Name: Izolacja komórek tętnic wewnątrzpłucnych i mięśni gładkich w celu zbadania odpowiedzi naczyniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Naucz się izolacji tętnic wewnątrzpłucnych i komórek mięśni gładkich szczura w celu badania odpowiedzi naczyniowych. Technika kąpieli organowej pozwala oceniać wpływ leków na fizjologię naczyń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Narodowej Radzie ds. Badań Naukowych Tajlandii, Centrum Doskonałości dla Innowacji w Chemii (PERCH-CIC) oraz Międzynarodowej Sieci Badawczej (IRN61W0005) za wsparcie finansowe, a także Wydziałowi Fizjologii Wydziału Nauk Medycznych Uniwersytetu Naresuan za wsparcie placówki badawczej.

Eksperymenty przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Naresuan (NUACUC), numer protokołu NU-AE620921, do opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych.
1. Skład roztworów fizjologicznych
<ol>
	<li>Roztwór Krebsa należy sformułować, rozpuszczając chemikalia w wodzie destylowanej, aby osiągnąć końcowe stężenia w następujący sposób: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4, 0,5 mM NaHPO4, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2 i 11 mM glukoza8. Doprowadzić pH roztworu do 7,3 za pomocą 1 M NaOH i podgrzać do 37 °C przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować zimny roztwór Krebsa, podobnie jak wspomniano w kroku 1.1, do użycia jako pożywka izolacyjna IPA, jak opisano w kroku 2.</li>
</ol>
2. Izolacja tętnicy wewnątrzpłucnej (IPA)
<ol>
	<li>Znieczulenie 8-tygodniowych samców szczurów rasy Wistar za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia tiopentalu sodu (100 mg/kg)9. Sprawdź szczury pod kątem ich reakcji na bolesne bodźce podczas głębokiego snu za pomocą kleszczy zaciśniętych na ich stopach, a następnie upewnij się, że szczury nie mają reakcji odciągania stopy przed eutanazją w kroku 2.2.</li>
	<li>Rozetnij nożyczkami środkową klatkę piersiową szczura i końcówkę serca (rozmiar 14 cm). Następnie zlokalizuj nasadę płuca nożyczkami (rozmiar 14 cm). Zbierz całe płuco, przecinając nożyczkami i zanurzając je w zimnym roztworze Krebsa10,11.</li>
	<li>Pokrój pojedynczy płat płuca nożyczkami (rozmiar 11 cm) i umieść na szalce Petriego (rozmiar 9 cm) tak aby przyśrodkowa strona/korzeń płuca był skierowany do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, B). Obserwuj i identyfikuj wyrównanie żyły, oskrzeli i tętnicy od góry do dołu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Rozciąć oskrzela wzdłuż nożyczkami (rozmiar 11 cm). Następnie użyj kleszczy (rozmiar 11 cm), aby chwycić czubek oskrzela. Delikatnie wypreparuj i usuń oskrzela i żyły z płuca. Należy pamiętać, że IPA jest zawsze anatomicznie wyrównany pod oskrzelami.</li>
	<li>Następnie można zwizualizować główny IPA (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Za pomocą kleszczy (rozmiar 11 cm) chwyć końcówkę IPA i ostrożnie wypreparuj ją z tkanki płucnej nożyczkami (rozmiar 11 cm).</li>
	<li>Trzymaj wyizolowany IPA w zimnym roztworze Krebsa, dopóki zestaw do kąpieli organowej nie zostanie ustawiony (pH 7,3 i temperatura 4 °C)11.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC)
<ol>
	<li>Wyizoluj IPA zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 2. Rozetnij główną gałąź IPA wzdłuż nożyczkami (rozmiar 11 cm) i pokrój w małe paski (2 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Zanurz paski IPA w pożywce dysocjacyjnej (DM)10,12 zawierające 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4, 0,5 mM NaH2PO4, 10 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,03 mM czerwień fenolowa, 10 mM tauryna, 0,5 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 11 mM glukozy i 0,16 mM CaCl2i dostosować pH do 7,0 za pomocą 1 M NaOH. Inkubować paski przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w suchej masie zawierającej 1 mg/ml papainy, 0,04% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,4 mM 1,4-ditiotreitolu (DTT), a następnie kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Dodać 1 mg/ml kolagenazy typu 1A w suchej masie i dalej inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min. 
	UWAGA: Cukrzyca jest roztworem stosowanym w celu zachowania żywotności komórek. Papaina i kolagenaza typu 1A to enzymy, które rozkładają białka macierzy zewnątrzkomórkowej w celu wyizolowania pojedynczych komórek. BSA jest białkiem albuminowym surowicy używanym do stabilizacji enzymów podczas przechowywania i reakcji enzymatycznych. DTT jest środkiem redukującym stosowanym w celu stabilizacji i promowania aktywności enzymów podczas procesu izolacji komórek. Tauryna to kwas aminosarkowy stosowany do stabilizacji błony komórkowej i integralności komórki.</li>
	<li>Przenieś tkanki do świeżego DM i rozprowadź przez delikatne rozcieranie za pomocą szklanej pipety Pasteura (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B). Kontynuuj rozcieranie, aż wyizolowane VSMC staną się widoczne w roztworze do kąpieli pod mikroskopem (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). 
	UWAGA: Świeżo wyizolowane VSMC mogą być używane do badania fizjologii/patofizjologii naczyń krwionośnych, wraz z różnymi badaniami eksperymentalnymi, takimi jak modulacja za pomocą środków farmakologicznych, analiza elektrofizjologiczna typu patch-clamp, obrazowanie wapnia itp. Jednak niniejsze badania koncentrują się wyłącznie na wazorelaksacji izolowanego IPA przy użyciu techniki kąpieli narządowej.</li>
</ol>
4. Technika kąpieli organowej
<ol>
	<li>Wyizoluj IPA zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 2. Przetnij główną gałąź IPA na pierścienie o długości ~2 mm (Rysunek 2D)13.</li>
	<li>Przymocuj pierścienie IPA do komór kąpieli organowej (Rysunek 4), nawlekając je na dwa druty ze stali nierdzewnej o średnicy 40 μm (Rysunek 2E)11,13,14.</li>
	<li>Przymocuj druty ze stali nierdzewnej zamontowane za pomocą pierścieni IPA do izometrycznych przetworników siły podłączonych do urządzenia do akwizycji danych i systemu komputerowego z zainstalowanym odpowiednim oprogramowaniem fizjologicznym do rejestracji i analizy danych, a następnie delikatnie zwiększ napięcie pierścienia IPA do 1 g11.</li>
	<li>Pozostawić segmenty naczynia do wyrównania przez około 45 minut przy napięciu spoczynkowym 1 g. W okresie równowagi należy upewnić się, że roztwór Krebsa jest regularnie wymieniany co 15 minut. Po tym okresie równowagi przetestuj żywotność naczyń, mierząc ich zwężenie naczyń krwionośnych do wysokiego zewnątrzkomórkowego roztworu K+ (80 mM) zawierającego 47,4 mM NaCl, 80 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM KH2PO4, 0,5 mM NaHPO4, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 i 11 mM glukozy10,11.</li>
	<li>Oceń obecność lub brak śródbłonka, obliczając odpowiedź relaksacyjną na acetylocholinę (1 x 10−5 M) w pierścieniach wstępnie skurczonych fenylefryną (PE, 1 x 10−5 M) (Należy zauważyć, że skurcze naczyń pozostają stabilne przez 1 godzinę po dodaniu PE). Rozważ pierścienie jako nienaruszone śródbłonek, jeśli określają ilościowo więcej niż 70% relaksacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A). Jeśli mają mniej niż 10% relaksacji, należy rozważyć pierścienie jako obnażone ze śródbłonka13 (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B). Mechanicznie usuń śródbłonek, delikatnie pocierając wnętrze naczynia małym drutem, aby wywołać denudację.</li>
	<li>Ponownie zrównoważyć pierścienie tętnicze przez 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentów testowych.</li>
</ol>
5. Reakcja naczyniorelaksacyjna na ekstrakt roślinny
<ol>
	<li>Zbadaj działanie rozkurczające ekstraktu roślinnego poprzez wstępne ściskanie pierścieni IPA z PE (1 x 10−5 M).</li>
	<li>Następnie ostrożnie dodaj ekstrakt roślinny (1-1,000 μg / ml) kumulatywnie do pierścieni nienaruszonych śródbłonka i pierścieni pozbawionych śródbłonka, aby wywołać wazorelaksację (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6A, B) i uzyskać krzywą odpowiedzi zależną od stężenia (<silna klasa = "xfig" >Figura 6C).</li>
	<li>Upewnij się, że działanie dimetylosulfotlenku (DMSO) stosowanego jako rozpuszczalnik jest również oceniane podobnie, aby służyło jako kontrola negatywna (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6C).</li>
</ol>
6. Mechanizm wazorelaksacji wywołanej ekstraktem roślinnym przez śródbłonek
<ol>
	<li>Oceń mechanizm działania ekstraktu roślinnego rozluźniającego naczynia krwionośne poprzez śródbłonkową syntazę tlenku azotu (eNOS), cyklooksygenazę (COX) < klasa sup = "xref">13 i szlaki czynnika hiperpolaryzacyjnego pochodzącego ze śródbłonka (EDHF) poprzez inkubację nienaruszonych śródbłonka pierścieni IPA przez 30 minut z następującymi inhibitorami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 7A): 1 x 10−4 M ester metylowy NG-nitro-L-argininy (L-NAME, inhibitor eNOS)9, 1 x 10−5 M indometacyna (inhibitor COX)9, lub kombinacja 1 x 10−7 M apaminy (mały bloker kanału potasowego aktywowany wapniem) i 1 x 10−7 M charybdotoksyny (bloker kanału potasowego aktywowany wapniem o średniej i dużej przewodności), przed wywołaniem skurczów IPA z 1 x 10−5 M PE.</li>
	<li>Następnie, po ustabilizowaniu się skurczów do PE, dodać skumulowane stężenia (0,1-1 000 μg/ml) ekstraktu roślinnego.</li>
	<li>Przedstaw efekty ekstraktu roślinnego jako procentowe rozluźnienie pierścieni IPA w obecności inhibitorów w porównaniu z odpowiedzią pierścieni IPA bez inhibitorów (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 7B-D) i skonstruuj krzywą stężenie-odpowiedź.</li>
</ol>
7. Mechanizm wazorelaksacji wywołanej ekstraktem roślinnym za pomocą kanałów K+ naczyń mięśni gładkich
<ol>
	<li>Wstępnie inkubuj pierścienie IPA obnażone śródbłonkiem przez 30 minut z 1 x 10−3 M 4-aminopirydyną (4-AP), blokerem kanału potasowego bramkowanego napięciem (KV) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 8A), 1 x 10−5 M glibenklamidu, blokera wrażliwego na ATP kanału potasowego (KATP) lub 1 x 10−7 M iberiotoksyny, blokera kanałów K + aktywowanych przez Ca2+ o dużej przewodności (KCa), przed wywołaniem skurczów IPA za pomocą 1 x 10−5 M PE.</li>
	<li>Następnie dodaj skumulowane stężenia ekstraktu roślinnego.</li>
	<li>Przedstaw efekty ekstraktu roślinnego jako procentowe rozluźnienie pierścieni IPA z inhibitorem w porównaniu z pierścieniami IPA bez inhibitora (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 8B-D) i skonstruuj krzywą stężenie-odpowiedź.</li>
</ol>
8. Mechanizm wazorelaksacji wywołanej ekstraktem roślinnym poprzez hamowanie zewnątrzkomórkowego napływu wapnia (Ca2+) do VSMC
<ol>
	<li>Wstępnie inkubować pierścienie IPA pozbawione śródbłonka przez 30 minut w roztworze Krebsa wolnym od Ca2+ zawierającym 1 mM kwasu glikolu etylenowego bis (eter 2-aminoetylowy)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 9A).</li>
	<li>Następnie zastąp roztwór do kąpieli roztworem Ca2+ free-80 mM K+ na 10 minut, aby zdepolaryzować VSMC, które następnie otwierają LZO (<silna klasa = "xfig">Rysunek 9A).</li>
	<li>Łącznie dodać CaCl2 (0,01-10 mM) w celu wywołania zwężenia naczyń krwionośnych IPA i skonstruować krzywą stężenie-odpowiedź (<silna klasa = "xfig">Rysunek 9A).</li>
	<li>Powtórz ten protokół w tych samych pierścieniach IPA, ale wstępnie inkubuj je z ekstraktem roślinnym lub 1 μM nikardypiną (bloker kanału Ca2 + typu L) w Ca2 + zawierającym 80 mM roztwór K + przez 10 minut, a następnie skumulowane dodawanie CaCl28.</li>
	<li>Na koniec porównaj reakcję skurczu z maksymalnym skurczem wywołanym wcześniej przez wyzwania kontrolne CaCl2 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 9B).</li>
</ol>
9. Mechanizm wazorelaksacji wywołanej ekstraktem roślinnym poprzez hamowanie wewnątrzkomórkowego uwalniania wapnia (Ca2+) z retikulum sarkoplazmatycznego (SR)
<ol>
	<li>Wystawić pierścienie IPA obnażone śródbłonkiem na działanie roztworu 80 mM K+ przez około 5 minut, depolaryzując VSMC, otwierając LZO i ostatecznie generując obciążenie Ca2+ do SR (<silna klasa = "xfig">Rysunek 10A).</li>
	<li>Zastąp roztwór do kąpieli na 10 minut roztworem Krebsa wolnym odCa2+ zawierającym 1 mM EGTA (<silna klasa="xfig">Rysunek 10A).</li>
	<li>Następnie rzuć wyzwanie pierścieniom IPA za pomocą 1 x 10−5 M PE, który aktywuje szlak fosfolipazy C / IP3, ostatecznie uwalniając Ca2+ z SR i wywołując przejściowy skurcz IPA (<silna klasa = "xfig">Figura 10A).</li>
	<li>Powtórz ten sam protokół, aby upewnić się, że podobnie występują przejściowe skurcze do PE.</li>
	<li>Ponownie przeprowokować pierścienie IPA roztworem 80 mM K+ przez około 5 minut, a następnie zastąpić roztwór do kąpieli roztworem Krebsa wolnym od Ca2+ zawierającym 1 mM EGTA z ekstraktem roślinnym lub bez niego przez 10 minut.</li>
	<li>Ponownie rzuć wyzwanie pierścieniom IPA za pomocą 1 x 10−5 M PE.</li>
	<li>Porównaj skurcze IPA wywołane przez PE między stanem z ekstraktem roślinnym i bez niego (<silna klasa="xfig">Ryc. 10B).</li>
</ol>
10. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wyraź wyniki jako średnią ± SEM. Porównaj te wartości za pomocą testu t Studenta lub przeanalizuj za pomocą analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post hoc Tukeya-Kramera przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Uznajmy, że różnice przy p < 0,05 są statystycznie istotne. Tutaj było n = 6 szczurów/protokół eksperymentalny. 
	UWAGA: Zapis zwężenia naczyń krwionośnych i wazorelaksacji można ocenić za pomocą odpowiedniego oprogramowania zainstalowanego na komputerze. Na przykład, Rysunek 5A pokazuje, że gdy naczynia krwionośne są stymulowane przez PE powodujący skurcz, można to zaobserwować na podstawie zwiększonego napięcia pierwotnego śledzenia. Śledzenie ustabilizuje się w ciągu 20-30 minut, co jest uważane za 100% skurcz. Następnie ACh stymuluje naczynia krwionośne, powodując odprężenie, które można było zaobserwować ze zmniejszonego napięcia pierwotnego śledzenia. W ten sposób zmniejszone napięcie jest obliczane jako procent w porównaniu ze 100% skurczem.</li>
</ol>

<ol><li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension%3A+Implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614(2017).</li>
<li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Clinics%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li>
<li>Ruan, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mini+Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li>
<li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension%3A+A+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li>
<li>Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li>
<li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling%3A+The+in+vivo+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li>
<li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li>
<li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Traditional+and+Complementary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li>
<li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243(2019).</li>
<li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167(2000).</li>
<li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2%2C+N4-disubstituted+quinazoline+2%2C+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281(2019).</li>
<li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent%2C+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li>
<li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li>
<li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym manuskrypcie opisujemy technikę izolacji szczurzych IPA i VSMC. Zastosowano kilka protokołów eksperymentalnych w celu zbadania odpowiedzi naczyniowej IPA in vitro, które można wykorzystać do scharakteryzowania efektu farmakologicznego i mechanistycznych podstaw wazorelaksacji IPA indukowanej przez ekstrakt roślinny.
Jeśli chodzi o zależne od śródbłonka działanie rozszerzające naczynia krwionośne ekstraktu roślinnego, zastosowano różne blokery, takie jak L-NAME (eNOS), indometacy...

Układ naczyniowy płuc to niskociśnieniowy układ naczyniowy, w którym główną funkcją jest dostarczanie odtlenionej krwi do obszaru wymiany gazów w płucach. Tętnice płucne w płucach są ułożone w gałęzie równoległe do drzewa oskrzelowego, ostatecznie tworząc rozległą sieć naczyń włosowatych, która jest ciągła przez kilka pęcherzyków płucnych i ostatecznie łączy się w żyłki i żyły. Napięcie naczyniowe tętnicy płucnej jest kontrolowane przez kilka czynników, w tym interakcję między śródbłonkiem a komórkami mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC)1.
W tym badaniu skupiamy się na zależnej od śródbłonka i -niezależnej wazorelaksacji tętnicy wewnątrzpłucnej (IPA). Jeśli chodzi o wazorelaksację zależną od śródbłonka, różne mechanizmy zachodzące na powierzchni komórek śródbłonka mogą zwiększać wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2+ (np. acetylocholina [ACh] wiąże się z receptorem muskarynowym [M3]), prowadząc do powstawania tlenku azotu (NO), prostacykliny (PGl2) i czynnika hiperpolaryzacyjnego pochodzącego ze śródbłonka (EDHF) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). NO jest głównym czynnikiem relaksacyjnym pochodzącym ze śródbłonka syntetyzowanym z L-argininy przez śródbłonkową syntazę tlenku azotu (eNOS) 2, który następnie dysocjuje z komórek śródbłonka do VSMC (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) i stymuluje rozpuszczalny enzym cyklazę guanylilu (sGC); enzym ten zmienia trifosforan guanozyny (GTP) w cykliczny monofosforan guanozyny (cGMP), który aktywuje kinazę białkową G (PKG) i obniża poziom cytozolowego Ca2+, powodując w ten sposób wazorelaksację (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). PGl2 jest syntetyzowany przez komórki śródbłonka za pośrednictwem szlaku cyklooksygenazy (COX)3,4. Wiąże się z receptorem prostacykliny (IP) na VSMC i stymuluje enzym cyklazę adenylową (AC), który następnie przekształca trifosforan adenozyny (ATP) w cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1)3,4. cAMP aktywuje kinazę białkową A (PKA), zmniejszając poziom cytozolowego Ca2+ i powodując wazorelaksację5 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Szlak EDHF uczestniczy również w zależnej od śródbłonka wazorelaksacji za pośrednictwem różnych mediatorów śródbłonka i zdarzeń elektrycznych. Aktywacja szlaku EDHF prowadzi do hiperpolaryzacji VSMC, zamykając w ten sposób kanały Ca2 + (LZOCC) sterowane napięciem, zmniejszając wewnątrzkomórkowe poziomy Ca2 + i indukując wazorelaksację 6. Niezależna od śródbłonka wazorelaksacja zachodzi bezpośrednio na VSMC poprzez kilka mechanizmów, takich jak obniżenie wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2 +, hamowanie kinazy łańcucha lekkiego miozyny (MLCK), aktywacja fosfatazy łańcucha lekkiego miozyny (MLCP) i zmniejszenie wrażliwości Ca2 + na maszynerię kurczliwą VSMC. W tym badaniu skupiamy się na wazorelaksacji spowodowanej otwarciem różnych kanałów K +, blokadą LZO i zahamowaniem uwalniania Ca2 + z retikulum sarkoplazmatycznego 7, co prowadzi do obniżenia wewnątrzkomórkowych poziomów Ca2 +, zmniejszając w ten sposób odpowiednio fosforylację łańcucha lekkiego miozyny VSMC i wiązanie miozyny z aktyną lub tworzenie mostka krzyżowego, ostatecznie prowadzi do wazorelaksacji.
Technika oceny pomiarów zwężenia i wazorelaksacji w izolowanym IPA jest dobrze znana dla gryzoni, ale dane różniły się w zależności od protokołów eksperymentalnych. W pracy opisano metodę zastosowaną do oceny reaktywności naczyniowej preparatów IPA dla szczurów in vitro, które zostały wykonane przy braku czynników zewnętrznych modulujących odpowiedź naczyniową in vivo, takich jak sygnały nerwowe, hormony, cytokiny, ciśnienie krwi itp.
Użyliśmy kilku eksperymentalnych protokołów, używając ekstraktu roślinnego jako przykładu do badania reaktywności naczyniowej IPA. Różne blokery (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) zostały wykorzystane do zidentyfikowania mechanizmów zależnej od śródbłonka i niezależnej wazorelaksacji indukowanej przez ekstrakt roślinny. Niemniej jednak te same protokoły można dostosować do oceny odpowiedzi naczyniowej IPA na wszelkie leki, ekstrakty lub fitochemikalia stosowane w leczeniu różnych patologii płuc.

<table><tbody><tr><td>1,4-ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632 NR CAS 348-12-3</td><td></td></tr><tr><td>4-aminopirydyna (4-AP)</td><td>Aldrich Chemical</td><td>A78403 Nr CAS 504-24-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetylocholina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625 Nr CAS 60-31-1</td><td></td></tr><tr><td>Apamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9459 Nr CAS 24345-16-2</td><td></td></tr><tr><td>Bydło albumina surowicy (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153 NR CAS 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Choryd wapnia</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA960 Nr CAS 1707055184</td><td></td></tr><tr><td>Charybdotoksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7802 NR CAS 95751-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891 NR CAS 9001-12-1</td><td>Z Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>D(+)- Monohydrat glukozy</td><td>Millipore Corporation</td><td>K50876942 924 NR CAS 14431-43-7</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 Nr CAS 67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas glikolu etylenowego bis (eteru 2-aminoetylowego)-N,N,N',N'--tetraoctowego (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889 NR CAS 67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 Nr CAS 60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze 11 cm.</td><td>Kleszcze dumoxelowe</td><td></td><td></td> nierdzewne</tr> <tr><td>14 cm.</td><td>Nierdzewny Dumoxel-Glibenclamide</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6039 NR CAS 16673-34-0</td><td></td></tr><tr><td>Program GraphPad</td><td>Prism Wersja oprogramowania 5.0 (San Diego, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375 Nr CAS 7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5904 Nr CAS 1002546960</td><td>rekombinant z Mesobuthus tamulus</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378 CAS NO. 53-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Labchart Program</td><td>Software wersja 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Ajax Finechem</td><td>296 NR CAS 1506254995</td><td></td></tr><tr><td>Samce szczurów Wistar</td><td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Tajlandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ester metylowy NG-nitro-L-argininy (L-NAZWA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5751 NR CAS 51298-62-5</td><td></td></tr><tr><td>Nikardypina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510 Nr CAS 54527-84-3</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel organowa 15 mL.</td><td>-</td><td></td> <td>Specjalne zamówienie badaczy</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4762 NR CAS 9001-73-4</td><td>OdPapaya Lateks</td></tr><tr><td>Fenal czerwony</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5530 Nr CAS 34487-61-1</td><td></td></tr><tr><td>Fenylefryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6126 NR CAS 61-76-7</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Kemaus</td><td>KA383 NR CAS. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Aldrich Chemical</td><td>EC231-913-4 Nr CAS 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>S+A2: E36chlorek odu</td><td>Kemaus</td><td>KA465 NR CAS 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki 11 cm.</td><td>Nożyczki do odłamków ze stali</td><td></td> nierdzewnej <td></td></tr><tr><td>14 cm.</td><td>Odłamek</td><td></td> Wodorowęglan sodu ze stali <td></td></tr> nierdzewnej <tr><td></td><td>Ajax Finechem</td><td>475 NR CAS 912466</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu</td><td>Aldrich Chemical</td><td>33,198-8 NR CAS 7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Ajax Finechem</td><td>482 NR CAS 1506196602</td><td></td></tr><tr><td>Tiopental sodu</td><td>Anesthal</td><td>JPN3010002 NR CAS 1C 314/47</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625 Nr CAS 107-35-7</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna WBU 45</td><td>Memmert</td><td>2766 NR CAS -</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek tętnic wewnątrzpłucnych i mięśni gładkich w celu zbadania odpowiedzi naczyniowych

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

Komórki tętnicy wewnątrzpłucnej (IPA) i naczyniowych mięśni gładkich (VSMC) wyizolowane z płuc szczura mogą być wykorzystane do badania mechanizmów leżących u podstaw zwężenia i wazorelaksacji. Po wyizolowaniu IPA i VSMC można ocenić charakterystykę odpowiedzi naczyniowych w stanach fizjologicznych i patologicznych przy braku czynników zewnętrznych, takich jak sygnały nerwowe, hormony, cytokiny itp. W związku z tym IPA i VSMC służą jako doskonałe modele do badania fizjologii/patofizjologii naczyń krwionośnych, wraz z różnymi badaniami eksperymentalnymi, takimi jak modulacja za pomocą środków farmakologicznych, analiza elektrofizjologiczna typu patch-clamp, obrazowanie wapnia itp. W tym przypadku zastosowaliśmy technikę izolowania IPA w celu zbadania reakcji naczyniowych w konfiguracji kąpieli narządowej. Segmenty IPA zamontowano w komorze kąpieli organowej za pomocą przewodów wewnątrzświetlnych i stymulowano różnymi środkami farmakologicznymi. Zmiany napięcia naczyniowego IPA (tj. zwężenie naczyń krwionośnych i wazorelaksacja) zarejestrowano za pomocą izometrycznego przetwornika siły i oprogramowania do analizy danych fizjologicznych. Wdrożyliśmy kilka protokołów eksperymentalnych, które można zaadaptować do badania mechanizmów wazorelaksacji/zwężenia naczyń krwionośnych do badania aktywności farmakologicznej leków fitochemicznych lub syntetycznych. Protokoły mogą być również wykorzystywane do oceny roli leków w modulowaniu różnych chorób, w tym tętniczego nadciśnienia płucnego. Model IPA pozwala na zbadanie krzywej stężenie-odpowiedź, która jest kluczowa w ocenie parametrów farmakodynamicznych leków.

Protokół w niniejszym badaniu został opracowany w celu określenia optymalnych warunków eksperymentalnych do pomiaru zjawisk fizjologicznych obserwowanych w odpowiedziach naczyniowych izolowanych preparatów IPA. Eksperymenty pilotażowe zostały przeprowadzone w celu opisania potencjalnych wyników, które pomagają w zrozumieniu efektów naczyniowych oraz podstaw mechanistycznych działania wazorelaksacyjnego ekstraktu roślinnego, w następujący sposób.
Efekt wazorelaksacyjny ekstraktu roślinn...

Reakcje naczyniowe tętniczego krążenia płucnego można badać za pomocą komórek tętnicy śródpłucnej (IPA) i komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC). W niniejszym badaniu szczegółowo opisano izolację IPA oraz protokoły stosowane do badania wazorelaksacji w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne.

Izolacja komórek tętnic wewnątrzpłucnych i mięśni gładkich w celu zbadania odpowiedzi naczyniowych

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Badanie to opisuje izolację komórek tętnicy śródpłucnej i naczyń mięśni gładkich szczura. Zastosowano kilka protokołów eksperymentalnych, takich jak wykorzystanie techniki kąpieli narządowej do zbadania odpowiedzi naczyniowej tętnicy śródpłucnej. Tętnice wewnątrzpłucne i komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych są doskonałymi modelami do badania fizjologii i patofizjologii naczyń.Adaptacje tej techniki mogą ocenić reakcje naczyniowe na dowolne leki, ekstrakty lub fitochemikalia. Zamontowanie izolowanego pierścienia tętnicy wewnątrzpłucnej w kąpieli narządowej umożliwia wykorzystanie izolowanych tętnic wewnątrzpłucnych do oceny roli leku w modulowaniu różnych chorób, w tym nadciśnienia płucnego. Protokoły eksperymentalne są technicznie wykonalne, ale kluczowe kroki są skomplikowane i niezbędne do osiągnięcia sukcesu, więc wizualna demonstracja ułatwia jej zrozumienie i śledzenie.Procedurę zademonstruje Kittiwoot To-on, student studiów magisterskich z fizjologii w Laboratorium Jednostki Badań Sercowo-Naczyniowych, Wydział Fizjologii Wydziału Nauk Medycznych Uniwersytetu Naresuan. Zacznij od przecięcia pojedynczego płata płuca 11-centymetrowymi nożyczkami i umieszczenia go na dziewięciocentymetrowej szalce Petriego przyśrodkową stroną lub korzeniem płuca skierowanym do góry. Obserwuj i identyfikuj wyrównanie żyły, oskrzeli i tętnicy od góry do dołu.Rozetnij oskrzela wzdłuż nożyczkami. Następnie użyj 11-centymetrowych kleszczy, aby chwycić czubek oskrzela. Delikatnie wypreparuj i usuń oskrzela i żyły z płuca.Użyj kleszczy, aby chwycić końcówkę tętnicy śródpłucnej i ostrożnie wypreparuj ją z tkanki płucnej nożyczkami. Izolowaną tętnicę wewnątrzpłucną należy przechowywać w zimnym roztworze Krebsa, dopóki nie zostanie ustawiony zespół do kąpieli narządów. Po odizolowaniu tętnicy wewnątrzpłucnej należy rozciąć główną gałąź tętnicy śródpłucnej wzdłużnie 11-centymetrowymi nożyczkami i pociąć w dwumilimetrowe paski.Zanurz paski tętnicy śródpłucnej w DM, a następnie inkubuj paski przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w DM zawierających jeden miligram na mililitr papainy, 0,04% BSA i 0,4 milimolowej naziemnej telewizji cyfrowej. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Dodaj jeden miligram na mililitr kolagenazy typu IA w DM i ponownie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Przenieść tkanki do świeżego DM i rozproszyć przez delikatne rozcieranie za pomocą szklanej pipety Pasteura. Kontynuuj rozcieranie, aż izolowane komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych staną się widoczne w roztworze do kąpieli pod mikroskopem. Wyizoluj tętnicę wewnątrzpłucną, jak pokazano wcześniej, i przetnij główną gałąź tętnicy śródpłucnej na pierścienie o długości około dwóch milimetrów.Zamocuj pierścienie tętnicy śródpłucnej w komorach kąpieli narządowej, nawlekając je na dwa druty ze stali nierdzewnej o średnicy 40 mikrometrów. Podłączyć przewody ze stali nierdzewnej zamontowane z pierścieniami tętnic śródpłucnych do izometrycznych przetworników siły podłączonych do urządzenia do akwizycji danych i systemu komputerowego z zainstalowanym odpowiednim oprogramowaniem fizjologicznym do rejestracji i analizy danych. Następnie delikatnie podnieś napięcie pierścienia tętnicy śródpłucnej do jednego grama.Pozwól segmentom naczynia zrównoważyć się przez około 45 minut przy napięciu spoczynkowym wynoszącym jeden gram. W okresie równowagi należy upewnić się, że roztwór Krebsa jest regularnie wymieniany co 15 minut. Po zrównoważeniu przetestuj żywotność naczyń, mierząc ich zwężenie naczyń krwionośnych do wysokiego zewnątrzkomórkowego roztworu potasu.Oceń obecność lub brak śródbłonka, obliczając odpowiedź relaksacyjną na acetylocholinę w pierścieniach wstępnie skurczonych z PE. Mechanicznie usuń śródbłonek, delikatnie pocierając wnętrze naczynia małym drutem, aby wywołać denudację. Następnie należy zrównoważyć pierścienie tętnicze przez 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentów testowych. Zbadaj działanie rozkurczające ekstraktu roślinnego poprzez wstępne skurczenie pierścieni tętnicy śródpłucnej z PE. Następnie ostrożnie dodaj łącznie 0,1 do 1000 mikrogramów na mililitr ekstraktu roślinnego do nienaruszonych pierścieni śródbłonka i pierścieni pozbawionych śródbłonka, aby wywołać wazorelaksację i uzyskać krzywą odpowiedzi zależną od stężenia.Należy upewnić się, że skuteczny DMSO stosowany jako rozpuszczalnik jest również oceniany w podobny sposób, aby służył jako kontrola ujemna. Oceń mechanizm działania ekstraktu roślinnego o działaniu rozluźniającym naczynia krwionośne, jak wspomniano w manuskrypcie tekstu. Następnie, po ustabilizowaniu się skurczów do PE, dodaj skumulowane stężenia ekstraktu roślinnego.Przedstaw działanie ekstraktu roślinnego jako procentowe rozluźnienie pierścieni tętnicy śródpłucnej w obecności inhibitorów w porównaniu z odpowiedzią pierścieni tętnic śródpłucnych bez inhibitorów i skonstruuj krzywą stężenie-odpowiedź. W nienaruszonej śródbłonku tętnicy wewnątrzpłucnej ekstrakt roślinny wywołał zależną od stężenia odpowiedź wazorelaksacji. Eradykacja śródbłonka głęboko zmniejszyła wazorelaksację indukowaną przez ekstrakt roślinny, co znalazło odzwierciedlenie we wzroście EC50 o 2,2 razy, hamowanie eNOS i EDHF ewidentnie zmniejszyło odpowiedź relaksacyjną naczyń krwionośnych na ekstrakt roślinny.Spowodowało to przesunięcie krzywej stężenie-odpowiedź w prawo i zwiększenie EC50 bez zmiany wartości E max. Wręcz przeciwnie, indometacyna nie wykazała wpływu na odpowiedź rozluźniającą naczynia krwionośne na ekstrakt roślinny. W pierścieniach tętnic wewnątrzpłucnych ogołoconych ze śródbłonka blokery kanału potasowego aktywowane wapniem zmniejszały odpowiedź naczyniorelaksacyjną na ekstrakt roślinny.Podczas gdy blokery kanałów potasowych bramkowanych napięciem lub wrażliwych na ATP nie wykazywały odchyleń. Preinkubacja z ekstraktem roślinnym hamowała skurcz wywołany chlorkiem wapnia. Pierścienie tętnic wewnątrzpłucnych obnażone śródbłonkiem, wstępnie inkubowane z bezwapniowym roztworem Krebsa i PE, powodowały przejściowy skurcz.W porównaniu z podłożem, ekstrakty roślinne znacznie zmniejszyły skurcz wywołany przez PE. Podczas zabiegu należy już na wczesnym etapie wyraźnie zidentyfikować żyłę, oskrzela i tętnicę. Przecięcie lub uszkodzenie tętnicy zmniejszy jej długość i wpłynie na reakcje naczyniowe. Technika ta może być zaadaptowana do badania związków, które mogą służyć jako prototypy w leczeniu chorób naczyń płucnych, takich jak tętnicze nadciśnienie płucne.

isolation-intrapulmonary-artery-smooth-muscle-cells-to-investigate

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Prezentujemy preparat do wizualizacji i manipulowania sygnalizacją wapniową w natywnym, nienaruszonym śródbłonku mikronaczyniowym. Śródbłonek świeżo wyizolowany z tętnic oporowych myszy zaopatrujących mięśnie szkieletowe zachowują morfologię in vivo i dynamiczną sygnalizację w sąsiednich komórkach i między nimi. Rurki śródbłonka można przygotować z mikronaczyń innych tkanek i narządów.

Izolacja śródbłonka mikronaczyniowego z tętnic oporowych myszy

Opracowaliśmy nowatorską i powtarzalną technikę izolowania pierwotnych kultur komórek mięśni gładkich tętnicy płucnej (PASMC) od myszy w wieku P7, umożliwiając tym samym lepsze badanie szlaków sygnałowych zaangażowanych w skurcz i rozluźnienie komórek mięśni gładkich noworodków.

Izolacja komórek mięśni gładkich tętnicy płucnej od nowonarodzonych myszy

Niedotlenienie naczyń płucnych (HPV) jest ważnym zjawiskiem fizjologicznym, dzięki któremu przy niedotlenieniu pęcherzyków płucnych perfuzja płuc jest dopasowana do wentylacji. Głównym segmentem naczyniowym przyczyniającym się do HPV jest tętnica wewnątrzgroniasta. W tym miejscu opisujemy nasz protokół analizy HPV mysich naczyń płucnych o średnicach 20-100 μm.

Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Patologia aorty może prowadzić do ciężkiej zachorowalności i śmiertelności, dlatego uzasadnione są badania nad progresją choroby i potencjalnymi terapiami. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji i wycięcia mysiej aorty, aby pomóc naukowcom w badaniu chorób sercowo-naczyniowych.

izolacja i wycięcie aorty mysiej; Wszechstronna technika w badaniu chorób sercowo-naczyniowych

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie technik izolacji i hodowli mysich pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z krążenia wieńcowego. Po wyizolowaniu VSMC można je stosować w wielu standardowych technikach hodowli.

Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Opisujemy izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca od myszy kontrolnych C57Bl/6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5. Opisujemy również badania rozszerzenia naczyń krwionośnych na izolowanych naczyniach od C57Bl / 6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5.

Rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze

Ten manuskrypt opisuje prosty protokół izolacji tętniczek od siatkówki szczura, który może być wykorzystany w badaniach elektrofizjologicznych, obrazowania wapnia i miografii ciśnieniowej.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Ten artykuł opisuje metodę opartą na hodowli eksplantatów do izolacji i hodowli pierwotnych, specyficznych dla pacjenta ludzkich komórek mięśni gładkich aorty i fibroblastów skóry. Ponadto przedstawiono nowatorską metodę pomiaru skurczu komórek i późniejszej analizy, która może być wykorzystana do badania specyficznych dla pacjenta różnic w tych komórkach.

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Obecny protokół opisuje ostrą izolację żywotnych komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłego, młodocianego, larwalnego i embrionalnego danio pręgowanego (Danio rerio), nadającego się do badań elektrofizjologicznych.

Izolacja komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłych, młodocianych, larwalnych i embrionalnych danio pręgowanego do badań elektrofizjologicznych

Obecny protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie precyzyjnie wyciętych plastrów płuc myszy do oceny kurczliwości dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic wewnątrzpłucnych w środowisku prawie in vivo.

Wykorzystanie precyzyjnie wyciętego wycinka płuc do badania regulacji skurczowej dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic śródpłucnych

Ten protokół demonstruje izolację pod kontrolą mikroskopii i barwienie immunofluorescencyjne mysich żył płucnych. Przygotowujemy próbki tkanek zawierających lewy przedsionek, żyły płucne i odpowiadające im płuca i wybarwiamy je pod kątem sercowej troponiny T i Connexin 43.

Mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych

Naucz się izolacji tętnic wewnątrzpłucnych i komórek mięśni gładkich szczura w celu badania odpowiedzi naczyniowych. Technika kąpieli organowej pozwala oceniać wpływ leków na fizjologię naczyń.

Izolacja komórek tętnic wewnątrzpłucnych i mięśni gładkich w celu zbadania odpowiedzi naczyniowych

Przeglądaj więcej filmów