Model padaczki o etiologii zakaźnej z wykorzystaniem wirusa mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera
23 czerwca 2022
Zakażenie śródmózgowe wirusem mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) u myszy C57BL/6 powiela wiele wczesnych i przewlekłych objawów klinicznych wirusowego zapalenia mózgu i późniejszej padaczki u ludzi. W artykule opisano zakażenie wirusem, objawy i histopatologię modelu TMEV.
Model TMEV jest jedną z pierwszych platform eksperymentalnych, które pozwalają na badanie mechanizmów powstawania napadów w wyniku zakażenia OUN. Infekcje OUN znacznie zwiększają ryzyko wystąpienia padaczki. Model ten pomaga zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne i związki dla pacjentów z grupy ryzyka.
Eksperymentatorzy powinni być przeszkoleni w pracy z myszami. Wstrzykiwanie wirusa można bardzo dobrze praktykować, wstrzykując barwnik martwym zwierzętom, aby osiągnąć wystarczającą precyzję i rutynę. Procedurę zademonstruje Laura Bell, doktorantka z mojego laboratorium.
Na początek zdejmij nasadkę strzykawki insulinowej i dodaj rurkę polietylenową jako kołnierz wokół igły, aby zapewnić odpowiednią głębokość wstrzyknięcia 2,5 milimetra. Następnie zanurz strzykawkę w etanolu na 30 minut i umieść strzykawkę w świetle UV na 30 minut. Następnie nałożyć nasadkę z powrotem na igłę i zawinąć strzykawkę w woreczek do sterylizacji.
Zaklej saszetkę taśmą, aby ją zamknąć i oznaczyć datą przygotowania. Aby wykonać wstrzyknięcie wirusa, pobierz porcje szczepu Danielsa TMEV z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozmrozić wirusa i trzymać go na lodzie.
Następnie załadować do strzykawki zawiesinę wirusa. Następnie wyczyść ławkę środkiem dezynfekującym i pracuj pod pochłaniaczem oparów. Przenieś znieczuloną mysz z pudełka anestezjologicznego pod maskę i sprawdź tolerancję chirurgiczną, wykonując uszczypnięcie palca u nogi.
Następnie należy oczyścić głowę zwierzęcia wacikiem nasączonym alkoholem i lekko przechylić głowę myszy w lewo, tak aby miejsce wstrzyknięcia było skierowane do góry. Pociągnij skórę nieco do tyłu i włóż igłę do głowy. Następnie wstrzyknąć 20 mikrolitrów dordzeniowo na głębokość 2,5 milimetra w obszar skroniowy prawej półkuli.
Pozostawić strzykawkę na miejscu przez pięć do 15 sekund i sprawdzić, czy nie ma wycieków z wstrzyknięcia lub czy widoczne są pęcherzyki powietrza, a następnie przygotować nową strzykawkę. Ostrożnie wyciągając strzykawkę, należy ją lekko obrócić. Następnie przenieś zwierzę do nowej klatki, która jest umieszczana w połowie na poduszce grzewczej podczas rekonwalescencji po znieczuleniu.
I nie zostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Najpierw przynieś wszystkie klatki na ławkę i obserwuj zwierzęta pod kątem napadów dwa razy dziennie w fazie światła. Oceń aktywność napadową za pomocą zmodyfikowanej skali wyścigowej i podaj liczbę i intensywność napadów.
Następnie przesuń długopis po klatce, aby narobić trochę hałasu i przenieś każde zwierzę do innego pudełka iz powrotem. W przypadku zwierząt, które nie chwyciły się spontanicznie lub po delikatnym potrząśnięciu klatką, wywołaj drgawki poprzez bardziej intensywne obchodzenie się, ostrożnie obracając mysz, obracając ją na ogonie od lewej do prawej. Ponownie obserwuj każde zwierzę pod kątem napadów padaczkowych i powtórz ten proces dla kolejnych klatek.
Napady behawioralne rejestrowano, jeśli wystąpiły podczas wstrzykiwań narkotyków lub podczas kolejnych sesji monitorowania napadów. Zaobserwowane dane zostały przedstawione w postaci mapy cieplnej utworzonej poprzez zobrazowanie etapów napadu w różnych kolorach. Rejestrując EEG, można zidentyfikować różne zdarzenia padaczkowe w fazie przewlekłej, kilka miesięcy po zakażeniu TMEV.
Kwantyfikacja zwyrodnienia hipokampa i myszy zakażonych padaczką TMEV wykazuje znaczne zmniejszenie obszaru hipokampa i odpowiadający mu wzrost obszaru komorowego myszy TMEV w porównaniu z grupą kontrolną. Analiza immunohistologiczna może dostarczyć informacji na temat różnych parametrów, takich jak obecność komórek zapalnych. W tym przypadku skrawki zawierające hipokamp wybarwiono przeciwciałami znakującymi limfocyty T.
Zwierzęta zakażone pozorami nie wykazują infiltracji limfocytów T, podczas gdy umiarkowaną infiltrację zaobserwowano u większości myszy zakażonych TMEV. Niektóre z zakażonych myszy wykazują ciężką infiltrację limfocytów T. Nie wszystkie zwierzęta mają napady padaczkowe podczas każdego okresu obserwacji.
Również największa częstość występowania napadów występuje w piątym i szóstym dniu po szczepieniu. Używamy modelu TMEV do testowania skuteczności nowych leków przeciwpadaczkowych przeciwko napadom wywołanym infekcją. Można również oceniać testy badające współistniejące zmiany behawioralne i zmiany elektrofizjologiczne.
Model TMEV dostarczył społeczności badawczej zajmującej się padaczką pierwszego modelu padaczki skroniowej wywołanego zakażeniem OUN, co pozwoliło na zbadanie mechanizmów leżących u podstaw epileptogenezy po zakażeniu.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje model wirusa zapalenia mózgu myszy Theilera (TMEV) u myszy C57BL/6, który odzwierciedla objawy ludzkiego wirusowego zapalenia mózgu oraz epilepsji. Celem badań jest zrozumienie mechanizmów rozwoju napadów drgawkowych wynikających z infekcji OUN oraz ocena potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu epilepsji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Wirusologia
- Badania nad epilepsją
Wstęp
- Zakażenie TMEV prowadzi do wystąpienia znaczących objawów wczesnych i chronicznych u myszy.
- Zakażenia OUN zwiększają ryzyko rozwoju epilepsji.
- Model TMEV ułatwia badanie mechanizmów leżących u podłoża napadów drgawek.
- Wymagane jest przeszkolenie w zakresie prawidłowej obsługi zwierząt i technik wstrzykiwania wirusa.
Cel badania
- Ocena modelu TMEV dla epilepsji wywołanej infekcją OUN.
- Identyfikacja wyzwalaczy napadów oraz potencjalnych kandydatów terapeutycznych.
- Zrozumienie zmian behawioralnych i elektrofizjologicznych po infekcji.
Zastosowane metody
- Główna platforma eksperymentalna obejmuje wstrzyknięcie wirusa TMEV myszom C57BL/6.
- Model biologiczny koncentruje się na odpowiedziach OUN na zakażenie wirusowe.
- Urazy i interwencje obejmują monitorowanie aktywności napadowej po zakażeniu.
- Kluczowe etapy obejmują przygotowanie wirusa, iniekcję oraz monitorowanie występowania napadów.
- Elektroencefalografia (EEG) jest wykorzystywana do oceny charakterystyki napadów.
Główne wyniki
- Wyniki wskazują na znaczną degenerację hipokampa u myszy zainfekowanych TMEV.
- Charakterystyka infiltracji limfocytów T w hipokampie ujawniła różny stopień odpowiedzi zapalnej.
- Model ten obrazuje początek i wyzwalacze napadów, co prowadzi do oceny skuteczności leków przeciwdrgawkowych.
- Częstość napadów osiąga szczyt około piątego i szóstego dnia po inokulacji.
Wnioski
- Niniejsze badanie ustanawia model TMEV jako kluczową platformę do badań nad epilepsją.
- Wyniki podkreślają znaczenie dla zrozumienia mechanizmów epilepsji indukowanej infekcjami OUN.
- Uzyskana wiedza może wpłynąć na strategie terapeutyczne w leczeniu epilepsji po infekcji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modelowanie epilepsji o etiologii infekcyjnej z wykorzystaniem platformy TMEV umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka oraz walidację punktów uchwycenia dla epileptogenezy indukowanej infekcjami OUN. Model ten zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania leków oraz w badaniach translacyjnych, odtwarzając zarówno ostre, jak i chroniczne fenotypy napadów istotne dla przebiegu choroby u ludzi. Jego zastosowanie ułatwia selekcję projektów oraz priorytetyzację nowych związków przeciwdrgawkowych dla grup pacjentów wysokiego ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów epileptogennych wywołanych infekcją oraz wyjaśnienie przebiegu tych procesów.
- Wspiera biologiczną ocenę ryzyka poprzez modelowanie klinicznie istotnych fenotypów napadów po infekcji OUN.
- Ułatwia walidację funkcjonalną celów dla potencjalnych leków przeciwdrgawkowych w systemie istotnym dla danej choroby.
- Zapewnia pewność prognostyczną w procesie rozwoju związków celowanych w padaczkę indukowaną infekcją.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane modele zwierzęce do ilościowego monitorowania napadów i testowania skuteczności związków.
- Standaryzuje ocenę napadów i odczyty oparte na EEG w celu uzyskania powtarzalnych wyników analizy.
- Umożliwia skalowalny screening nowych terapeutyków pod kątem punktów końcowych napadów indukowanych infekcją.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków zarówno na parametry behawioralne, jak i elektrofizjologiczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z rozwojem biomarkerów translacyjnych poprzez histopatologiczne i neurozapalne punkty końcowe.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych do walidacji przedklinicznej w przypadku padaczki wywołanej infekcją.
- Uzasadnia decyzje dotyczące rozwoju terapeutyków celowanych w OUN, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Zapewnia predykcyjne ograniczanie ryzyka biologicznego na późnych etapach w portfelach badań nad padaczką.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model TMEV integruje etapy od wczesnego odkrywania, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną w przypadku epilepsji indukowanej infekcją.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących powiązań między infekcją a epileptogenezą oraz analizę szlaków mechanistycznych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalną kwantyfikację napadów oraz zestandaryzowane wyniki behawioralne i EEG do wstępnej oceny związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowe wskaźniki częstotliwości i intensywności napadów oraz parametry histopatologiczne do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkrywcze z przedklinicznymi badaniami biomarkerów i skuteczności w kontekście istotnym dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do prowadzenia ciągłych badań nad przeciwdrgawkowymi i przeciwzapalnymi procesami neurologicznymi w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa wiarygodność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad padaczką wywołaną infekcją.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację, skalowalność i powtarzalność procesów monitorowania napadów oraz testowania związków chemicznych.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki skupieniu się na punktach końcowych istotnych z punktu widzenia translacyjnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój kandydatów na terapie ukierunkowane na ośrodkowy układ nerwowy (CNS).
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie mysich modeli infekcji OUN oraz technik monitorowania drgawek.
- Wymagany jest dostęp do specjalistycznej aparatury do EEG oraz analiz histopatologicznych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów oceny drgawek i raportowania danych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do różnych szczepów myszy lub modeli infekcji może wymagać optymalizacji protokołu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność osobniczą zwierząt oraz konieczność rygorystycznego przeszkolenia w procedurach iniekcji.
