwierdź komórki przez 20 min w 4 °C w 1 ml 4% (m/v) paraformaldehydu w PBS.</li>
		<li>Przemyj utrwalone komórki za pomocą PBST (0,2% v/v Triton X-100 w PBS) przez 5 min, a następnie przemyj komórki ponownie dwukrotnie w PBS.</li>
		<li>Inkubować preparaty przez 1 h w temperaturze 37 °C w 1 ml 3% (m/v) albuminy surowicy bydlęcej w PBS.</li>
		<li>Inkubować preparaty na szkiełkach przez noc w 100 µL przeciwciał króliczych przeciwko wsp (przygotowanych wewnętrznie) oraz surowicy mysiej (rozcieńczenie 1:1000 w PBS) w komorze wilgotnościowej (która pozwala zachować wilgotność i zapobiega odparowaniu cieczy) w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyjmij preparaty z pojemnika z roztworem i pozostaw je do osiągnięcia temperatury pokojowej; przemyj je trzykrotnie buforem PBS, a następnie usuń bufor. 
		UWAGA: Od kroku 4.4.7 wszystkie operacje muszą być chronione przed światłem.</li>
		<li>Inkubować preparaty z 100 µL przeciwciała koziego anty-mysiego sprzężonego z Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:2000 w PBS) w 37 °C przez 30 min.</li>
		<li>Inkubować preparaty na szkiełkach z 50 µL 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI rozcieńczonego w PBS do 10 µg/mL, silnie wiąże się z DNA) w 37 °C przez 5 min, a następnie przemyć je trzykrotnie roztworem PBS.</li>
		<li>Obserwować immunobarwienie pod mikroskopem konfokalnym.
		<ol>
			<li>Włącz zasilanie oraz laser.</li>
			<li>Włącz lampę standardową oraz lampę rtęciową mikroskopu.</li>
			<li>Uruchom system i włącz oprogramowanie operacyjne. Nanieś kroplę olejku cedrowego na preparaty, umieść preparaty na stoliku mikroskopu i przesuń stolik do odpowiedniej pozycji.</li>
			<li>Kliknij obserwacja lampy rtęciowej przycisk w oprogramowaniu, otwórz migawkę lampy rtęciowej i obserwuj próbkę pod mikroskopem odwróconym, aby ustawić ostrość.</li>
			<li>Użyj sterowanie ręczne panel do wyboru fluorescencji zielonej i niebieskiej w celu wykonania zdjęć fluorescencyjnych przy 100-krotnym powiększeniu.</li>
			<li>Wyłącz obserwacja lampy rtęciowej przycisk i rozpocząć akwizycję obrazów.</li>
			<li>Aby zapewnić dobrą jakość obrazu, wykonaj przeskanowanie wstępne w rozmiarze skanowania 512 pikseli x 512 pikseli. Dostosuj rozmiar skanowania, aby uzyskać wyraźne obrazy (1024 piksele x 1024 piksele).</li>
			<li>Przeprowadzić redukcję szumów, jeśli poziom szumu tła jest zbyt wysoki.</li>
			<li>Zatrzymaj skanowanie i zapisz obrazy.</li>
			<li>Wyłączyć lampę rtęciową oraz lasery.</li>
			<li>Przetrzyj obiektyw 75% alkoholem i opuść go do najniższej pozycji.</li>
			<li>Wyłączyć migawkę oraz zasilanie mikroskopu.</li>
			<li>Po ostygnięciu urządzenia należy przykryć je pokrowcem przeciwkurzowym.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Patholology%22%5BJournal%5D)">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li>
<li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+Biologial+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li>
<li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li>
<li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li>
<li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evoution%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li>
<li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li>
<li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+Developmental+Biology+-+Animals%22%5BJournal%5D)">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li>
<li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+species+are+infected+with+Wolbachia%3F-A+statistical+analysis+of+current+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li>
<li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia%3A+master+manipulators+of+invertebrate+biology%5BTitle%5D)+AND+%22National+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li>
<li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li>
<li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Neill%2C+SL+%22Influential+passengers%3A+inherited+microorganisms+and+arthropod+reproduction%22">Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction</a>. , Oxford University Press. (1997).</li>
<li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+insecticides%3A+new+thinking+on+an+ancient+problem%5BTitle%5D)+AND+%22National+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li>
<li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li>
<li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li>
<li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li>
<li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li>
<li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043(2011).</li>
<li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833(2010).</li>
<li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue%2C+Chikungunya%2C+and+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li>
<li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459(2013).</li>
<li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase%2C+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li>
<li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li>
<li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754(2012).</li>
<li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483(2019).</li>
<li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22The+Royal+Society+Publishing.+Proceedings+B%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li>
<li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach%2C+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li>
<li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+Science+B%22%5BJournal%5D)">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li>
<li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li>
<li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immunofluorescence%2C+Western+blotting%2C+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Wykrycie wewnątrzkomórkowego zakażenia Wolbachia ma zasadnicze znaczenie dla badania interakcji Wolbachia-gospodarz i potwierdzenia udanej transfekcji komórek z nowymi szczepami. W tym protokole zastosowano cztery metody, aby skutecznie wykryć wewnątrzkomórkowe zakażenie Wolbachia na poziomie kwasów nukleinowych i białek. Te cztery metody eksperymentalne potwierdziły i poprawiły dokładność wykrywania zakażenia komórek Wolbachia . 
PCR zastosowano do wykrycia...

Azjatycki komar tygrysi Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), który jest kluczowym wektorem wirusa dengi (DENV) w Azji i innych częściach świata1, jest naturalnym gospodarzem dwóch typów bakterii wewnątrzkomórkowych, Wolbachia (wAlbA i wAlbB), które są rozmieszczone w całej linii zarodkowej i tkance somatycznej2,3. Linia komórkowa Aa23 pochodząca z zarodków A. albopictus składa się z co najmniej dwóch typów komórek morfologicznych, z których oba wspierają infekcję4 i mogą być wyleczone z natywnego zakażenia Wolbachia za pomocą antybiotyków (Aa23-T). Biorąc pod uwagę, że Aa23 zachowuje tylko wAlbB, jest to użyteczny model do badania interakcji host-endosymbiont4,5,6.
Wolbachia jest przenoszona przez matkę i zaraża około 65% gatunków owadów8,9 i 28% gatunków komarów10. Infekuje różne tkanki i tworzy ścisłą symbiozę z gospodarzem, zwykle wywołując niezgodność cytoplazmatyczną (CI)11 i wymianę populacji poprzez manipulowanie układem rozrodczym gospodarza12,13. Te reakcje gospodarza zaobserwowano w naturalnych populacjach Drosophila simulans14 oraz u A. aegypti w klatce laboratoryjnej i próbie terenowej15. Ważną manipulacją niereprodukcyjną wywołaną przez Wolbachia jest indukowana oporność gospodarza na różne patogeny, w tym DENV, wirus Chikungunya (CHIKV) i wirus Zachodniego Nilu (WNV)16,17, w której może pośredniczyć ulepszony wrodzony układ odpornościowy symbiontu18,19, konkurencja między Wolbachia a wirusami o niezbędne zasoby gospodarza20oraz manipulowanie szlakami obrony wirusowej gospodarza21.
Ten protokół został opracowany do badania tych podstawowych mechanizmów wywołanych przez Wolbachię odpowiedzi przeciwwirusowych gospodarza. Wykorzystuje cztery metody wykrywania wewnątrzkomórkowego zakażenia Wolbachia komórkami Aa23. Metody te stanowią solidną podstawę teoretyczną do badań wewnątrzkomórkowego zakażenia Wolbachia innych gatunków gospodarzy. Pierwsza metoda, PCR – potężna technika pozwalająca na enzymatyczną amplifikację określonych regionów DNA bez wykorzystywania konwencjonalnych procedur klonowania – została wykorzystana do wykrycia DNA Wolbachia i określenia obecności/braku infekcji Wolbachia22. Druga metoda mierzy gęstość kopii DNA Wolbachia za pomocą ilościowego PCR (qPCR) w celu wiarygodnego wykrywania i pomiaru produktów wytwarzanych podczas każdego cyklu PCR, który jest wprost proporcjonalny do ilości matrycy przed PCR23. Trzecia metoda wykrywa obecność wewnątrzkomórkowych białek Wolbachia, przy użyciu western blot - jednego z najpotężniejszych narzędzi do wykrywania określonych białek w złożonych mieszaninach poprzez połączenie wysokiej zdolności separacji elektroforezy, specyficzności przeciwciał i czułości chromogennych reakcji enzymatycznych. Ostatnią metodą jest test immunofluorescencyjny (IFA), który łączy immunologię, biochemię i mikroskopię w celu wykrycia białka powierzchniowego Wolbachia (wsp) poprzez reakcję antygen-przeciwciało w celu potwierdzenia wychwytu komórkowego Wolbachia i określenia jego lokalizacji komórkowej.
Ten artykuł opisuje cztery metody wymienione powyżej do weryfikacji obecności Wolbachii w komórkach, które mogą być użyte do wykrycia, czy egzogenna Wolbachia została pomyślnie przetransfekowana i czy Wolbachia w komórce została usunięta. Po ustaleniu, czy Wolbachia jest obecna w komórkach, czy nie, można przeprowadzić wiele różnych analiz, w tym genomikę, proteomikę lub metabolomikę. Protokół ten demonstruje wykrywanie Wolbachii przez komórki Aa23, ale może być również stosowany w innych komórkach.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop</td><td>Szalka Petriego Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scietific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td> Platforma <td>P10</td></tr><tr><td>inSituX</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis Opracowane</td><td>przez nas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>granat aluminiowy itrowo-domieszkowany cerem</td><td>MSE dostarcza</td><td></td><td>Ce: Y3Al5O12, podłoża monokrystaliczne YAG</td></tr><tr><td>Uchwyt na chipy</td><td>Opracowane</td><td></td><td></td>przez siebie</tr><tr><td>oprogramowanie sterujące</td><td>Opracowany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przez siebie olejek immersyjny</td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Typ A o niskiej lepkości 150 cSt</td></tr><tr><td>platforma inSituX</td><td>Opracowane</td><td></td><td></td>przez siebie</tr><tr><td>źródło światła IR&nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED ze szklaną soczewką, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td></tr><tr><td>Pierścień zewnętrzny&nbsp;</td><td>Opracowane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przez nas lasery pompowe&nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, & 9 mm, E Pin Code, Dioda laserowa</td></tr><tr><td>Raspberry</td><td>Pi Pierścień ustalający Raspberry Pi Fundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>Pierścień ustalający SM1 do &Oslash; Tubusy i mocowania soczewek 1"</td></tr><tr><td>Bezpestkowy kryształ kwarcu</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>Średnica 25,4 mm Z-cut 0,05 mm grubość dwustronny połysk 8 mm na -X</td></tr><tr><td>Podkładka</td><td>Opracowany</td><td></td><td></td>przez nas</tr><tr><td>Ogranicznik wiązki promieniowania rentgenowskiego</td><td>opracowany przez nas</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie szczepu wolbachia walbb w liniach komórkowych aedes albopictus

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Jako endosymbiont zaszczepiony przez matkę, Wolbachia infekuje dużą część populacji owadów. Badania wykazały ostatnio skuteczną regulację transmisji wirusa RNA za pomocą komarów transfekowanych wirusem Wolbachia. Kluczowe strategie kontrolowania wirusów obejmują manipulowanie rozmnażaniem gospodarza poprzez niezgodność cytoplazmatyczną oraz hamowanie transkryptów wirusowych poprzez pobudzanie immunologiczne i rywalizację o zasoby pochodzące od gospodarza. Jednak mechanizmy leżące u podstaw reakcji komarów transfekowanych Wolbachią na infekcję wirusową są słabo poznane. W artykule przedstawiono protokół identyfikacji in vitro zakażenia Wolbachia na poziomie kwasów nukleinowych i białek w komórkach Aa23 Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) w celu lepszego zrozumienia interakcji między Wolbachia a jej wektorami owadzimi. Dzięki połączonemu zastosowaniu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), ilościowego PCR, western blot i immunologicznych metod analitycznych, opisano standardowy protokół morfologiczny wykrywania komórek zakażonych Wolbachią, który jest dokładniejszy niż zastosowanie pojedynczej metody. Podejście to można również zastosować do wykrywania zakażenia Wolbachia u innych taksonów owadów.

Przed Wolbachia wykryto, komórki Aa23 i Aa23-T obserwowano pod mikroskopem świetlnym w celu ustalenia różnic morfologicznych między obiema liniami komórkowymi. Komórki Aa23 i Aa23-T wykazują co najmniej dwie morfologie komórkowe, jednak nie stwierdzono wyraźnych różnic morfologicznych między tymi dwoma typami komórek (Rycina 1)W tym przypadku w celu wykrycia wykorzystano komórki Aa23 jako system modelowy. Wolbachia zakażenie przy użyciu czterech metod. Pozy...

Do wykrywania wewnątrzkomórkowej Wolbachii użyto czterech metod, które wzajemnie się uzupełniały i poprawiały dokładność wykrywania infekcji Wolbachia Aa23 pochodzącej z Aedes albopictus i Aa23-T wyleczonej z rodzimej infekcji Wolbachia za pomocą antybiotyków.

Wykrywanie szczepu Wolbachia wAlbB w liniach komórkowych Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Protokół ten pomaga zweryfikować obecność Wolbachii w komórkach, co jest podstawą zrozumienia interakcji między Wolbachią a jej gospodarzem. W tym protokole zastosowano cztery metody skutecznego wykrywania wewnątrzkomórkowego zakażenia Wolbachia, które potwierdziły i poprawiły dokładność wykrywania infekcji komórek Wolbachia. Procedurę zademonstruje Qiuqiu Xiao, absolwent studiów podyplomowych z Laboratorium Kluczowej Biologii i Charakterystyki Współczesnych Patogenów.Zacznij od obserwacji niebarwionych komórek Aa23 i Aa23-T w 100-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii świetlnej. Hoduj komórki przez pięć do siedmiu dni, aby osiągnąć 70 do 80% konfluencji na kolbę. Za pomocą pipety przenieść 1 ml pożywki hodowlanej do probówki mikrowirówkowej.Wirować w temperaturze 100 RCF przez pięć minut, aby zebrać komórki. Usunąć supernatant i przechowywać powstałe osady komórkowe w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Hoduj komórki przez pięć do siedmiu dni, aby osiągnąć 90 do 100% konfluencji na kolbę.Ponownie zawiesić granulki w 0,40 ml PBS i przenieść 50 mikrolitrów tego roztworu do probówki mikrowirówkowej. Dodaj pięć mikrolitrów 20 mg/ml proteinazy K i inkubuj w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie inkubuj probówki w temperaturze 99 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby uzyskać surowe DNA i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Aby przeprowadzić PCR, należy przygotować całkowitą mieszaninę reakcyjną o objętości 20 mikrolitrów i ustawić warunki PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Wykryj DNA na 1% żelu agarozowym za pomocą obrazowania żelowego. Wykonaj ilościową amplifikację PCR za pomocą TB Green w systemie PCR w czasie rzeczywistym i zapisz wyniki każdej reakcji.Przeanalizuj DNA w całkowitej objętości reakcji 20 mikrolitrów i ustaw ilościowe warunki PCR zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Oblicz liczbę kopii genów WSP i RPS6 w komórkach zgodnie z ustaloną krzywą standardową. Następnie oblicz gęstość względną Wolbachii przez liczbę kopii wsp/RPS6.Analizuj dane przy użyciu testu t dla niezależnych prób. Dodaj 200 mikrolitrów buforu do lizy do osadu komórkowego i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Odwirować lizaty w temperaturze 12 000 RCF przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odessać supernatant.Przeanalizować stężenie wsp w supernatantze za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Załaduj równe ilości białka na żel 15% SDS-PAGE. Przenieś białko do membran nitrocelulozowych i zablokuj błony 5% odtłuszczonym mlekiem przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Następnie umyj membrany trzykrotnie TBST. Inkubować błony przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza ze 100 mikrolitrami przeciwciała poliklonalnego anty-wsp przygotowanego przez rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego 5% odtłuszczonym mlekiem. Przemyć przeciwciało pierwszorzędowe trzykrotnie TBST.Dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wtórnego sprzężonego z peroksydazą chrzanową do membran i inkubuj je na wytrząsarce przez godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć membrany trzykrotnie TBST i wymieszać 20 mikrolitrów roztworu A i 20 mikrolitrów roztworu B w zestawie do wykrywania chemiluminescencji w stosunku jeden do jednego. Zanurz całą membranę jednocześnie w roztworze luminescencyjnym i obserwuj sygnały za pomocą wielofunkcyjnego systemu obrazowania.Na laserowej konfokalnej szalce Petriego inkubuj komórki Aa23 i Aa23-T przez trzy do czterech dni w temperaturze 28 stopni Celsjusza pod 5% atmosferycznym dwutlenkiem węgla. Gdy komórka osiągnie 60 do 70% konfluencji, umyj komórki trzykrotnie PBS. Utrwal komórki w jednym ml 4% paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Umyj utrwalone komórki za pomocą PBST przez pięć minut i ponownie przemyj komórki dwukrotnie PBS. Inkubować szalkę Petriego w jednym ml 3% albuminy surowicy bydlęcej przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 100 mikrolitrów mysiego przeciwciała poliklonalnego anty-WSP i mysiej surowicy do szkiełek i inkubuj przez noc w mokrym pudełku w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wyjmij szalkę Petriego z mokrego pudełka i przywróć je do temperatury pokojowej. Umyj je trzy razy za pomocą PBS i wyjmij PBS. Chroń następujące procedury przed światłem.Inkubować szalkę Petriego ze 100 mikrolitrami sprzężonego z Alexa Fluor 488 koziego przeciwciała anty-mysiego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Inkubować próbkę na szalce Petriego z 50 mikrolitrami DAPI rozcieńczonymi w PBS do 10 mikrogramów/ml w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie przemyć je trzykrotnie PBS. Obserwuj barwienie immunologiczne pod mikroskopem konfokalnym.Przed wykryciem Wolbachii, komórki Aa23 i Aa23-T obserwowano pod mikroskopem świetlnym w celu określenia różnic morfologicznych między dwiema liniami komórkowymi. Limfocyty Aa23 i AA23-T miały co najmniej dwie morfologie komórek, ale nie zaobserwowano widocznych różnic morfologicznych między tymi dwoma typami komórek. Stosując startery diagnostyczne 81F/691R, wykryto dodatnią amplifikację genu Wolbachia wsp w komórkach Aa23, ale nie w komórkach Aa23-T.Analiza gęstości Wolbachia w liniach komórkowych wykazała stosunek wsp / rps6 wynoszący 2,4 w komórkach Aa23, ale brak Wolbachii w komórkach Aa23-T. Analiza Western blot ekstraktów białkowych wykazała silny sygnał wsp dla Aa23, ale nie wykryto żadnego sygnału dla Aa23-T. Pośredni test immunofluorescencyjny wykrył białko wsp w komórkach Aa23, podczas gdy w komórkach Aa23-T wykryto tylko DNA barwione DAPI.Upewnij się, że kolby hodowlane są inkubowane w temperaturze 28 stopni Celsjusza w 5% atmosferycznym dwutlenku węgla przez pięć do siedmiu dni. Procedura ta może być stosowana za pomocą mikroskopii elektronowej, w której należy zwrócić szczególną uwagę na przygotowanie i cięcie próbki. Cztery metody eksperymentalne zastosowane w tym badaniu potwierdziły dokładność wykrywania zakażenia Wolbachia w komórkach, co ma również zastosowanie do innych typów komórek i tkanek.

detecting-wolbachia-strain-walbb-in-aedes-albopictus-cell-lines

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zakażenie bakterią Wolbachia u Drosophila

Niniejszy film opisuje metodę oczyszczania Wolbachia pipientis z linii komórkowej Anopheles gambiae, a następnie hodowli tego endosymbionta w medium bezkomórkowym. Przedstawiono również test żywotności bakterii.

Utrzymywanie Wolbachia w medium bezkomórkowym

Analizy RNA-Seq stają się coraz ważniejsze dla identyfikacji molekularnych podstaw cech adaptacyjnych w organizmach niemodelowych. W tym miejscu opisano protokół identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji między komarami Aedes albopictus z diapauzą i bez diapauzy, od hodowli komarów po sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne danych RNA-Seq.

Eksperymentalny i bioinformatyczny protokół do analiz sekwencyjnych RNA diapauzy fotoperiodycznej u azjatyckiego komara tygrysiego, Aedes albopictus

Komary Aedes aegypti zakażone Wolbachią są uwalniane do naturalnych populacji w celu zahamowania transmisji arbowirusów. Opisujemy metody hodowli Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia w laboratorium do eksperymentów i uwolnienia w terenie, podejmując środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji i selekcji laboratoryjnej.

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

Ten protokół opisuje, jak ustalić infekcję wirusową in vivo u Drosophila melanogaster przy użyciu metody nanoiniekcji i podstawowych technik analizy interakcji wirus-gospodarz.

Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster

Opisana to oszczędzająca czas i miejsce metoda liczenia jaj i określania szybkości wylęgu poszczególnych komarów za pomocą 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, co może znacznie zwiększyć skalę i szybkość testów płodności i płodności.

Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL)

Protokół hodowli pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis. Pasożyt przechodzi z jednego pokolenia komarów Aedes aegypti do następnego poprzez przenoszenie poziome w stadium larwalnym, a następnie przenoszenie pionowe w stadium dorosłym. Żywe sporoplazmy przeżywają długotrwale w zakażonych jajach.

Rozmnażanie pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis w komarach Aedes aegypti

Tutaj prezentujemy protokół badania konkurencyjności godowej samców Aedes aegypti przy użyciu barwnika fluorescencyjnego jako markera. Samice komarów są narażone na kontakt zarówno z oznaczonymi, jak i nieoznaczonymi samcami w celu kopulacji. Po kryciu ich plemniki są badane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia ich partnera godowego.

Wykorzystanie barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B, do badania konkurencyjności godowej samców komarów Aedes aegypti

Manipulacja interferencją RNA (RNAi) stanowi ogromne wyzwanie dla wielu gatunków parazytoidów o niewielkich rozmiarach, takich jak osy Trichogramma. W badaniu tym opracowano skuteczną metodę RNAi u Trichogramma denrolimi. Obecna metodologia zapewnia solidny model do badania regulacji genów u os Trichogramma.

Interferencja RNA w parazytoidzie jaja, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Społeczności mikrobiologiczne u komarów są bardzo obiecujące dla strategii biokontroli wektorów. Większość symbiontów nie nadaje się do hodowli, co wymaga analiz metagenomicznych. Opisujemy metodę preparacji samic komarów i oddzielania jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych, zapobiegając zanieczyszczeniu krzyżowemu, ułatwiając badania mikrobiomu na poziomie narządów i zwiększając zrozumienie roli mikroorganizmów w biologii komarów.

Rozwarstwienie jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów w celu analizy mikrobiomu na poziomie narządów

Linie komórkowe są przydatne w badaniach nad organizmami wewnątrzkomórkowymi, które nie mogą być hodowane poza komórkami gospodarza. Chociaż linie zakażone Wolbachią umożliwiły wiele odkryć, niejednorodność w obrębie tych linii może prowadzić do zmiennych wyników eksperymentalnych. Przedstawiamy protokół generowania klonów jednokomórkowych i ciągłych hodowli z komórek JW18 zakażonych Wolbachią.

Generacja kultur monoklonalnych z linii komórkowej Drosophila melanogaster JW18 zakażonej Wolbachią

Poznaj cztery metody wykrywania wewnątrzkomórkowej bakterii Wolbachia w liniach komórkowych Aedes albopictus. Protokół poprawia dokładność detekcji infekcji i wspiera badania nad interakcjami bakterii z komórkami gospodarza.

Wykrywanie szczepu Wolbachia wAlbB w liniach komórkowych Aedes albopictus

Przeglądaj więcej filmów