Name: Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 49 s
Description: Poznaj metodę generowania bibliotek RNA wirusa HCV o zróżnicowanej genetycznie zawartości przy użyciu ep-PCR. Technika ta umożliwia szybkie tworzenie pełnowymiarowych wariantów bez klonowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe (numer grantu BT/PR10906/MED/29/860/2014) dla tego badania zostało zapewnione przez Departament Biotechnologii Rządu Indii.

<ol><li>Desselberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+of+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics of rotavirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).</li>
<li>Singh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mutagenesis+of+hepatitis+C+virus+reveals+ability+of+genome+to+overcome+detrimental+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations.</a> Journal of Virology. 94 (3), 01327(2020).</li>
<li>Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+synthesis+and+phenotypic+analysis+of+mutant+clouds+for+hepatitis+E+virus+genotype+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1.</a> Journal of Virology. 92 (4), 01932(2018).</li>
<li>Edmonds, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bacterium-free+method+for+generation+of+flavivirus+infectious+DNA+by+circular+polymerase+extension+reaction+allows+accurate+recapitulation+of+viral+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity.</a> Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).</li>
<li>Arumugaswami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+functional+profiling+of+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome.</a> PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182(2008).</li>
<li>Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mutagenesis+of+influenza+virus+reveals+unique+plasticity+of+the+hemagglutinin+and+NS1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).</li>
<li>Eyre, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mutagenesis+of+dengue+virus+reveals+plasticity+of+the+NS1+protein+and+enables+generation+of+infectious+tagged+reporter+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses.</a> Journal of Virology. 91 (23), 01455(2017).</li>
<li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+Journal.+American+Institute+of+Chemical+Engineers%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: Past, present, and future.</a> AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li>
<li>Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+directed+evolution+for+improving+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Developments in directed evolution for improving enzyme functions.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).</li>
<li>Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory-directed+protein+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Laboratory-directed protein evolution.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+by+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturation+and+electrophoresis+of+RNA+with+formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).</li>
<li>Lindenbach, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+HCV+infectivity+produced+in+cell+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).</li>
<li>Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+calculation+of+TCID50+for+quantitation+of+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity.</a> Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).</li>
<li>Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+fitness+of+hepatitis+C+virus+increases+resistance+to+direct-acting+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals.</a> The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).</li>
<li>Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCV+replicon+systems%3A+Workhorses+of+drug+discovery+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance.</a> Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325(2020).</li>
<li>Cadwell, R. C., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomization+of+genes+by+PCR+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Randomization of genes by PCR mutagenesis.</a> PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu szczegółowo opisaliśmy prostą i szybką procedurę FL-MRS, która integruje ep-PCR18 i genetykę odwrotną w celu syntezy bibliotek pełnego genomu HCV, które można następnie wykorzystać w systemie hodowli komórkowej w celu wygenerowania wariantów kompetentnych do replikacji do badań przesiewowych fenotypów opornych na leki. Zastosowanie polimerazy DNA Taq o niskiej wierności jest warunkiem wstępnym ep-PCR, który umożliwia włączenie podstawień podczas amplifikacji PCR pełnowymiarowego geno...

Genetyczne badanie przesiewowe rozpoczyna się od interesującego nas fenotypu wirusa, a następnie, poprzez sekwencjonowanie jego genomu i porównanie go z genomem oryginalnego szczepu, próbuje zidentyfikować mutację (mutacje) powodującą ten fenotyp. W przeciwieństwie do tego, w odwróconych genetycznych badaniach przesiewowych, losowe mutacje są wprowadzane do genu docelowego, po czym następuje badanie wynikowego fenotypu (fenotypów)1. W przypadku podejścia opartego na genetyce odwrotnej, mutageneza in vitro jest najczęściej stosowaną techniką tworzenia puli wariantów, które są następnie badane pod kątem fenotypów będących przedmiotem zainteresowania. Opisano różne narzędzia genetyczne do osiągnięcia losowej mutagenezy wirusów RNA w całym genomie, w tym podatny na błędy PCR (ep-PCR)2,3, circular polymerase extension4 i mutageneza insercji Mu-transpozonu 5,6,7. Dwie ostatnie metody dają biblioteki o ograniczonej różnorodności sekwencji i są podatne na wprowadzanie dużych insercji i delecji, które są wysoce śmiertelne dla wirusów i poważnie ograniczają odzyskiwanie zakaźnych wariantów wirusa.
ep-PCR to dobrze znana, potężna technika mutagenezy, szeroko stosowana w inżynierii białkowej, do generowania zmutowanych enzymów do wyboru fenotypów o pożądanych właściwościach, takich jak zwiększona stabilność termiczna, specyficzność substratu i aktywność katalityczna8,9,10. Ta technika jest łatwa do wykonania, ponieważ wymaga prostego sprzętu, nie wiąże się ze żmudnymi manipulacjami, wykorzystuje dostępne na rynku odczynniki i jest szybka; Co więcej, generuje wysokiej jakości biblioteki.
Tutaj opracowaliśmy nową metodę pełnej syntezy zmutowanego RNA (FL-MRS) do generowania kompletnych genomów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) poprzez integrację ep-PCR, która indukuje losową mutagenezę substytucyjną całego genomu i genetykę odwrotną. Nawet insercja lub delecja pojedynczego nukleotydu jest wysoce szkodliwa dla wirusów RNA o dodatnim sensie ([+]ssRNA); w związku z tym mutageneza substytucyjna oparta na PCR jest preferowaną metodą iteracyjnego generowania dużych, zróżnicowanych bibliotek pełnych (+)ss genomów wirusa RNA o dobrej żywotności.
FL-MRS to proste podejście, które można zastosować do każdego wirusa RNA o dodatnim znaczeniu o długości genomu ~10 kb dzięki skrupulatnemu zaprojektowaniu zestawu starterów, który wiąże się z klonem cDNA wirusa. pJFH1 to zakaźny klon cDNA, który koduje genotyp 2a HCV i może podsumować wszystkie etapy cyklu życia wirusa. Stosując podejście FL-MRS, wykazaliśmy syntezę losowo zmutagenizowanych bibliotek pełnego genomu (zmutowane biblioteki [ML]) w celu wytworzenia kompetentnych replikacyjnie wariantów JFH1, dla których nie było wcześniejszej wiedzy na temat właściwości związanych z mutacjami. Po ekspozycji na lek przeciwwirusowy niektóre warianty wirusa szybko pokonały presję leku, uzyskując pożądaną zmianę fenotypową. Korzystając z opisanego tutaj protokołu, można wygenerować mnóstwo wariantów wirusa, co stwarza możliwości badania ewolucji wirusów (+)ssRNA.

<table><tbody><tr><td>1 kb plus drabinka DNA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10787018</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 1,5 ml</td><td>Tarsons</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa</td><td>Tarsons</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>35 mm naczynie do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>960010</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka wirówkowa</td><td>Tarsons</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Merck</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>MB080</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do elektroforezy w żelu Agrose</td><td>Gabinet bezpieczeństwa biologicznego 1704406</td><td></td><td></td>BioRad</tr>, <tr><td>klasa II</td><td>ESCO</td><td>AC2 4S</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej Wirówka</td><td>HiMedia</td><td>MB083</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>System detekcji PCR w czasie rzeczywistym <td>Eppendorf</td><td>5424-R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect BioRad</td><td></td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>Płytki klonujące 90 mm&nbsp;</td><td></td><td>Inkubator CO</td>2 Tarson 460091<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Spektrometr mikroobjętościowy <td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170R</td><td></td></tr><tr><td>Colibri</td><td>11050140</td><td></td><td>Titertek-Berthold</td></tr><tr><td>DAB&nbsp; Podłoże&nbsp; Zestaw&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab94665</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dATP NEB</td><td></td><td>N0440S Zestaw roztworów</td><td></td></tr><tr><td>deoksynukleotydu (dNTP)</td><td>NEB</td><td>N0446</td><td></td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu (DEPC)&nbsp;</td><td>SRL chemiczny</td><td>46791</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>HiMedia</td><td>MB058</td><td></td></tr><tr><td>DMEM wysoki poziom glukozy</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sól tetrasodowa dwuwodna</td><td>HiMedia</td><td>GRM4918</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd&nbsp;</td>System dokumentacji żelu <td>Fishser Scientific</td><td>12755</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ALPHA IMAGER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG (H+L), HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>A16066</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30%</td> <td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nickon</td><td>&nbsp; Rosół ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>LB&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>M1245</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000&nbsp;</td><td>Odczynnik do</td><td>transfekcji</td><td>Thermo Fisher 116680270</td></tr><tr><td>Zestaw pipet mechanicznych</td><td>Eppendorf&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>3120000909</tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Micro Końcówki 0,2-10 i mikro; l&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>521000</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Końcówki 10 - 100 & mikro; l&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>Mikro końcówki 200-1000 i mikro; l&nbsp;</td>Bufor MOPS <td>Tarsons</td><td>521020</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>GeNei</td><td>3601805001730</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Kompetentne chemicznie&nbsp;E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>E.coli DH5&alpha;</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>1105-021</td><td>minimalna niezbędna pożywka</td></tr><tr><td>probówka do PCR 0,2 ml</td><td>Tarsons</td><td>510051</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td>T-wektor DNA</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)</td><td>HiMedia</td><td>TI1099</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Pibrentasvir</td><td>Cayman Chemical</td><td>27546</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler pipet&nbsp;</td><td>Gilson&nbsp;</td><td></td><td></td>F110120</tr><tr><td>Polimeraza DNA Platinum Taq&nbsp;</td><td>Oprogramowanie do</td><td></td> analizy statystycznej Thermo 10966034 <td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini&nbsp;</td><td>Zestaw do izolacji wirusa</td> <td>Qiagen</td><td>52904</td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania QIAprep Spin</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Zestaw</td> do <td>oczyszczania cokum</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy Mini&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>Zestaw do czyszczenia RNA</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 25 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>170357N</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>Pipety</td> serologiczne Thermo Fisher <td>170355N10</td><td></td></tr><tr><td>ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>Jednoniciowy marker RNA 0,2-10 kb</td><td>Merck</td><td>R7020</td><td></td></tr><tr><td>Mleko odtłuszczone&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>M530</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu 0,1 M roztwór</td><td>Merck</td><td>8591</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Odwrotna transkryptaza&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td>odwrotną transkryptazę</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T175 kolba do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T25&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>950040</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMax Express System produkcji RNA na dużą skalę&nbsp;</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>&nbsp; System produkcji RNA na dużą skalę&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T75&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>950050</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraza</td><td>Genetix Biotech (Puregene)</td><td>PGM040</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-CT 1-etapowy zestaw</td><td>Applied Biosystems</td><td>4392653</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-CT&nbsp; 1-Krok&nbsp; Zestaw</td><td>Thermo Fisher</td><td>4392653</td><td>komercyjny zestaw qRT-PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>TOPO-XL--2 Kompletny zestaw do klonowania PCR</td><td>Zestaw Thermo Fisher</td><td>K8050-10</td><td>do klonowania produktu long-PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>HiMedia</td><td>TC072</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Trypsin-EDTA</td><td>HiMedia</td><td>TCL007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>HiMedia</td><td>MB067</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próżni&nbsp;</td><td>Eppendorf, Concentrator Plus</td><td>100248</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna&nbsp;</td><td>DOTACJA</td><td>JBN-18</td><td></td></tr><tr><td>Xba1</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr></tbody></table>

genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa rna o pozytywnym wyczuwaniu

Reverse Genetics to Engineer Positive-Sense RNA Virus Variants

Brak wygodnej metody do iteracyjnego generowania różnorodnych, pełnowymiarowych wariantów wirusa utrudnił badania nad ukierunkowaną ewolucją wirusów RNA. Integrując podatną na błędy PCR w pełnym genomie RNA i genetykę odwrotną, można wywołać losową mutagenezę substytucyjną w całym genomie. Opracowaliśmy metodę wykorzystującą tę technikę do syntezy różnych bibliotek w celu identyfikacji mutantów wirusowych o interesujących fenotypach. Ta metoda, zwana syntezą zmutowanego RNA na pełnej długości (FL-MRS), oferuje następujące korzyści: (i) możliwość stworzenia dużej biblioteki za pomocą wysoce wydajnego, jednoetapowego, podatnego na błędy PCR; (ii) zdolność do tworzenia grup bibliotek o różnym poziomie różnorodności genetycznej poprzez manipulowanie wiernością polimerazy DNA; (iii) stworzenie pełnowymiarowego produktu PCR, który może bezpośrednio służyć jako matryca do syntezy zmutowanego RNA; oraz (iv) zdolność do tworzenia RNA, które może być dostarczane do komórek gospodarza jako niewybrana pula wejściowa w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem mutantów wirusa o pożądanym fenotypie. Odkryliśmy, stosując podejście genetyki odwrotnej, że FL-MRS jest wiarygodnym narzędziem do badania ewolucji ukierunkowanej na wirusa na wszystkich etapach cyklu życiowego wirusa zapalenia wątroby typu C, izolatu JFH1. Technika ta wydaje się być nieocenionym narzędziem do zastosowania ukierunkowanej ewolucji w celu zrozumienia adaptacji, replikacji i roli genów wirusowych w patogenezie i oporności przeciwwirusowej w wirusach RNA o dodatnim sensie.

Można wygenerować i przesiewać liczne warianty pełnowymiarowego HCV w celu poszukiwania interesujących fenotypów lekoopornych, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w Rycina 1Biblioteki mutantów pełnego genomu zsyntetyzowano z użyciem clonal-pJFH1 w malejących ilościach (100–10 ng), jak pokazano w Rycina 2Średnie wydajności produktów ep-PCR (bibliotek mutantów) wynosiły od 3,8 do 12,5 ng/µL. Rycina 3 przedstawia transkrypty wir...

Protokół opisuje metodę wprowadzania kontrolowanej różnorodności genetycznej w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez połączenie pełnej długości syntezy zmutowanego RNA za pomocą podatnego na błędy PCR i genetyki odwrotnej. Metoda ta stanowi model selekcji fenotypu i może być stosowana do 10 kb długich genomów wirusa RNA o dodatnim sensie.

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA ...

Opisany tutaj protokół pozwala na generowanie losowo mutagenizowanych bibliotek RNA o pełnej długości jednoniciowych dodatnich genomów wirusowych RNA o długości do 10 kilobajtów oraz wybór interesujących fenotypów w pożądanych warunkach eksperymentalnych. Technika ta może w krótkim czasie stworzyć biblioteki wirusowego RNA o pełnej długości i różnym poziomie różnorodności genetycznej przy użyciu podejścia wolnego od klonowania. Technika ta wykorzystuje niedrogie i powszechnie dostępne odczynniki do syntezy bibliotek.Procedurę zademonstruje Shaheen Khan, doktorantka z Sekcji Wirusologii na Wydziale Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Shiv Nadar. Na początek należy przeprowadzić ep-PCR, przygotowując mieszankę wzorcową do czterech zestawów eksperymentów ze starterami do przodu i do tyłu wraz ze składnikami reakcji bez matrycy pJFH1, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Podzielić mieszaninę wzorcową na cztery probówki.Dodaj 100 nanogramów, 50 nanogramów, 25 nanogramów i 10 nanogramów matrycy do poszczególnych probówek i dostosuj całkowitą objętość reakcji do 50 mikrolitrów. Zastosuj warunki cykliczne, aby wzmocnić fragment pary 97 36 zasad. Oszacuj amplifikowany produkt ep-PCR, ładując pięć mikrolitrów produktów PCR i porównując go ze znanymi ilościami jednej drabiny DNA o jednej podstawie kilozasady, przeprowadzając elektroforezę w żelu agarozowym na bazie 0,8% TAE.Oczyść produkt za pomocą zestawu do oczyszczania kolumnowego. Oszacować stężenie oczyszczonego produktu, mierząc absorbancję przy 260 nanometrach. Zagęścić próżniowo produkt ep-PCR, aby uzyskać stężenie produktu równe lub większe niż 100 nanogramów na mikrolitr.Przygotuj reakcję syntezy RNA in vitro i umieść ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza do inkubacji. Następnie należy oczyścić zsyntetyzowany produkt za pomocą zestawu do oczyszczania kolumnowego. Przygotuj reakcję syntezy cDNA o objętości 20 mikrolitrów, dodając około jednego mikrograma wirusowego RNA, pięciu mikromolowych starterów odwrotnych i 200 jednostek odwrotnej transkryptazy, zgodnie z zaleceniami producenta.Korzystając z cDNA, przygotuj mieszaninę reakcyjną zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym i uruchom cykl amplifikacji. Uruchom produkt na żelu agarozowym na bazie 0,8% TAE, aby potwierdzić rozmiar produktu 25 par 71 zasad, a następnie oczyść produkt za pomocą zestawu do oczyszczania kolumnowego, jak pokazano wcześniej. Eluować w 40 mikrolitrach sterylnej wody.Aby dodać trzy główne zwisy A, dodaj 0,5 mikromolowego DATP i jedną jednostkę polimerazy DNA Taq o niskiej wierności i inkubuj cały produkt PCR w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 minut, wraz z 1X buforem PCR i 1,5 milimolowym chlorkiem magnezu. Następnie oczyść mieszaninę za pomocą zestawu do oczyszczania kolumny. Ustaw reakcję ligacji i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez trzy godziny.Następnie dodaj 100 mikrolitrów Escherichia coli DH5-Alpha do ligowanego DNA i poddaj komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 35 sekund. Dodaj jeden mililitr pożywki LB do zawiesiny komórkowej i inkubuj z delikatnym wstrząsaniem przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wirować przy 13 800 RCF.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach świeżej pożywki LB. Umieść 100 mikrolitrów przekształconych komórek DH5-alfa E. coli na płytce LB zawierającej 50 mikrogramów na mililitr ampicyliny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Ustaw mini preparaty od 25 do 30 kolonii w pięciu mililitrach pożywki LB zawierającej 50 mikrogramów na mililitr ampicyliny i hoduj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia wyekstrahuj plazmidy za pomocą komercyjnego zestawu i przeprowadź trawienie enzymem restrykcyjnym w objętości 10 mikrolitrów z 200 nanogramami izolowanych plazmidów, dwiema jednostkami EcoR1 i buforem restrykcyjnym 1X dla wszystkich kolonii. Po inkubacji mieszanin wytrawiających w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, załaduj produkty na 0,8% żelu agarozowym na bazie TAE, aby potwierdzić insercję plazmidowego DNA. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera plazmidów 25 dodatnich klonów przy użyciu zalecanych starterów.Dzień przed transfekcją podziel komórki i policz liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru. Następnie wysiewaj ludzkie komórki wątrobiaka 7,5 w 35-milimetrowych szalkach w dwóch mililitrach kompletnego DMEM i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia należy przygotować kompleks lipidów transkrypcyjnych, rozcieńczając 10 mikrolitrów odczynnika do transfekcji w 50 mikrolitrach minimalnej pożywki niezbędnej i oddzielnie rozcieńczyć pięć mikrogramów transkryptów wirusowych w 50 mikrolitrach pożywki minimalnej pożywki.Inkubować obie mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie wymieszaj je w jednej sterylnej probówce do mikrowirówek i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji komórek usuń pożywkę hodowlaną, umyj komórki dwukrotnie wstępnie podgrzanym 1X PBS i dodaj 1,5 mililitra minimalnej niezbędnej pożywki.Powoli dodawaj kompleks i delikatnie obracaj naczyniem, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 10 godzin. Następnie usuń pożywkę.Umyj transfekowane komórki dwukrotnie jednym mililitrem wstępnie podgrzanego 1X PBS i dodaj dwa mililitry kompletnego DMEM. Wyizoluj wirusowe RNA ze 140 mikrolitrów supernatantów hodowlanych za pomocą zestawu do izolacji wirusowego RNA. Przygotuj 10-mikrolitrową reakcję qRT-PCR przy użyciu komercyjnego zestawu qRT-PCR.Użyj starterów do przodu i do tyłu oraz sondy do kwantyfikacji RNA HCV. Ustaw cykl reakcji na 48 stopni Celsjusza na 20 minut, 95 stopni Celsjusza na 10 minut i 45 cykli 95 stopni Celsjusza na 15 sekund i 60 stopni Celsjusza na jedną minutę. Przeprowadź reakcje i skonfiguruj kontrole negatywne.Równolegle wygeneruj krzywą wzorcową, używając dziesięciokrotnie seryjnie rozcieńczonej znanej liczby kopii transkryptów HCV w celu ilościowego określenia wirusowego RNA. Wykonać w trzech egzemplarzach. Umieść 7,5 komórki ludzkiego wątrobiaka na 96-dołkowej płytce i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla około 16 godzin przed dodaniem wirusa.W komorze klasy bezpieczeństwa biologicznego II należy wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia wirusa. Dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa na studzienkę, aby zainfekować komórki i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po trzech dniach umyj zainfekowane komórki trzykrotnie 0,1 mililitra PBS, a następnie utrwal i przeniknij komórki 0,1 mililitra lodowatego metanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 minut.Umyj studzienki trzykrotnie 1X PBS, a następnie 1X PBST. Po usunięciu PBST zablokuj komórki na 30 minut w temperaturze pokojowej za pomocą 0,1 mililitra 1% BSA zawierającego 0,2% odtłuszczonego mleka w PBST. Usuń roztwór blokujący i traktuj komórki przez pięć minut 0,1 mililitra 3% nadtlenku wodoru przygotowanego w 1X PBS.Ponownie umyj ogniwa dwukrotnie 1X PBS i 1X PBST. Dodać 50 mikrolitrów przeciwciała monoklonalnego anty-NS5A 9E10 do dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Umyj studzienki trzykrotnie 1X PBS i raz PBST.Dodać 50 mikrolitrów sprzężonej z HRP koziej anty-mysiej IgG na studzienkę, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć niezwiązane przeciwciało, przemywając studzienki 0,1 mililitra 1X PBS. Dodaj 30 mikrolitrów DAB i inkubuj płytkę, delikatnie kołysząc przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór DAB i umyj studzienki dwukrotnie 1X PBS i raz wodą destylowaną.Dodaj 100 mikrolitrów PBS zawierającego 0,03% azydku sodu. Zbadaj każdą studzienkę pod mikroskopem światła odwróconego za pomocą obiektywu 10X. Policz liczbę dodatnich dołków.Użyj kalkulatora Reeda i Muencha, aby oszacować rozcieńczenie punktu końcowego, które infekuje 50% studzienek. Rozpuścić pibrentaswir, inhibitor NS5A, w 100% DMSO do stężenia jednego milimola i dalej rozcieńczyć go w pełnym DMEM do stężenia 10 nanomolowych. Następnie zainfekuj naiwne komórki Huh-7,5 przy 70% zbiegu dawką wirusa ML50, aby zainfekować 50% komórek przez 12 godzin, a następnie przenieś zainfekowane komórki na sześciodołkowe płytki 24 godziny po zakażeniu.Dodaj 1X EC50 PIB do zainfekowanych komórek po 16 godzinach od podziału komórek. Zrób to po każdym podziale komórki przez sześć kolejnych pasaży, po których następują trzy cykle pasażu wolnego od leku i monitoruj rozprzestrzenianie się wirusa za pomocą testu tworzącego ognisko. Zbieraj supernatanty wirusowe przy każdym przejściu i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Wyodrębnij wirusowe RNA z supernatantu w dniu 18 i zsyntetyzowane cDNA. Amplifikuj gen NS5A za pomocą pięciu mikrolitrów rozcieńczonego cDNA. Następnie określ mutacje oporności na leki NS5A w sześciu do ośmiu dodatnich plazmidach bakteryjnych za pomocą starterów sekwencjonowania NS5A.Biblioteki mutantów pełnego genomu zsyntetyzowano przy użyciu klonalnego pJFH1 w ilościach zmniejszających się ze 100 do 10 nanogramów. Średnia wydajność produktów ep-PCR wahała się od 3,8 do 12,5 nanogramów na mikrolitr. Odsetek mutacji w zmutowanych bibliotekach wzrastał wraz ze zmniejszającym się wkładem pJFH1 w reakcji ep-PCR.ML50 zsyntetyzowany przy użyciu 50 nanogramów matrycy miał cztery podstawienia na 10 000 skopiowanych par zasad, podczas gdy ML25 zsyntetyzowany przy użyciu 25 nanogramów matrycy zawierał dziewięć podstawień. W klonalnym pJFH1 nie stwierdzono podstawień w obrębie liczby sekwencjonowanych nukleotydów. Warianty wirusa ML50 były mniej podatne na pibrentaswir w porównaniu z klonalnym wirusem JFH1.Spośród ośmiu klonów NS5A, cztery miały kombinację D7V+F28C, podczas gdy V8A+F28C i F36L występowały w jednym klonie. Mutacje te znajdowały się w regionie końca N NS5A, o którym wiadomo, że zawiera klinicznie istotne mutacje oporności na NS5A. Końcowe stężenie każdego składnika ep-PCR ma kluczowe znaczenie, zwłaszcza ilość matrycy.Brak przedłużacza KB znacznie zmniejszy wydajność produktu ep-PCR.

reverse-genetics-to-engineer-positive-sense-rna-virus-variants

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy artykuł opisuje kroki niezbędne do izolacji i charakterystyki wariantów polimerazy RNA o różnym stopniu wierności replikacji w przypadku wirusów RNA oraz sposób wykorzystania danych o częstotliwości mutacji do potwierdzenia zmian wierności w hodowlach tkankowych.

Izolacja wariantów wierności replikacji wirusów RNA i charakterystyka częstotliwości mutacji wirusa

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

Norowirusy są główną przyczyną gastroenteritis, jednak techniki molekularne służące do ich charakterystyki są wciąż stosunkowo nowe. W niniejszej pracy przedstawiamy dwa różne podejścia genetyki odwrotnej w celu efektywnego odzyskiwania norowirusa mysiego (MNV), jedynego przedstawiciela tego rodzaju, który może być propagowany w hodowlach komórkowych.

Odzyskiwanie zakaźnego norowirusa mysiego za pomocą genetyki odwrotnej

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV) był intensywnie badany w ciągu ostatnich kilku lat w celu opracowania nowych wektorów do szczepień i terapii, między innymi. Badania te były możliwe dzięki technikom ratowania rekombinowanego wirusa z cDNA, takim jak te, które tutaj opisujemy.

Ratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Wirus krowianki (VV) jest szeroko stosowany w badaniach biomedycznych i poprawie zdrowia ludzkiego. W tym artykule opisano prostą, bardzo wydajną metodę edycji genomu VV przy użyciu systemu CRISPR-Cas9.

Proste i skuteczne podejście do konstruowania zmutowanych wektorów wirusa krowianki

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Generowanie rekombinowanych rotawirusów z plazmidowego DNA dostarcza niezbędnego narzędzia do badania replikacji i patogenezy rotawirusów oraz rozwoju wektorów ekspresyjnych rotawirusów i szczepionek. W niniejszym artykule opisano uproszczone podejście genetyki odwrotnej do generowania rekombinowanych rotawirusów, w tym szczepów eksprymujących fluorescencyjne białka reporterowe.

Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

AAV generowanie biblioteki wyświetlania peptydów i późniejsza walidacja poprzez kodowanie kreskowe kandydatów o nowych właściwościach do tworzenia AAV nowej generacji.

Izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (AAV)

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę sekwencjonowania Susieciowanych, Ligowanych i Swybranych Hybridów (SPLASH), która umożliwia mapowanie całego genomu wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych interakcji RNA-RNA in vivo. SPLASH może być stosowany do badania interakcji RNA w organizmach, w tym drożdżach, bakteriach i ludziach.

Mapowanie interakcji RNA-RNA na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu

Poznaj metodę generowania bibliotek RNA wirusa HCV o zróżnicowanej genetycznie zawartości przy użyciu ep-PCR. Technika ta umożliwia szybkie tworzenie pełnowymiarowych wariantów bez klonowania.

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

Przeglądaj więcej filmów