Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

Opisany tutaj protokół pozwala na generowanie losowo mutagenizowanych bibliotek RNA o pełnej długości jednoniciowych dodatnich genomów wirusowych RNA o długości do 10 kilobajtów oraz wybór interesujących fenotypów w pożądanych warunkach eksperymentalnych. Technika ta może w krótkim czasie stworzyć biblioteki wirusowego RNA o pełnej długości i różnym poziomie różnorodności genetycznej przy użyciu podejścia wolnego od klonowania. Technika ta wykorzystuje niedrogie i powszechnie dostępne odczynniki do syntezy bibliotek.

Procedurę zademonstruje Shaheen Khan, doktorantka z Sekcji Wirusologii na Wydziale Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Shiv Nadar. Na początek należy przeprowadzić ep-PCR, przygotowując mieszankę wzorcową do czterech zestawów eksperymentów ze starterami do przodu i do tyłu wraz ze składnikami reakcji bez matrycy pJFH1, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Podzielić mieszaninę wzorcową na cztery probówki.

Dodaj 100 nanogramów, 50 nanogramów, 25 nanogramów i 10 nanogramów matrycy do poszczególnych probówek i dostosuj całkowitą objętość reakcji do 50 mikrolitrów. Zastosuj warunki cykliczne, aby wzmocnić fragment pary 97 36 zasad. Oszacuj amplifikowany produkt ep-PCR, ładując pięć mikrolitrów produktów PCR i porównując go ze znanymi ilościami jednej drabiny DNA o jednej podstawie kilozasady, przeprowadzając elektroforezę w żelu agarozowym na bazie 0,8% TAE.

Oczyść produkt za pomocą zestawu do oczyszczania kolumnowego. Oszacować stężenie oczyszczonego produktu, mierząc absorbancję przy 260 nanometrach. Zagęścić próżniowo produkt ep-PCR, aby uzyskać stężenie produktu równe lub większe niż 100 nanogramów na mikrolitr.

Przygotuj reakcję syntezy RNA in vitro i umieść ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza do inkubacji. Następnie należy oczyścić zsyntetyzowany produkt za pomocą zestawu do oczyszczania kolumnowego. Przygotuj reakcję syntezy cDNA o objętości 20 mikrolitrów, dodając około jednego mikrograma wirusowego RNA, pięciu mikromolowych starterów odwrotnych i 200 jednostek odwrotnej transkryptazy, zgodnie z zaleceniami producenta.

Korzystając z cDNA, przygotuj mieszaninę reakcyjną zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym i uruchom cykl amplifikacji. Uruchom produkt na żelu agarozowym na bazie 0,8% TAE, aby potwierdzić rozmiar produktu 25 par 71 zasad, a następnie oczyść produkt za pomocą zestawu do oczyszczania kolumnowego, jak pokazano wcześniej. Eluować w 40 mikrolitrach sterylnej wody.

Aby dodać trzy główne zwisy A, dodaj 0,5 mikromolowego DATP i jedną jednostkę polimerazy DNA Taq o niskiej wierności i inkubuj cały produkt PCR w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 minut, wraz z 1X buforem PCR i 1,5 milimolowym chlorkiem magnezu. Następnie oczyść mieszaninę za pomocą zestawu do oczyszczania kolumny. Ustaw reakcję ligacji i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez trzy godziny.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów Escherichia coli DH5-Alpha do ligowanego DNA i poddaj komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 35 sekund. Dodaj jeden mililitr pożywki LB do zawiesiny komórkowej i inkubuj z delikatnym wstrząsaniem przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wirować przy 13 800 RCF.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach świeżej pożywki LB. Umieść 100 mikrolitrów przekształconych komórek DH5-alfa E. coli na płytce LB zawierającej 50 mikrogramów na mililitr ampicyliny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Ustaw mini preparaty od 25 do 30 kolonii w pięciu mililitrach pożywki LB zawierającej 50 mikrogramów na mililitr ampicyliny i hoduj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia wyekstrahuj plazmidy za pomocą komercyjnego zestawu i przeprowadź trawienie enzymem restrykcyjnym w objętości 10 mikrolitrów z 200 nanogramami izolowanych plazmidów, dwiema jednostkami EcoR1 i buforem restrykcyjnym 1X dla wszystkich kolonii. Po inkubacji mieszanin wytrawiających w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, załaduj produkty na 0,8% żelu agarozowym na bazie TAE, aby potwierdzić insercję plazmidowego DNA. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera plazmidów 25 dodatnich klonów przy użyciu zalecanych starterów.

Dzień przed transfekcją podziel komórki i policz liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru. Następnie wysiewaj ludzkie komórki wątrobiaka 7,5 w 35-milimetrowych szalkach w dwóch mililitrach kompletnego DMEM i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia należy przygotować kompleks lipidów transkrypcyjnych, rozcieńczając 10 mikrolitrów odczynnika do transfekcji w 50 mikrolitrach minimalnej pożywki niezbędnej i oddzielnie rozcieńczyć pięć mikrogramów transkryptów wirusowych w 50 mikrolitrach pożywki minimalnej pożywki.

Inkubować obie mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie wymieszaj je w jednej sterylnej probówce do mikrowirówek i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji komórek usuń pożywkę hodowlaną, umyj komórki dwukrotnie wstępnie podgrzanym 1X PBS i dodaj 1,5 mililitra minimalnej niezbędnej pożywki.

Powoli dodawaj kompleks i delikatnie obracaj naczyniem, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 10 godzin. Następnie usuń pożywkę.

Umyj transfekowane komórki dwukrotnie jednym mililitrem wstępnie podgrzanego 1X PBS i dodaj dwa mililitry kompletnego DMEM. Wyizoluj wirusowe RNA ze 140 mikrolitrów supernatantów hodowlanych za pomocą zestawu do izolacji wirusowego RNA. Przygotuj 10-mikrolitrową reakcję qRT-PCR przy użyciu komercyjnego zestawu qRT-PCR.

Użyj starterów do przodu i do tyłu oraz sondy do kwantyfikacji RNA HCV. Ustaw cykl reakcji na 48 stopni Celsjusza na 20 minut, 95 stopni Celsjusza na 10 minut i 45 cykli 95 stopni Celsjusza na 15 sekund i 60 stopni Celsjusza na jedną minutę. Przeprowadź reakcje i skonfiguruj kontrole negatywne.

Równolegle wygeneruj krzywą wzorcową, używając dziesięciokrotnie seryjnie rozcieńczonej znanej liczby kopii transkryptów HCV w celu ilościowego określenia wirusowego RNA. Wykonać w trzech egzemplarzach. Umieść 7,5 komórki ludzkiego wątrobiaka na 96-dołkowej płytce i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla około 16 godzin przed dodaniem wirusa.

W komorze klasy bezpieczeństwa biologicznego II należy wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia wirusa. Dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa na studzienkę, aby zainfekować komórki i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po trzech dniach umyj zainfekowane komórki trzykrotnie 0,1 mililitra PBS, a następnie utrwal i przeniknij komórki 0,1 mililitra lodowatego metanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Umyj studzienki trzykrotnie 1X PBS, a następnie 1X PBST. Po usunięciu PBST zablokuj komórki na 30 minut w temperaturze pokojowej za pomocą 0,1 mililitra 1% BSA zawierającego 0,2% odtłuszczonego mleka w PBST. Usuń roztwór blokujący i traktuj komórki przez pięć minut 0,1 mililitra 3% nadtlenku wodoru przygotowanego w 1X PBS.

Ponownie umyj ogniwa dwukrotnie 1X PBS i 1X PBST. Dodać 50 mikrolitrów przeciwciała monoklonalnego anty-NS5A 9E10 do dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Umyj studzienki trzykrotnie 1X PBS i raz PBST.

Dodać 50 mikrolitrów sprzężonej z HRP koziej anty-mysiej IgG na studzienkę, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć niezwiązane przeciwciało, przemywając studzienki 0,1 mililitra 1X PBS. Dodaj 30 mikrolitrów DAB i inkubuj płytkę, delikatnie kołysząc przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór DAB i umyj studzienki dwukrotnie 1X PBS i raz wodą destylowaną.

Dodaj 100 mikrolitrów PBS zawierającego 0,03% azydku sodu. Zbadaj każdą studzienkę pod mikroskopem światła odwróconego za pomocą obiektywu 10X. Policz liczbę dodatnich dołków.

Użyj kalkulatora Reeda i Muencha, aby oszacować rozcieńczenie punktu końcowego, które infekuje 50% studzienek. Rozpuścić pibrentaswir, inhibitor NS5A, w 100% DMSO do stężenia jednego milimola i dalej rozcieńczyć go w pełnym DMEM do stężenia 10 nanomolowych. Następnie zainfekuj naiwne komórki Huh-7,5 przy 70% zbiegu dawką wirusa ML50, aby zainfekować 50% komórek przez 12 godzin, a następnie przenieś zainfekowane komórki na sześciodołkowe płytki 24 godziny po zakażeniu.

Dodaj 1X EC50 PIB do zainfekowanych komórek po 16 godzinach od podziału komórek. Zrób to po każdym podziale komórki przez sześć kolejnych pasaży, po których następują trzy cykle pasażu wolnego od leku i monitoruj rozprzestrzenianie się wirusa za pomocą testu tworzącego ognisko. Zbieraj supernatanty wirusowe przy każdym przejściu i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Wyodrębnij wirusowe RNA z supernatantu w dniu 18 i zsyntetyzowane cDNA. Amplifikuj gen NS5A za pomocą pięciu mikrolitrów rozcieńczonego cDNA. Następnie określ mutacje oporności na leki NS5A w sześciu do ośmiu dodatnich plazmidach bakteryjnych za pomocą starterów sekwencjonowania NS5A.

Biblioteki mutantów pełnego genomu zsyntetyzowano przy użyciu klonalnego pJFH1 w ilościach zmniejszających się ze 100 do 10 nanogramów. Średnia wydajność produktów ep-PCR wahała się od 3,8 do 12,5 nanogramów na mikrolitr. Odsetek mutacji w zmutowanych bibliotekach wzrastał wraz ze zmniejszającym się wkładem pJFH1 w reakcji ep-PCR.

ML50 zsyntetyzowany przy użyciu 50 nanogramów matrycy miał cztery podstawienia na 10 000 skopiowanych par zasad, podczas gdy ML25 zsyntetyzowany przy użyciu 25 nanogramów matrycy zawierał dziewięć podstawień. W klonalnym pJFH1 nie stwierdzono podstawień w obrębie liczby sekwencjonowanych nukleotydów. Warianty wirusa ML50 były mniej podatne na pibrentaswir w porównaniu z klonalnym wirusem JFH1.

Spośród ośmiu klonów NS5A, cztery miały kombinację D7V+F28C, podczas gdy V8A+F28C i F36L występowały w jednym klonie. Mutacje te znajdowały się w regionie końca N NS5A, o którym wiadomo, że zawiera klinicznie istotne mutacje oporności na NS5A. Końcowe stężenie każdego składnika ep-PCR ma kluczowe znaczenie, zwłaszcza ilość matrycy.

Brak przedłużacza KB znacznie zmniejszy wydajność produktu ep-PCR.